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Chemistry

Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas Emparejada con La Vaporización Total De Microextracción En Fase Sólida Como Una Herramienta Forense

Published: May 25, 2021 doi: 10.3791/61880
* These authors contributed equally

Summary

La microextracción en fase sólida de vaporización total (TV-SPME) vaporiza completamente una muestra líquida mientras que los analitos se absorben en una fibra SPME. Esto permite la partición del analito entre sólo el vapor del disolvente y el recubrimiento de fibra SPME.

Abstract

Cromatografía de gases – Espectrometría de masas (GC-MS) es una técnica de uso frecuente para el análisis de numerosos analitos de interés forense, incluyendo sustancias controladas, líquidos inflamables y explosivos. GC-MS se puede acoplar con microextracción en fase sólida (SPME), en la que una fibra con un recubrimiento sorptivo se coloca en el espacio de la cabeza por encima de una muestra o se sumerge en una muestra líquida. Los analitos se absorben sobre la fibra que luego se coloca dentro de la entrada de GC calentada para la desorción. Total Vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME) utiliza la misma técnica que la inmersión SPME pero sumerge la fibra en un extracto de muestra completamente vaporizado. Esta vaporización completa da como resultado una partición entre solo la fase de vapor y la fibra SPME sin interferencias de una fase líquida o de cualquier material insoluble. Dependiendo del punto de ebullición del disolvente utilizado, TV-SPME permite grandes volúmenes de muestra (por ejemplo, hasta cientos de microlitros). La derivatización en fibra también se puede realizar usando TV-SPME. TV-SPME se ha utilizado para analizar fármacos y sus metabolitos en el cabello, la orina y la saliva. Esta técnica simple también se ha aplicado a drogas callejeras, lípidos, muestras de combustible, residuos explosivos post-explosión y contaminantes en el agua. Este trabajo destaca el uso de TV-SPME para identificar adulterantes ilegales en muestras muy pequeñas (cantidades de microlitro) de bebidas alcohólicas. El gamma-hydroxybutyrate (GHB) y la gamma-butyrolactone (GBL) fueron identificados en los niveles que serían encontrados en bebidas puntiagudas. La derivatización por un agente trimetilsililo permitió la conversión de la matriz acuosa y el GHB en sus derivados de TMS. En general, TV-SPME es rápido, fácil y no requiere preparación de la muestra aparte de colocar la muestra en un vial de espacio para la cabeza.

Introduction

La microextracción en fase sólida (SPME) es una técnica de muestreo en la que se coloca una muestra líquida o sólida en un vial de espacio de cabeza y una fibra SPME, recubierta con un material polimérico, se introduce en el espacio de cabeza de la muestra (o se sumerge en una muestra líquida). El analito sesorbe sobre la fibra y luego la fibra se coloca dentro de la entrada GC para la desorción1,2. La microextracción en fase sólida de vaporización total (TV-SPME) es una técnica similar a la SPME de inmersión, pero vaporiza completamente una muestra líquida antes de que los analitos se adsorban en la fibra. Esto permite la partición del analito entre sólo el vapor del disolvente y el recubrimiento de la fibra, lo que permite que más del analito sea adsorbido sobre la fibra y resultando en una buena sensibilidad3. Hay varias fibras SPME disponibles y la fibra debe elegirse en función del analito de interés, el disolvente /matriz y el agente de derivatización. Véase el Cuadro 1 para los analitos establecidos de TV-SPME.

muestra Analito(s) Fibra SPME recomendada Referencia(s)
Cabello humano Nicotina, cotinina Polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB), poliacrilato (PA) 3
Polvo sin humo Nitroglicerina, difenilamina Polidimetilsiloxano (PDMS), polietilenglicol (PEG) 7, 8
Combustible de carreras Metanol, nitrometano clavija 9
Agua Hidrocarburos aromáticos policíclicos PDMS 10
bebestibles ɣ-Ácido hidroxibutírico, ɣ-butirolactona PDMS Esta Obra
Polvo sólido Metanfetamina, anfetamina PDMS/DVB inédito

Tabla 1. Fibras SPME recomendadas con analitos TV-SPME establecidos.

Para realizar TV-SPME, los analitos se disuelven en un disolvente y una alícuota de esta mezcla se coloca en un vial de espacio para la cabeza. Las muestras no necesitan ser filtradas porque solo el solvente y los analitos volátiles se vaporizarán. Se deben utilizar volúmenes específicos de muestras líquidas para garantizar la vaporización total de la muestra. Estos volúmenes se determinan utilizando la Ley del Gas Ideal para calcular el número de moles de un disolvente multiplicado por el volumen molar del líquido (Ecuación 1).
Equation 1 Ecuación 1

donde Vo es el volumen de la muestra (mL), P es la presión de vapor del disolvente (bar), Vv es el volumen del vial (L), R es la constante de gas ideal (0.083145 Equation 1 ), M es la masa molar del disolvente (g/mol), T es la temperatura (K), y Equation 5 es la densidad del disolvente (g/mL). 3.

Para utilizar la presión de vapor correcta, se utiliza la ecuación de Antoine (Ecuación 2) para explicar la influencia de la temperatura:4
Equation 2 Ecuación 2

donde T es la temperatura y A, B y C son las constantes de Antoine para el disolvente. La ecuación 2 puede ser sustituida por la ecuación 1, produciendo:
Equation 3 Ecuación 3

La ecuación 3 da el volumen de la muestra (Vo) que puede ser completamente vaporizado en función de la temperatura y el disolvente utilizado.

Para realizar la derivatización con TV-SPME, la fibra SPME se expone primero a un vial que contiene el agente de derivatización durante un período de tiempo predeterminado dependiendo del analito. La fibra SPME se expone entonces a un nuevo vial que contiene el analito de interés. Este vial se calienta dentro de un agitador calentado. El analito se adsorbe entonces sobre la fibra con el agente de derivatización. La derivatización del analito y/o la matriz tiene lugar en la fibra antes de ser insertada en la entrada gc para la desorción. La Figura 1 muestra una representación del proceso TV-SPME con derivatización.

Figure 1
Figura 1: Representación del proceso TV-SPME con derivatización. La fibra SPME entra primero en el vial de derivatización donde el agente de derivatización (círculos amarillos) sesorbe sobre la fibra. La fibra se introduce en la muestra (círculos azules) y se calienta. La formación del derivado (círculos verdes) tiene lugar en la fibra durante el tiempo de extracción. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

TV-SPME es beneficioso porque permite que el analito se derivetized durante el proceso de extracción que reduce el tiempo de análisis. Otros métodos, como la inyección de líquido, requieren que el analito reaccione con el agente derivatizante en solución antes de ser inyectado en el GC. TV-SPME también requiere poca o ninguna preparación de la muestra. Una matriz que contiene un analito se puede colocar directamente en el vial del espacio de la cabeza y analizarse. Muchos compuestos de interés son compatibles con TV-SPME. Los compuestos deben ser solubles en un disolvente y lo suficientemente volátiles como para permitir la vaporización. Además, los compuestos deben ser térmicamente estables para ser analizados por GC-MS. TV-SPME se ha utilizado para analizar fármacos y metabolitos de fármacos, combustibles de carreras, hidrocarburos aromáticos policíclicos y materiales explosivos3,5,6,7,8,9,10.

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Protocol

1. Preparación general de muestras de TV-SPME y análisis GC-MS

NOTA: Si la muestra ya está disuelta en una matriz, vaya al paso 1.2.

  1. Extraiga o disuelva la muestra sólida en suficiente disolvente (agua, metanol, acetona, etc.) para alcanzar la concentración deseada. Las muestras líquidas se pueden utilizar "tal cual".
    NOTA: La cantidad de muestra sólida utilizada depende de la concentración deseada de la muestra. Se recomiendan concentraciones inferiores a 1 ppm (p/v) para evitar sobrecargar la columna GC. El analito debe ser soluble en el disolvente orgánico elegido.
    1. Asegúrese de que la muestra se ha disuelto por completo.
  2. Calcule el volumen necesario para vaporizar completamente la muestra utilizando la Ecuación 3 a la temperatura elegida. Por ejemplo, si el experimento se va a realizar a 60 °C, calcule el volumen necesario para vaporizar completamente el disolvente a 60 °C.
    1. Transfiera este volumen de muestra a un vial de espacio en la cabeza y asegure la tapa. Los métodos aceptables para transferir muestras líquidas a escala de microlitro incluyen manualmente a través de una jeringa de vidrio, una jeringa de vidrio electrónico o un robot automuestreador capaz de transferir líquidos para la preparación de muestras.
  3. Si derivatiza la muestra, prepare el agente de derivatización adecuado colocando ~1 mL del agente en un vial de espacio en la cabeza.
    1. Elija el agente de derivatización en función del tipo de derivatización necesaria: alquilación, acilación o siliberación. En este caso, el agente de derivatización recomendado para los grupos funcionales de ácido carboxílico y alcohol que se encuentran en el GHB es O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA). El agente de derivatización puede utilizarse "tal cual" y no requiere dilución. Un mL de agente de derivatización es suficiente para asegurar la saturación completa de la fibra SPME.
      PRECAUCIÓN: Los agentes de derivatización son tóxicos y deben manipularse en una campana extractora de humos.
  4. Establezca la temperatura de incubación/extracción adecuada en función del cálculo del paso 1.2. Esta temperatura asegura la vaporización total, la extracción suficiente de la muestra y la derivatización completa (si es necesario).
    1. Seleccione los parámetros GC-MS (programa de temperatura del horno, caudal, temperatura de entrada, etc.) en función de la clase de compuesto(s) de interés. Consulte el paso 3 para obtener un conjunto de parámetros de ejemplo.
    2. Asegúrese de que el revestimiento de entrada adecuado (por ejemplo, 2 mm de diámetro interior o menos) está en la entrada GC.
  5. Asegúrese de que la fibra SPME ha sido correctamente acondicionado y está en buenas condiciones de trabajo antes de comenzar el análisis.
    1. Varíe los parámetros de acondicionamiento según el tipo de fibra SPME que se esté utilizando. Consulte las instrucciones de fibra SPME para obtener la temperatura y el tiempo de acondicionamiento adecuados. En general, el análisis de varios espacios en blanco de fibra SPME hasta que sean reproducibles es suficiente para caracterizar una fibra SPME como totalmente condicionada.

2. Gamma-hidroxibutirato (GHB) y gamma-butirolactona (GBL) preparación de muestras

  1. Preparar una muestra de GHB y/o GBL en agua con una concentración inferior a 1 ppm.
  2. Transferir 1 μL de esta muestra a un vial de 20 ml de espacio de cabeza utilizando uno de los métodos descritos en el punto 1.2.1.
    1. Tenga en cuenta que el análisis de muestras acuosas requiere los volúmenes de muestra más bajos. Por ejemplo, un μL de agua se vaporizará completamente en un vial de espacio de cabeza de 20 ml a 60 °C.
    2. Tapar el vial inmediatamente.
  3. Coloque ~ 1 mL de BSTFA + 1% de trimetilclorosilano (TMCS) en un vial y tapa separados de 20 ml de espacio de cabeza.
    Nota: GBL no derivatize. Un paso de derivatización todavía se requiere, sin embargo, es asegurar que el disolvente de agua derivatiza y no interfiere con la muestra.
    PRECAUCIÓN: BSTFA es tóxico y debe manipularse en una campana extractora de humos.

3. Parámetros de GC-MS y configuración para GHB y GBL en agua

  1. Cree un método utilizando los siguientes parámetros GC-MS:
    Temperatura inicial del horno: 60 °C mantenido durante 1 minuto.
    Programa horno: 15 °C/minuto.
    Temperatura final del horno: 280 °C, mantenido durante 1 minuto.
    Caudal: 2,5 mL/minuto (caudal optimizado en velocidad para una columna de 0,25 mm i.d.).
    Temperatura de entrada: 250 °C.
    Temperatura de la línea de transferencia: 280 °C.
  2. Asegúrese de que se haya colocado un revestimiento de entrada SPME estrecho (2 mm i.d. o menos) dentro de la entrada GC.
  3. Asegúrese de que la fibra PDMS/DVB SPME se haya acondicionado correctamente y esté en buen estado de funcionamiento antes del análisis.
    NOTA: Las fibras PDMS/DVB SPME deben acondicionarse en la entrada GC a 250 °C durante 30 minutos. Las fibras PDMS/DVB SPME deben ser de un color blanquecino.
  4. Ejecute el GC-MS en el ejemplo.

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Representative Results

Un estudio del volumen de GBL fue realizado para demostrar la sensibilidad de TV-SPME comparado al espacio principal y a la inmersión SPME. Se preparó una muestra de 100ppmv de GBL en agua y se colocó en viales de espacio de cabeza de 20 ml con volúmenes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 y 10,000 μL. La relación de fase de las muestras permitió TV-SPME (1-3 μL), Headspace SPME (10 – 3.000 μL) y Immersion SPME (10.000 μL). Todas las muestras se analizaron por triplicado y el área de pico promedio se graficaron contra el volumen de la muestra. En general, los volúmenes de muestra que permitieron TV-SPME demostraron más sensibilidad que el espacio de cabeza o la SPME de inmersión para GBL en agua, como se muestra en la Figura 2. En la Figura 3se muestra una comparación de los cromatogramas para cada método.

Figure 2
Figura 2: Gráfico del área pico promedio versus el volumen de muestra para GBL en agua. Se realizó un estudio de volumen de GBL para demostrar la eficacia de TV-SPME en comparación con el espacio en la cabeza y la inmersión SPME. Se preparó una muestra de 100ppmv de GBL en agua y se colocó en viales de espacio de cabeza de 20 ml con volúmenes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, & 10000 μL. Todas las muestras se analizaron por triplicado y las barras de error corresponden a la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Cromatogramas iónicos totales para GBL en agua. (100 ppm) para 3 μL (azul), 300 μL (rojo) y 10.000 μL (verde). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Las muestras realistas de vino con pinchos con una dosis efectiva de GHB y GBL se muestran en la Figura 4 y la Figura 5,respectivamente. Estas muestras también muestran la interconversión de GBL y GHB. Cuando TV-SPME se realiza correctamente, se producirá un pico agudo y abundante, como se muestra en la Figura 6. TV-SPME tiene una buena sensibilidad y, por lo tanto, se deben utilizar concentraciones adecuadas para no sobrecargar la columna. Cuando las altas concentraciones están presentes, la asimetría máxima resultará como se muestra en la Figura 5 y la Figura 7. En estos casos, diluir la muestra o usar una inyección dividida puede mejorar la forma del pico.

Figure 4
Figura 4: Muestra realista de GHB en vino con una concentración de 8 mg/mL. Picos: 1) GBL, 2) ácido hexanoico-TMS, 3) GHB-TMS2,4) ácido benzoico-TMS, 5) ácido octanoico-TMS, 6) glicerol-TMS3,* denota un siloxano cíclico (fibra/sangrado de columna). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Muestra realista de GBL en vino con una concentración de 10 mg/mL. Picos: 1) GBL, 2) ácido hexanoico-TMS, 3) siloxano, 4) trimetil (2-feniletoxi) silano, 5) GHB-TMS2. TIC muestra GBL convirtiendo a GHB. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Cromatograma iónico total para GBL en agua con una concentración de 0,1 ppm. Resultados siguiendo el método TV-SPME descrito previamente para gbl en agua. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Cromatograma iónico total para GBL en agua con una concentración de 10 ppm. Resultados siguiendo el método TV-SPME descrito previamente para gbl en agua. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Al derivatizar, el analista debe asegurarse de que el método permite que los analitos se deriven completamente antes de ser desorbidos en el GC. La derivatización parcial puede dar lugar a un pico que representa el analito derivatizado y un pico que representa el analito subivatizado. La derivatización parcial también resultará en una menor sensibilidad para el analito, ya que menos de él puede adsorberse en la fibra.

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Discussion

TV-SPME tiene algunos beneficios sobre la inyección de líquido GC en que los tamaños de muestra grandes (por ejemplo, 100 μL) se pueden utilizar sin modificaciones del instrumento. TV-SPME también tiene algunos de los mismos beneficios que el espacio de cabeza SPME. Headspace SPME no requiere ninguna extracción o filtración porque cualquier compuesto no volátil permanecerá en el vial de headspace y no se adsorberá en la fibra, produciendo una muestra limpia. Este método también ayuda a eliminar los efectos de la matriz debido a que se trata de un sistema de dos fases (espacio de cabeza y fibra) en lugar de un sistema trifásico (muestra, espacio de cabeza y fibra) como spme de espacio de cabeza estándar. TV-SPME es como spme de inmersión en que la inmersión SPME es también un sistema de dos fases. Con spme de inmersión, una fibra se sumerge en una muestra líquida (típicamente acuosa) que contiene el analito en lugar de extraer el analito de su vapor. TV-SPME difiere de la inmersión SPME porque la inmersión SPME requiere una matriz polar /acuosa con el fin de generar suficiente fuerza impulsora para que los analitos salgan de la fase de solución y absorban el recubrimiento de fibra. Además, spme de inmersión requiere volúmenes de muestra mucho más grandes (por ejemplo, mL).

Muchos solventes se pueden utilizar con TV-SPME incluyendo metanol, acetona, agua, y acetonitrilo. Las fibras SPME no deben estar expuestas o sumergidas en cloroformo, ya que estos disolventes pueden dañar el recubrimiento de fibra. Veinte viales de espacio de cabeza de vidrio de tapa de tornillo mL se han encontrado para tener el mejor rendimiento con los métodos tv-SPME. Se recomienda utilizar un muestreador automático con TV-SPME. Si bien muchos parámetros del método TV-SPME se pueden ajustar según se desee, se debe utilizar el volumen y la temperatura de extracción adecuados para cada disolvente. El volumen de la muestra y la temperatura de extracción son proporcionales entre sí y deben ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, la temperatura de extracción de un método puede reducirse, pero también se debe reducir el volumen de la muestra. Este volumen se puede encontrar ajustando la ecuación 3.

Se podrán realizar modificaciones en el procedimiento de derivatización. La derivatización puede realizarse antes o después de la extracción, a temperatura ambiente o calentada en el agitador, exponiendo la fibra al vapor del agente de derivatización o por inmersión directa de la fibra en el agente de derivatización.

Existen limitaciones al método TV-SPME, incluida la necesidad de que los compuestos sean solubles, térmicamente estables y volátiles. TV-SPME requiere costosas fibras SPME que pueden tener su recubrimiento despojado o roto durante el análisis. Estas limitaciones se ven compensadas por beneficios como grandes volúmenes de muestra en relación con los volúmenes de inyección de GC típicos, alta sensibilidad y sin necesidad de filtración. TV-SPME se prefiere a spme headspace porque más de la muestra se extrae en la fibra y se reducen los efectos de la matriz. TV-SPME también se prefiere a la inmersión SPME porque la inmersión SPME consume mucha más muestra que TV-SPME. TV-SPME permite la derivatización durante el proceso de extracción, lo que reduce el tiempo de análisis en comparación con métodos como la inyección de líquidos que requieren que el analito se derivetice antes de la inyección. TV-SPME también requiere poca o ninguna preparación de la muestra. TV-SPME es simple, eficiente y sensible para el análisis de una amplia variedad de muestras, incluyendo drogas, materiales explosivos y combustibles de carreras.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Justicia (Premio No. 2015-DN-BX-K058 & 2018-75-CX-0035). Las opiniones, hallazgos y conclusiones expresados aquí son los del autor y no reflejan necesariamente los de las organizaciones de financiación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL Syringe Gerstel 100111-014-00
BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM) Regis Technologies Inc. 50442882
eVol XR Sample Dispensing System Kit ThermoFisher Scientific 66002-024
Equation 6-Butyrolactone (GBL) Sigma-Aldrich B103608-26G
Equation 7-Hydroxy Butyric Acid (GHB) Cayman Chemicals 9002506
Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm Restek 23083
Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm Restek 23091
Optima water for HPLC Fisher Chemical W71
SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) Supelco 57341-U
SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB) Supelco 57293-U
Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner Restek 23313

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References

  1. Pawliszyn, J. B. Method and Device for Solid Phase Microextraction and Desorption. United States patent. , (2005).
  2. Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , John Wiley & Sons. (1997).
  3. Rainey, C. L., Bors, D. E., Goodpaster, J. V. Design and optimization of a total vaporization technique coupled to solid-phase microextraction. Analytical Chemistry. 86 (22), 11319-11325 (2014).
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  7. Sauzier, G., Bors, D., Ash, J., Goodpaster, J. V., Lewis, S. W. Optimisation of recovery protocols for double-base smokeless powder residues analysed by total vaporisation (TV) SPME/GC-MS. Talanta. 158, 368-374 (2016).
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  9. Bors, D., Goodpaster, J. Chemical analysis of racing fuels using total vaporization and gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). Analytical Methods. 8 (19), 3899-3902 (2016).
  10. Beiranvand, M., Ghiasvand, A. Design and optimization of the VA-TV-SPME method for ultrasensitive determination of the PAHs in polluted water. Talanta. 212, 120809 (2020).

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Química Número 171 GC-MS vaporización total SPME sustancias controladas GHB GBL
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Davis, K. E., Goodpaster, J. V. GasMore

Davis, K. E., Goodpaster, J. V. Gas Chromatography-Mass Spectrometry Paired with Total Vaporization Solid-Phase Microextraction as a Forensic Tool. J. Vis. Exp. (171), e61880, doi:10.3791/61880 (2021).

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