Summary
全気化固相微小抽出(TV-SPME)は、液体試料を完全に気化させ、検体はSPME繊維に浸します。これにより、溶媒蒸気とSPME繊維コーティングの間で検体を仕切ることができます。
Abstract
ガスクロマトグラフィー – 質量分析法 (GC-MS) は、制御物質、発火性液体、爆発物など、多数の法医学的関心の分析に使用される手法です。GC-MSは、固相微小抽出(SPME)と結合することができ、ソープシーコーティングを有する繊維をサンプルの上のヘッドスペースに配置するか、液体サンプルに浸漬する。検光物は繊維にかき付け、次いで脱離のために加熱されたGC入口の中に置かれる。全気化固相マイクロ抽出(TV-SPME)は、浸漬SPMEと同じ技術を利用しますが、完全に気化したサンプル抽出物に繊維を浸漬します。この完全な気化は、液相または不溶性材料からの干渉なしに蒸気相とSPME繊維の間の隔分をもたらします。使用される溶媒の沸点に応じて、TV-SPMEは、大量のサンプル(例えば、数百マイクロリットルまで)を可能にする。オンファイバ誘導体化はTV-SPMEを用いて行うこともできます。TV-SPMEは、薬物および毛髪、尿、唾液中の代謝産物を分析するために使用されてきました。この簡単な技術は、ストリートドラッグ、脂質、燃料サンプル、爆発後の爆発性残渣、水中の汚染物質にも適用されています。本論文では、非常に小さいサンプル(マイクロリットル)のアルコール飲料中の違法な非含年代の非含を特定するためのTV-SPMEの使用について強調する。ガンマヒドロキシブチレート(GHB)とガンマブチロラクチン(GBL)の両方がスパイク飲料に見られるレベルで同定された。トリメチルシリル剤による誘導体化は、水性マトリックスおよびGHBをそれらのTMS誘導体に変換することを可能にした。全体的に、TV-SPMEは速く、容易で、ヘッドスペースバイアルにサンプルを置くこと以外にサンプルの準備を必要としない。
Introduction
固相微小抽出(SPME)は、液体または固体サンプルをヘッドスペースバイアルに入れ、ポリマー材料でコーティングされたSPME繊維をサンプルヘッドスペースに導入する(または液体サンプルに浸漬する)サンプリング技術です。検測物は繊維にかき付け、次いで繊維が脱着用GCの入口の中に置かれ、2.全気化固相微小抽出(TV-SPME)は、浸漬SPMEと同様の技術ですが、分析物が繊維に吸着される前に液体サンプルを完全に気化させます。これにより、溶媒蒸気と繊維のコーティングとの間で検合物を仕切り、より多くの検合物を繊維に吸着させ、良好な感度を得ることを可能にする3。様々なSPME繊維が利用可能であり、繊維は、目的の検体、溶媒/マトリックス、および誘導体化剤に基づいて選択する必要があります。確立された TV-SPME のアナライトについては、表 1を参照してください。
| 見本 | アナライト | 推奨される SPME ファイバ | リファレンス |
| 人間の髪 | ニコチン、コチニン | ポリジメチルシロキサン/ジビニルベンゼン(PDMS/DVB)、ポリアクリル酸(PA) | 3 |
| 無煙パウダー | ニトログリセリン,ジフェニルアミン | ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリエチレングリコール(PEG) | 7, 8 |
| レーシング燃料 | メタノール、ニトロメタン | ペッグ | 9 |
| 水 | 多環芳香族炭化水素 | PDMS | 10 |
| 飲料 | ɣ-ヒドロキシ酪酸, ブチロラクチンɣ | PDMS | この作品 |
| 固体粉 | メタンフェタミン, アンフェタミン | PDMS/DVB | 未発表 |
表 1.TV-SPMEのアナライトを確立した推奨SPMEファイバー。
TV-SPMEを実行するために、検体は溶媒に溶解され、この混合物のアリコートはヘッドスペースバイアルに配置される。溶媒と揮発性の分析物のみが気化するため、サンプルを濾過する必要はありません。液体サンプルの特定の量は、サンプルの全気化を確実にするために使用する必要があります。これらの体積は、理想ガス則を使用して、溶媒のモル数に液体のモル体積を掛けた値を計算することによって決定されます(式1)。
方程式 1
ここでVo は試料の体積(mL)、Pは溶媒の蒸気圧(バー)、Vv はバイアル(L)の体積、Rは理想的なガス定数(0.083145)、M 
は溶媒のモル質量(g/mol)、Tは温度 
(K)、溶媒の密度(g/mL)である。3
正しい蒸気圧を使用するために、アントイン方程式(方程式2)は、温度の影響を考慮するために使用されます:4
方程式 2
ここで、Tは温度、A、B、Cは溶媒のアントワン定数です。数式 2 は、次のように数式 1 に代入できます。
方程式 3
式3は、使用する温度および溶媒の関数として完全に気化することができる試料(Vo)の体積を与える。
TV-SPMEで誘導体化を行うために、SPME繊維は、まず、その検体に応じて所定の時間、誘導体化剤を含むバイアルに曝露される。SPME繊維は、その後、目的の検体を含む新しいバイアルに曝露される。このバイアルは、加熱攪拌機の内部で加熱されます。その後、検体を誘導体化剤で繊維上に吸着する。解析対象の誘導体やマトリックスは、脱着のために GC インレットに挿入される前に、繊維上で行われます。 図 1 は、誘導体化を使用した TV-SPME プロセスの描写を示しています。
図1:誘導体化を伴うTV-SPMEプロセスの描写SPMEファイバーは、誘導体化剤(黄色い円)が繊維上にソルブする誘導体化バイアルに最初に入ります。次いで、繊維をサンプル(青い円)に導入し、加熱します。誘導体(緑色の円)の形成は、抽出時間中に繊維上で行われる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
TV-SPMEは分析プロセス中に分析物を誘導化し、分析時間を短縮することができるので有益である。液体注入などの他の方法では、GCに注入される前に、溶液中の誘導体と反応する検体が必要である。TV-SPMEもサンプル調製をほとんど必要としない。分析物を含むマトリックスはヘッドスペースバイアルに直接配置し、解析することができる。関心のある多くの化合物は、TV-SPMEと互換性があります。化合物は、溶媒に可溶性で、気化を可能にする十分に揮発性でなければなりません。さらに、化合物は、GC-MSによって分析される熱的に安定でなければなりません。TV-SPMEは、薬物および薬物代謝物、レーシング燃料、多環芳香族炭化水素、および爆発材料3、5、6、7、8、9、10を分析するために使用されてきた。
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Protocol
1. 一般的なTV-SPMEサンプル調製とGC-MS分析
注: サンプルがマトリックスに既に溶解されている場合は、ステップ 1.2 に進みます。
- 固体試料を十分な溶媒(水、メタノール、アセトン等)に抽出または溶解し、所望の濃度に達する。液体サンプルは「いつのもとに」使用することができる。
注: 使用される固体サンプルの量は、サンプルの所望の濃度によって異なります。GC カラムの過負荷を避けるために、1 ppm (w/v) 未満の濃度をお勧めします。検体は、選択した有機溶媒に可溶性であるべきである。- サンプルが完全に溶解していることを確認します。
- 選択した温度で式3を使用してサンプルを完全に気化するために必要な体積を計算します。例えば、実験を60°Cで行う場合、60°Cで溶媒を完全に気化させるために必要な体積を計算する。
- このサンプルボリュームをヘッドスペースバイアルに移し、キャップを固定します。マイクロリットルスケールで液体サンプルを移送するための許容可能な方法には、手動でガラスシリンジ、電子ガラス注射器、またはサンプル調製のための液体移動が可能なオートサンプラーロボットを介して含まれる。
- サンプルを誘導する場合は、約1mLの薬剤をヘッドスペースバイアルに入れることにより、適切な誘導体化剤を調製する。
- 必要な誘導体化の種類に基づいて誘導体化剤を選択します:アルキル化、アシル化、またはシリエーション。この場合、GHBに見られるカルボン酸およびアルコール官能基に対する推奨誘導体化剤は、O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセアミド(BSTFA)である。誘導体化剤は「あるがいのとして」使用することができ、希釈を必要としない。誘導体化剤の1 mLは、SPME繊維の完全な飽和を確保するのに十分である。
注意:誘導体化剤は有毒であり、ヒュームフードで取り扱う必要があります。
- 必要な誘導体化の種類に基づいて誘導体化剤を選択します:アルキル化、アシル化、またはシリエーション。この場合、GHBに見られるカルボン酸およびアルコール官能基に対する推奨誘導体化剤は、O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセアミド(BSTFA)である。誘導体化剤は「あるがいのとして」使用することができ、希釈を必要としない。誘導体化剤の1 mLは、SPME繊維の完全な飽和を確保するのに十分である。
- ステップ1.2の計算に基づいて適切なインキュベーション/抽出温度を設定します。この温度は全気化、十分なサンプル抽出、および完全な誘導体化を保障する(必要な場合)。
- 目的の化合物のクラスに基づいて、GC-MS パラメータ(オーブン温度プログラム、流量、入口温度など)を選択します。パラメーター・セットの例については、ステップ 3 を参照してください。
- 適切な入口ライナー(例えば、2mm内径以下)がGCインレットにあることを確認してください。
- SPMEファイバが正しく調整されており、解析を開始する前に良好な動作状態にあることを確認してください。
- 使用するSPMEファイバのタイプに応じて、調整パラメータを変更します。適切なコンディショニング温度と時間については、SPMEファイバーの説明を参照してください。一般に、複数のSPMEファイバブランクを再現可能になるまで分析することは、完全にコンディショニングされたSPMEファイバーを特徴付けるのに十分です。
2. ガンマヒドロキシブチレート(GHB)およびガンマブチロラクチン(GBL)サンプル調製
- 1 ppm 未満の濃度で、GHB および/または GBL のサンプルを水中に調製します。
- 1.2.1で説明されている方法の1つを使用して、このサンプルの1μLを20 mLヘッドスペースバイアルに移します。
- 水性サンプルの分析には、最小のサンプル量が必要であることに注意してください。たとえば、1 μL の水は 60 °C で 20 mL ヘッドスペースバイアルに完全に気化します。
- すぐにバイアルをキャップします。
- BSTFA + 1% トリメチルクロロシラン (TMCS) の約 1 mL を別の 20 mL ヘッドスペースバイアルとキャップに入れる。
注: GBL は誘導しません。しかし、誘導体化ステップは、水溶媒が誘導体化し、サンプルに干渉しないことを保証するために必要です。
注意:BSTFAは有毒であり、ヒュームフードで処理する必要があります。
3. GC-MS パラメータと水中の GHB および GBL のセットアップ
- 次の GC-MS パラメータを使用してメソッドを作成します。
初期オーブン温度:60°Cを1分間保持。
オーブンプログラム:15 °C/分。
最終オーブン温度:280°C、1分間保持。
流量:2.5 mL/分(0.25 mm i.d.カラムの速度最適化流れ)。
入口温度:250°C
転写ライン温度:280°C - 狭い(2mmのi.d.以下)SPMEインレットライナーがGCインレットの内部に配置されていることを確認してください。
- PDMS/DVB SPME ファイバが適切に調整され、分析前に正常に動作していることを確認します。
注: PDMS/DVB SPME ファイバは、GC インレットで 250 °C の 30 分間の間、調整する必要があります。PDMS/DVB SPME ファイバは、オフホワイト色にする必要があります。 - サンプルで GC-MS を実行します。
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Representative Results
ヘッドスペースおよび浸漬SPMEと比較してTV-SPMEの感度を実証するためにGBLボリュームスタディが行われました。水中のGBLの100ppmvサンプル を調製し、1,3,10,30,100,300,300,100,1000,3000,10,000μLの体積を有する20mLヘッドスペースバイアルに入れました。TV-SPME(1-3 μL)、ヘッドスペースSPME(10~3,000 μL)、液浸SPME(10,000 μL)に許容されるサンプルの位相比。全てのサンプルを三重で分析し、平均ピーク面積をサンプル体積に対してプロットした。全体的に見て、TV-SPMEに対応したサンプルボリュームは 、図2に示すように、水中のGBLのヘッドスペースや浸漬SPMEよりも感度が高いことを示した。各方法のクロマトグラムの比較を 図 3に示します。
図2:水中のGBLの平均ピーク面積とサンプル量のグラフ。GBLの容積調査はヘッドスペースおよび浸漬SPMEと比較されるTV-SPMEの有効性を証明するために行われた。水中のGBLの100ppmvサンプル を調製し、1,3,10,30,100,300,300,100,1000,3000μL,1000μLの体積を伴う20mLヘッドスペースバイアルに入れました。すべてのサンプルは三重で分析され、誤差範囲は平均の標準偏差に対応します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:水中のGBLのイオンクロマトグラムの合計。(100 ppm)3 μL(青)、300 μL(赤)、10,000 μL(緑)を指定します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
GHBおよびGBLの有効な線量でスパイクされたワインの現実的なサンプルは、それぞれ 図4 および 図5に示されている。これらのサンプルは、GBLとGHBの相互変換も示しています。TV-SPMEが正しく実行されると、 図6に示すように、急激で豊富なピークが生じる。TV-SPMEは感度が良いため、カラムを過負荷にしないように適切な濃度を使用する必要があります。高濃度が存在する場合、 図 5 および 図 7に示すように、ピーク非対称性が生じる。これらの場合、サンプルを希釈するか、または分割注入を使用してピーク形状を改善することができます。
図4:8mg/mL濃度のワイン中のGHBの現実的なサンプル。ピーク:1)GBL、2)ヘキサン酸-TMS、3)GHB-TMS2、4)安息香酸-TMS、5)オクタイン酸-TMS、6)グリセロールTMS3、*はサイクリックサイロキサン(繊維/カラムブリード)を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:10mg/mL濃度のワイン中のGBLの現実的なサンプル。ピーク: 1) GBL, 2) ヘキサン酸-TMS, 3) シロキサン, 4) トリメチル(2-フェニルエキシーキシ) シラン, 5) GHB-TMS2.TICは、GHBに変換するGBLを示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:0.1-ppm濃度の水中GBLのイオンクロマトグラムの合計。水中のGBLについて先に説明したTV-SPME法に従った結果。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:10-ppm濃度の水中GBLの総イオンクロマトグラム。水中のGBLについて先に説明したTV-SPME法に従った結果。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
誘導体化する場合、アナリストは、メソッドが GC に脱離される前に、分析対象が完全に誘導可能であることを確認する必要があります。部分的誘導体化は、誘導体化された検体を表すピークと、過小化された検体を表すピークをもたらす可能性がある。部分的な誘導体化は、それの少ない繊維に吸着することができるので、検体に対する感度も低くなります。
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Discussion
TV-SPMEは、大きなサンプルサイズ(例えば、100 μL)が機器の変更なしで使用される可能性があるという点で、液体注入GCよりもいくつかの利点があります。TV-SPMEには、ヘッドスペースSPMEと同じ利点がいくつかあります。ヘッドスペースSPMEは、不揮発性化合物がヘッドスペースバイアルに残り、繊維に吸着されないため、抽出やろ過を必要とせず、きれいなサンプルを生成します。この方法は、標準のヘッドスペース SPME のような 3 相システム (サンプル、ヘッドスペース、ファイバ) とは対照的に、2 相システム (ヘッドスペースおよびファイバー) であるため、マトリックス効果を排除するのにも役立ちます。TV-SPMEは、浸漬SPMEも2相システムであるという点で、浸漬SPMEのようなものです。浸漬SPMEを使用すると、繊維は、その蒸気から検体を抽出するのではなく、検体を含む液体(典型的には水性)サンプルに浸漬されます。TV-SPMEは、浸漬SPMEは、溶液相とソルブを繊維コーティングに残すために分析物が十分な駆動力を生成するために極性/水性マトリックスを必要とするため、浸漬SPMEとは異なります。さらに、浸漬SPMEは、はるかに大きなサンプル量(例えば、mL)を必要とします。
メタノール、アセトン、水、アセトニトリルなどTV-SPMEに多くの溶媒を使用できます。これらの溶媒は繊維コーティングを損傷する可能性がありますので、SPME繊維はクロロホルムに露出したり浸漬したりしないでください。20 mLスクリューキャップガラスヘッドスペースバイアルは、TV-SPME法で最高の性能を持つことがわかりました。TV-SPME を使用してオートサンプラーを使用することをお勧めします。TV-SPME法の多くのパラメータは、所望に応じて調整することができるが、適切な体積と抽出温度は、各溶媒のために使用する必要があります。サンプルの体積と抽出温度は互いに比例し、それに応じて調整する必要があります。例えば、方法の抽出温度を低下させるかもしれないが、サンプル量も減らさなければならない。この体積は、数式3を調整することによって見つけることができます。
誘導体化手順に変更を加えてもよい。誘導体化は、抽出前または後抽出を行い、室温で、または攪拌機で加熱し、繊維を誘導体化剤の蒸気に曝露するか、または繊維を誘導体化剤に直接浸漬することによって行うことができる。
TV-SPME法には、可溶性、熱的に安定、揮発性の化合物の必要性を含む制限があります。TV-SPMEは、分析中にコーティングを剥がしたり壊れたりする高価なSPME繊維を必要とします。これらの制限は、典型的なGC注入量に対する大量のサンプル量、高感度、および濾過の必要がないなどの利点を上回る。TV-SPMEは、より多くのサンプルが繊維上に抽出され、マトリックス効果が低下するため、ヘッドスペースSPMEに好ましい。また、浸漬SPMEはTV-SPMEよりもはるかに多くのサンプルを消費するため、SPMEを浸漬する方が好ましい。TV-SPMEは、抽出プロセス中に誘導体化を可能にし、注入前に分析物を誘導体化する必要がある液体注入などの方法と比較して分析時間を短縮する。TV-SPMEもサンプル調製をほとんど必要としない。TV-SPMEは、薬物、爆発性材料、レーシング燃料など、さまざまなサンプルの分析に対して、シンプルで効率的で敏感です。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立司法研究所(賞No.2015-DN-BX-K058&2018-75-CX-0035)によって支援されました。ここで述べらう意見、調査結果、結論は著者のものであり、必ずしも資金調達組織の意見、調査結果を反映しているわけではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Syringe | Gerstel | 100111-014-00 | |
| BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM) | Regis Technologies Inc. | 50442882 | |
| eVol XR Sample Dispensing System Kit | ThermoFisher Scientific | 66002-024 | |
 -Butyrolactone (GBL) |
Sigma-Aldrich | B103608-26G | |
| -Hydroxy Butyric Acid (GHB) |
Cayman Chemicals | 9002506 | |
| Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm | Restek | 23083 | |
| Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm | Restek | 23091 | |
| Optima water for HPLC | Fisher Chemical | W71 | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) | Supelco | 57341-U | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB) | Supelco | 57293-U | |
| Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner | Restek | 23313 |
References
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