Summary
La microextraction en phase solide de vaporisation totale (TV-SPME) vaporise complètement un échantillon liquide tandis que les analytes sont sorbés sur une fibre SPME. Cela permet de cloisonner l’analyte entre uniquement la vapeur de solvant et le revêtement de fibre SPME.
Abstract
Chromatographie en phase gazeuse – Spectrométrie de masse (GC-MS) est une technique fréquemment utilisée pour l’analyse de nombreux analytes d’intérêt médico-légal, y compris les substances contrôlées, les liquides inflammables et les explosifs. La GC-MS peut être couplée à la microextraction en phase solide (SPME), dans laquelle une fibre avec un revêtement sorptif est placée dans l’espace libre au-dessus d’un échantillon ou immergée dans un échantillon liquide. Les analytes sont sorbés sur la fibre qui est ensuite placée à l’intérieur de l’entrée gc chauffée pour la désorption. La vaporisation totale de la microextraction en phase solide (TV-SPME) utilise la même technique que le SPME d’immersion, mais immerge la fibre dans un extrait d’échantillon complètement vaporisé. Cette vaporisation complète se traduit par une partition entre uniquement la phase vapeur et la fibre SPME sans interférence d’une phase liquide ou de tout matériau insoluble. Selon le point d’ébullition du solvant utilisé, le TV-SPME permet d’obtenir de grands volumes d’échantillons (p. ex., jusqu’à des centaines de microlitres). La dérivation sur fibre peut également être effectuée à l’aide de TV-SPME. TV-SPME a été utilisé pour analyser les médicaments et leurs métabolites dans les cheveux, urine, et la salive. Cette technique simple a également été appliquée aux drogues de rue, aux lipides, aux échantillons de carburant, aux résidus explosifs post-explosion et aux polluants dans l’eau. Cet article met en évidence l’utilisation de TV-SPME pour identifier les adultérants illégaux dans de très petits échantillons (quantités de microlitres) de boissons alcoolisées. Le gamma-hydroxybutyrate (GHB) et le gamma-butyrolactone (GBL) ont été identifiés à des niveaux qui seraient trouvés dans les boissons enrichies. La dérivation par un agent triméthylsilyle a permis de convertir la matrice aqueuse et le GHB en leurs dérivés tms. Dans l’ensemble, TV-SPME est rapide, facile et ne nécessite aucune préparation d’échantillon en dehors de placer l’échantillon dans un flacon d’espace de tête.
Introduction
La microextraction en phase solide (SPME) est une technique d’échantillonnage dans laquelle un échantillon liquide ou solide est placé dans un flacon d’espace libre et une fibre SPME, recouverte d’un matériau polymère, est ensuite introduite dans l’espace de tête de l’échantillon (ou immergée dans un échantillon liquide). L’analyte est sorbé sur la fibre puis la fibre est placée à l’intérieur de l’entrée GC pour la désorption1,2. La vaporisation totale de la microextraction en phase solide (TV-SPME) est une technique similaire à celle du SPME d’immersion, mais vaporise complètement un échantillon liquide avant que les analytes ne soient adsorbés sur la fibre. Cela permet de cloisonner l’analyte entre uniquement la vapeur de solvant et le revêtement de la fibre, permettant à une plus grande partie de l’analyte d’être adsorbée sur la fibre et résultant en une bonne sensibilité3. Il existe diverses fibres SPME disponibles et la fibre doit être choisie en fonction de l’analyte d’intérêt, du solvant / matrice et de l’agent de dérivation. Voir le tableau 1 pour les analytes TV-SPME établis.
| échantillon | Analyte(s) | Fibre SPME recommandée | Référence(s) |
| Cheveux humains | Nicotine, cotinine | Polydiméthylsiloxane/divinylbenzène (PDMS/DVB), polyacrylate (PA) | 3 |
| Poudre sans fumée | Nitroglycérine, diphénylamine | Polydiméthylsiloxane (PDMS), polyéthylène glycol (PEG) | 7, 8 |
| Carburant de course | Méthanol, nitrométhane | cheville | 9 |
| Eau | Hydrocarbures aromatiques polycycliques | PDMS | 10 |
| Boissons | Acide ɣ-hydroxybutyrique, ɣ-butyrolactone | PDMS | Ce travail |
| Poudre solide | Méthamphétamine, amphétamine | PDMS/DVB | inédit |
Tableau 1. Fibres de SPME recommandées avec des analytes établis de TV-SPME.
Pour réaliser le TV-SPME, les analytes sont dissous dans un solvant et une partie aliquote de ce mélange est placée dans un flacon d’espace libre. Les échantillons n’ont pas besoin d’être filtrés car seuls le solvant et les analytes volatils vont se vaporiser. Des volumes spécifiques d’échantillons liquides doivent être utilisés pour assurer la vaporisation totale de l’échantillon. Ces volumes sont déterminés à l’aide de la loi du gaz idéal pour calculer le nombre de moles d’un solvant multiplié par le volume molaire du liquide (équation 1).
Équation 1
où Vo est le volume de l’échantillon (mL), P est la pression de vapeur du solvant (bar), Vv est le volume du flacon (L), R est la constante de gaz idéal (0,083145), 
M est la masse molaire du solvant (g/mol), T est la température (K) et 
est la densité du solvant (g/mL). 3
Afin d’utiliser la pression de vapeur correcte, l’équation d’Antoine (équation 2) est utilisée pour tenir compte de l’influence de la température:4
Équation 2
où T est la température et A, B et C sont les constantes d’Antoine pour le solvant. L’équation 2 peut être substituée à l’équation 1, donnant:
Équation 3
L’équation 3 donne le volume de l’échantillon (Vo)qui peut être complètement vaporisé en fonction de la température et du solvant utilisés.
Pour effectuer la dérivatisation avec TV-SPME, la fibre SPME est d’abord exposée à un flacon contenant l’agent de dérivatisation pendant une durée prédéterminée en fonction de l’analyte. La fibre SPME est ensuite exposée à un nouveau flacon contenant l’analyte d’intérêt. Ce flacon est chauffé à l’intérieur d’un agitateur chauffé. L’analyte est ensuite adsorbé sur la fibre avec l’agent de dérivation. La dérivatisation de l’analyte et/ou de la matrice a lieu sur la fibre avant d’être insérée dans l’entrée GC pour la désorption. La figure 1 montre une représentation du processus TV-SPME avec dérivation.
Figure 1 : Représentation du procédé TV-SPME avec dérivation. La fibre SPME pénètre d’abord dans le flacon de dérivation où l’agent de dérivatisation (cercles jaunes) sorbe sur la fibre. La fibre est ensuite introduite dans l’échantillon (cercles bleus) et chauffée. La formation de la dérivée (cercles verts) a lieu sur la fibre pendant le temps d’extraction. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
TV-SPME est bénéfique car il permet de dérivation de l’analyte pendant le processus d’extraction, ce qui réduit le temps d’analyse. D’autres méthodes, telles que l’injection de liquide, exigent que l’analyte réagisse avec l’agent dérivateur en solution avant d’être injecté dans le GC. TV-SPME nécessite également peu ou pas de préparation d’échantillon. Une matrice contenant un analyte peut être placée directement dans le flacon de l’espace libre et analysée. De nombreux composés d’intérêt sont compatibles avec TV-SPME. Les composés doivent être solubles dans un solvant et suffisamment volatils pour permettre la vaporisation. De plus, les composés doivent être thermiquement stables pour être analysés par GC-MS. TV-SPME a été utilisé pour analyser des médicaments et des métabolites de médicaments, des carburants de course, des hydrocarbures aromatiques polycycliques et des matériaux explosifs3,5,6,7,8,9,10.
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Protocol
1. Préparation générale de l’échantillon TV-SPME et analyse GC-MS
Remarque : Si l’échantillon est déjà dissous dans une matrice, passez à l’étape 1.2.
- Extraire ou dissoudre l’échantillon solide dans suffisamment de solvant (eau, méthanol, acétone, etc.) pour atteindre la concentration souhaitée. Les échantillons liquides peuvent être utilisés « tels tels que ».
NOTA : La quantité d’échantillon solide utilisée dépend de la concentration souhaitée de l’échantillon. Des concentrations inférieures à 1 ppm (p/v) sont recommandées pour éviter de surcharger la colonne GC. L’analyte doit être soluble dans le solvant organique choisi.- Assurez-vous que l’échantillon est complètement dissous.
- Calculer le volume nécessaire pour vaporiser complètement l’échantillon à l’aide de l’équation 3 à la température choisie. Par exemple, si l’expérience doit être effectuée à 60 °C, calculer le volume nécessaire pour vaporiser complètement le solvant à 60 °C.
- Transférez ce volume d’échantillon dans un flacon d’espace de tête et fixez le capuchon. Les méthodes acceptables pour transférer des échantillons liquides à l’échelle de la microlitre comprennent manuellement via une seringue en verre, une seringue en verre électronique ou un robot d’échantillonnage automatique capable de transférer des liquides pour la préparation des échantillons.
- Si vous dérivatez l’échantillon, préparez l’agent de dérivation approprié en plaçant environ 1 mL de l’agent dans un flacon d’espace libre.
- Choisissez l’agent de dérivation en fonction du type de dérivation nécessaire : alkylation, acylation ou silyation. Dans ce cas, l’agent de dérivatisation recommandé pour les groupes fonctionnels acide carboxylique et alcool présents sur le GHB est le trifluoroacétamide O-bis(triméthylsilyl) (BSTFA). L’agent de dérivation peut être utilisé « tel quel » et ne nécessite pas de dilution. Un mL d’agent de dérivation suffit pour assurer la saturation complète de la fibre SPME.
ATTENTION: Les agents de dérivation sont toxiques et doivent être manipulés dans une hotte.
- Choisissez l’agent de dérivation en fonction du type de dérivation nécessaire : alkylation, acylation ou silyation. Dans ce cas, l’agent de dérivatisation recommandé pour les groupes fonctionnels acide carboxylique et alcool présents sur le GHB est le trifluoroacétamide O-bis(triméthylsilyl) (BSTFA). L’agent de dérivation peut être utilisé « tel quel » et ne nécessite pas de dilution. Un mL d’agent de dérivation suffit pour assurer la saturation complète de la fibre SPME.
- Définissez la température d’incubation/d’extraction appropriée en fonction du calcul de l’étape 1.2. Cette température assure une vaporisation totale, une extraction suffisante de l’échantillon et une dérivation complète (si nécessaire).
- Sélectionnez les paramètres GC-MS (programme de température du four, débit, température d’entrée, etc.) en fonction de la classe du ou des composés d’intérêt. Reportez-vous à l’étape 3 pour obtenir un exemple de jeu de paramètres.
- Assurez-vous que la doublur d’entrée approprié (p. ex. diamètre intérieur de 2 mm ou moins) se trouve dans l’entrée gc.
- Assurez-vous que la fibre SPME a été correctement conditionnée et qu’elle est en bon état de fonctionnement avant de commencer l’analyse.
- Faites varier les paramètres de conditionnement en fonction du type de fibre SPME utilisée. Veuillez consulter les instructions sur les fibres SPME pour savoir la température et le temps de conditionnement appropriés. En général, l’analyse de plusieurs blancs de fibres SPME jusqu’à ce qu’ils soient reproductibles est suffisante pour caractériser une fibre SPME comme entièrement conditionnée.
2. Préparation des échantillons de gamma-hydroxybutyrate (GHB) et de gamma-butyrolactone (GBL)
- Préparer un échantillon de GHB et/ou de GBL dans de l’eau à une concentration inférieure à 1 ppm.
- Transférer 1 μL de cet échantillon dans un flacon de 20 mL à espace libre en utilisant l’une des méthodes décrites au point 1.2.1.
- Notez que l’analyse d’échantillons aqueux nécessite les volumes d’échantillons les plus faibles. Par exemple, un μL d’eau se vaporisera complètement dans un flacon d’espace libre de 20 mL à 60 °C.
- Coiffez le flacon immédiatement.
- Placer ~1 mL de BSTFA + 1 % de triméthylchlorosilane (TMCS) dans un flacon et un bouchon séparés de 20 mL.
Remarque : GBL ne dérivatize pas. Une étape de dérivatisation est encore nécessaire, cependant, est de s’assurer que le solvant d’eau dérivatise et n’interfère pas avec l’échantillon.
ATTENTION: BSTFA est toxique et doit être manipulé dans une hotte.
3. Paramètres gc-ms et configuration pour le GHB et le GBL dans l’eau
- Créez une méthode à l’aide des paramètres GC-MS suivants :
Température initiale du four: 60 °C maintenu pendant 1 minute.
Programme du four : 15 °C/minute.
Température finale du four: 280 °C, maintenue pendant 1 minute.
Débit : 2,5 mL/minute (débit optimisé pour une colonne i.d. de 0,25 mm).
Température d’entrée : 250 °C.
Température de la conduite de transfert: 280 °C. - Assurez-vous qu’une doublure d’entrée SPME étroite (2 mm i.d. ou moins) a été placée à l’intérieur de l’entrée GC.
- Assurez-vous que la fibre PDMS/DVB SPME a été correctement conditionnée et qu’elle est en bon état de fonctionnement avant l’analyse.
REMARQUE : Les fibres PDMS/DVB SPME doivent être conditionnées dans l’entrée GC à 250 °C pendant 30 minutes. Les fibres PDMS/DVB SPME doivent être de couleur blanc cassé. - Exécutez le GC-MS sur l’exemple.
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Representative Results
Une étude de volume de GBL a été réalisée pour démontrer la sensibilité de TV-SPME comparée à l’espace de tête et au SPME d’immersion. Un échantillon de 100 ppmv de GBL dans l’eau a été préparé et placé dans des flacons d’espace libre de 20 mL avec des volumes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 et 10 000 μL. Le rapport de phase des échantillons a permis pour tv-SPME (1-3 μL), Headspace SPME (10 – 3 000 μL) et immersion SPME (10 000 μL). Tous les échantillons ont été analysés en trois exemplaires et la surface de crête moyenne a été tracée par rapport au volume de l’échantillon. Dans l’ensemble, les volumes d’échantillons qui ont permis le TV-SPME ont démontré une plus grande sensibilité que l’espace libre ou l’immersion du SPME pour le GBL dans l’eau, comme le montre la figure 2. Une comparaison des chromatogrammes pour chaque méthode est illustrée à la figure 3.
Figure 2 : Graphique de la superficie de pointe moyenne par rapport au volume d’échantillon pour le GBL dans l’eau. Une étude de volume de GBL a été réalisée pour démontrer l’efficacité de TV-SPME comparée à headspace et à SPME d’immersion. Un échantillon de 100 ppmv de GBL dans l’eau a été préparé et placé dans des flacons d’espace libre de 20 mL avec des volumes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 et 10000 μL. Tous les échantillons ont été analysés en trois exemplaires et les barres d’erreur correspondent à l’écart-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Chromatogrammes ioniques totaux pour le GBL dans l’eau. (100 ppm) pour 3 μL (bleu), 300 μL (rouge) et 10 000 μL (vert). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Des échantillons réalistes de vin enrichi d’une dose efficace de GHB et de GBL sont présentés à la figure 4 et à la figure 5,respectivement. Ces échantillons montrent également l’interconversion du GBL et du GHB. Lorsque TV-SPME est effectué correctement, un pic net et abondant se produit comme le montre la figure 6. TV-SPME a une bonne sensibilité et donc des concentrations appropriées doivent être utilisées pour ne pas surcharger la colonne. Lorsque des concentrations élevées sont présentes, il en résulte une asymétrie de pointe, comme le montrent les figures 5 et 7. Dans ces cas, la dilution de l’échantillon ou l’utilisation d’une injection fractionnée peut améliorer la forme du pic.
Figure 4: Échantillon réaliste de GHB dans le vin avec une concentration de 8 mg/mL. Pics : 1) GBL, 2) acide hexanoïque-TMS, 3) GHB-TMS2,4) acide benzoïque-TMS, 5) acide octanoïque-TMS, 6) glycérol-TMS3,* désigne un siloxane cyclique (saignement fibre/colonne). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Échantillon réaliste de GBL dans le vin avec une concentration de 10 mg/mL. Pics : 1) GBL, 2) acide hexanoïque-TMS, 3) Siloxane, 4) triméthyl(2-phényléthoxy)silane, 5) GHB-TMS2. TIC montre la conversion GBL en GHB. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Chromatogramme ionique total pour le GBL dans l’eau avec une concentration de 0,1 ppm. Résultats suivant la méthode TV-SPME précédemment décrite pour GBL dans l’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7 : Chromatogramme ionique total pour le GBL dans l’eau avec une concentration de 10 ppm. Résultats suivant la méthode TV-SPME précédemment décrite pour GBL dans l’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Lors de la dérivation, l’analyste doit s’assurer que la méthode permet de dérivationner complètement l’analyte avant d’être désorbité dans le GC. La dérivatisation partielle peut donner un pic représentant l’analyte dérivatisé et un pic représentant l’analyte sous-annualisé. La dérivatisation partielle entraînera également une sensibilité plus faible pour l’analyte, car moins de celui-ci peut s’adsorber sur la fibre.
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Discussion
Tv-SPME présente certains avantages par rapport à l’injection de liquide GC en ce que les échantillons de grande taille (p. ex. 100 μL) peuvent être utilisés sans modification de l’instrument. TV-SPME présente également certains des mêmes avantages que headspace SPME. Headspace SPME ne nécessite aucune extraction ou filtration car tous les composés non volatils resteront dans le flacon headspace et ne seront pas adsorbés sur la fibre, ce qui donnera un échantillon propre. Cette méthode permet également d’éliminer les effets de matrice dus au fait qu’il s’agit d’un système biphasé (espace de tête et fibre) par opposition à un système triphasé (échantillon, espace de tête et fibre) comme spme d’espace de tête standard. TV-SPME est comme l’immersion SPME en ce que l’immersion SPME est également un système à deux phases. Avec l’immersion SPME, une fibre est immergée dans un échantillon liquide (typiquement aqueux) contenant l’analyte au lieu d’extraire l’analyte de sa vapeur. TV-SPME diffère de l’immersion SPME parce que l’immersion SPME nécessite une matrice polaire / aqueuse afin de générer une force motrice suffisante pour que les analytes quittent la phase de solution et absorbent le revêtement de fibre. De plus, le SPME d’immersion nécessite des volumes d’échantillons beaucoup plus importants (p. ex. mL).
De nombreux solvants peuvent être utilisés avec tv-SPME, y compris le méthanol, l’acétone, l’eau, et l’acétonitrile. Les fibres de SPME ne doivent pas être exposées ou immergées dans le chloroforme, car ces solvants peuvent endommager le revêtement de fibres. Vingt flacons d’espace de tête en verre à bouchon à vis ont été trouvés pour avoir les meilleures performances avec les méthodes TV-SPME. Il est recommandé d’utiliser un échantillonneur automatique avec TV-SPME. Bien que de nombreux paramètres de la méthode TV-SPME puissent être ajustés comme vous le souhaitez, le volume et la température d’extraction appropriés doivent être utilisés pour chaque solvant. Le volume de l’échantillon et la température d’extraction sont proportionnels et doivent être ajustés en conséquence. Par exemple, la température d’extraction d’une méthode peut être réduite, mais le volume de l’échantillon doit également être réduit. Ce volume peut être trouvé en ajustant l’équation 3.
Des modifications peuvent être apportées à la procédure de dérivation. La dérivatisation peut être réalisée en pré- ou post-extraction, à température ambiante ou chauffée dans l’agitateur, en exposant la fibre à la vapeur de l’agent de dérivation ou par immersion directe de la fibre dans l’agent de dérivation.
Il y a des limites à la méthode TV-SPME, y compris la nécessité pour les composés d’être solubles, thermiquement stables, et volatils. TV-SPME nécessite des fibres SPME coûteuses dont le revêtement peut être dénudé ou cassé pendant l’analyse. Ces limites sont compensées par des avantages tels que de grands volumes d’échantillons par rapport aux volumes d’injection gc typiques, une sensibilité élevée et aucun besoin de filtration. TV-SPME est préféré à headspace SPME parce que plus de l’échantillon est extrait sur la fibre et les effets de matrice sont réduits. TV-SPME est également préféré à l’immersion SPME parce que l’immersion SPME consomme beaucoup plus d’échantillon que TV-SPME. TV-SPME permet la dérivation pendant le processus d’extraction, ce qui réduit le temps d’analyse par rapport aux méthodes telles que l’injection de liquide qui nécessitent que l’analyte soit dérivatisé avant l’injection. TV-SPME nécessite également peu ou pas de préparation d’échantillon. TV-SPME est simple, efficace et sensible pour l’analyse d’une grande variété d’échantillons, y compris des drogues, des matériaux explosifs et des carburants de course.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le National Institute of Justice (Prix n° 2015-DN-BX-K058 &2018-75-CX-0035). Les opinions, constatations et conclusions exprimées ici sont celles de l’auteur et ne reflètent pas nécessairement celles des organismes de financement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Syringe | Gerstel | 100111-014-00 | |
| BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM) | Regis Technologies Inc. | 50442882 | |
| eVol XR Sample Dispensing System Kit | ThermoFisher Scientific | 66002-024 | |
 -Butyrolactone (GBL) |
Sigma-Aldrich | B103608-26G | |
| -Hydroxy Butyric Acid (GHB) |
Cayman Chemicals | 9002506 | |
| Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm | Restek | 23083 | |
| Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm | Restek | 23091 | |
| Optima water for HPLC | Fisher Chemical | W71 | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) | Supelco | 57341-U | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB) | Supelco | 57293-U | |
| Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner | Restek | 23313 |
References
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- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , John Wiley & Sons. (1997).
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- Ash, J., Hickey, L., Goodpaster, J. Formation and identification of novel derivatives of primary amine and zwitterionic drugs. Forensic Chemistry. 10, 37-47 (2018).
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