Summary
Total fordampning Solid Phase Microextraction (TV-SPME) fordamper helt en væskeprøve mens analytter blir sorbed på en SPME fiber. Dette gjør det mulig å partisjonere analytten mellom bare løsningsmiddeldampen og SPME fiberbelegget.
Abstract
Gasskromatografi – Massespektrometri (GC-MS) er en ofte brukt teknikk for analyse av mange analytter av rettsmedisinsk interesse, inkludert kontrollerte stoffer, antennelige væsker og eksplosiver. GC-MS kan kombineres med Solid-Phase Microextraction (SPME), der en fiber med et sorptive belegg plasseres i hoderommet over en prøve eller nedsenkes i en flytende prøve. Analytter blir sorbed på fiberen som deretter plasseres inne i det oppvarmede GC-innløpet for avledning. Total fordampning Solid-Phase Microextraction (TV-SPME) benytter samme teknikk som nedsenking SPME, men fordyper fiberen i et helt fordampet prøveekstrakt. Denne komplette fordampningen resulterer i en partisjon mellom bare dampfasen og SPME-fiberen uten forstyrrelser fra en væskefase eller uoppløselige materialer. Avhengig av kokepunktet til løsningsmidlet som brukes, tillater TV-SPME store prøvevolumer (f.eks. opptil hundrevis av mikroliter). Avledning på fiber kan også utføres ved hjelp av TV-SPME. TV-SPME har blitt brukt til å analysere narkotika og deres metabolitter i hår, urin og spytt. Denne enkle teknikken har også blitt brukt på gatemedisiner, lipider, drivstoffprøver, eksplosive rester etter eksplosjonen og miljøgifter i vann. Dette dokumentet fremhever bruken av TV-SPME for å identifisere ulovlige utroskap i svært små prøver (mikrolitermengder) av alkoholholdige drikker. Både gamma-hydroksybutyrat (GHB) og gamma-butyrolactone (GBL) ble identifisert på nivåer som ville bli funnet i spiked drinker. Avledning av et trimetylsilylmiddel tillatt for konvertering av vandig matrise og GHB til deres TMS-derivater. Totalt sett er TV-SPME rask, enkel og krever ingen prøveforberedelse bortsett fra å plassere prøven i et hetteglass med hoderom.
Introduction
Solid-Phase Microextraction (SPME) er en prøvetakingsteknikk der en væske eller fast prøve plasseres i et hoderomsflaske og en SPME fiber, belagt med et polymert materiale, blir deretter introdusert i prøvehoderommet (eller nedsenket i en væskeprøve). Analytten blir sorbed på fiberen og deretter fiberen er plassert inne i GC-innløpet for desorpsjon1,2. Total fordampning Solid-Phase Microextraction (TV-SPME) er en lignende teknikk som nedsenking SPME, men fordamper helt en væskeprøve før analytter adsorberes på fiberen. Dette gjør det mulig å partisjonere analytten mellom bare løsningsmiddeldampen og belegget av fiberen, slik at mer av analytten kan adsorberes på fiberen og resulterer i god følsomhet3. Det er forskjellige SPME-fibre tilgjengelig, og fiberen bør velges basert på analytten av interesse, løsningsmiddel / matrise og avledningsmiddel. Se tabell 1 for etablerte TV-SPME-analytter.
| eksempel | Analytt(er) | Anbefalt SPME Fiber | Referanse(er) |
| Menneskehår | Nikotin, cotinine | Polydimetylsiloksan/divinylbenzen (PDMS/DVB), polyakrylat (PA) | 3 |
| Røykfritt pulver | Nitroglyserin, difenylamin | Polydimetylsiloksan (PDMS), polyetylenglykol (PEG) | 7, 8 |
| Racing drivstoff | Metanol, nitrometan | plugg | 9 |
| Vann | Polysykliske aromatiske hydrokarboner | PDMS | 10 |
| Drikkevarer | ɣ-Hydroksybutyrsyre, ɣ-butyrolactone | PDMS | Dette arbeidet |
| Fast pulver | Metamfetamin, amfetamin | PDMS/DVB | upublisert |
Tabell 1. Anbefalte SPME-fibre med etablerte TV-SPME-analytter.
For å utføre TV-SPME oppløses analytter i et løsningsmiddel og en aliquot av denne blandingen plasseres i et hoderoms hetteglass. Prøver trenger ikke å filtreres fordi bare løsningsmidlet og flyktige analytter vil fordampe. Spesifikke mengder væskeprøver må brukes for å sikre total fordampning av prøven. Disse volumene bestemmes ved å bruke Ideal Gas Law til å beregne antall mol av et løsningsmiddel multiplisert med væskens molarvolum (ligning 1).
Formel 1
hvor Vo er volumet av prøven (ml), P er damptrykket til løsningsmidlet (bar), Vv er volumet av hetteglasset (L), R er den ideelle gasskonstanten (0,083145 
), M er molarmassen til løsningsmidlet (g / mol), T er temperatur (K), og 
er tettheten av løsningsmidlet (g / ml). 3
For å bruke riktig damptrykk, brukes Antoine-ligningen (Formel 2) til å ta hensyn til påvirkning av temperatur:4
Formel 2
der T er temperatur og A, B og C er Antoine-konstantene for løsningsmidlet. Ligning 2 kan erstattes i formel 1, noe som gir:
Formel 3
Ligning 3 gir volumet av prøven (Vo) som kan fordampes helt som en funksjon av temperaturen og løsningsmidlet som brukes.
For å utføre avledning med TV-SPME, blir SPME-fiberen først utsatt for et hetteglass som inneholder avledningsmiddelet i en forhåndsbestemt tidsperiode, avhengig av analytten. SPME-fiberen blir deretter utsatt for et nytt hetteglass som inneholder analytten av interesse. Dette hetteglasset varmes opp inne i en oppvarmet agitator. Analytten adsorberes deretter på fiberen med avledningsmiddelet. Avledningen av analytten og/eller matrisen foregår på fiberen før den settes inn i GC-innløpet for desorpsjon. Figur 1 viser en skildring av TV-SPME-prosessen med avledning.
Figur 1: Skildring av TV-SPME-prosessen med avledning. SPME fiber går først inn i avlednings hetteglasset der derivatiseringsmiddelet (gule sirkler) sorb på fiberen. Fiberen blir deretter introdusert til prøven (blå sirkler) og oppvarmet. Dannelse av derivatet (grønne sirkler) foregår på fiberen i ekstraksjonstiden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
TV-SPME er gunstig fordi det gjør det mulig å avlede analytten under ekstraksjonsprosessen, noe som reduserer analysetiden. Andre metoder, som væskeinjeksjon, krever at analytten reagerer med avledningsmiddelet i oppløsning før den injiseres i GC. TV-SPME krever også lite eller ingen prøveforberedelse. En matrise som inneholder en analytt kan plasseres direkte i hetteglasset i hoderommet og analyseres. Mange forbindelser av interesse er kompatible med TV-SPME. Forbindelser må være oppløselige i et løsningsmiddel og tilstrekkelig flyktig for å tillate fordampning. I tillegg må forbindelser være termisk stabile for å bli analysert av GC-MS. TV-SPME har blitt brukt til å analysere narkotika og narkotikametabolitter, racingbrensel, polysykliske aromatiske hydrokarboner og eksplosive materialer3,5,6,7,8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generell TV-SPME prøvepreparering og GC-MS-analyse
MERK: Hvis prøven allerede er oppløst i en matrise, går du til trinn 1.2.
- Trekk ut eller oppløs den faste prøven i nok løsningsmiddel (vann, metanol, aceton, etc.) for å nå ønsket konsentrasjon. Væskeprøver kan brukes "som de er".
MERK: Mengden fast prøve som brukes, avhenger av ønsket konsentrasjon av prøven. Konsentrasjoner under 1 ppm (w/v) anbefales for å unngå overbelastning av GC-kolonnen. Analytt skal være løselig i valgt organisk løsningsmiddel.- Kontroller at prøven er fullstendig oppløst.
- Beregn volumet som trengs for å fordampe prøven fullstendig ved hjelp av ligning 3 ved den valgte temperaturen. For eksempel, hvis eksperimentet skal utføres ved 60 °C, beregner du volumet som trengs for å fordampe oppløsningsvæsken helt ved 60 °C.
- Overfør dette prøvevolumet til et hetteglass med hoderom og fest hetten. Akseptable metoder for overføring av væskeprøver på mikroliterskalaen inkluderer manuelt via glasssprøyte, en elektronisk glasssprøyte eller en autosamplerrobot som er i stand til væskeoverføringer for prøvepreparering.
- Hvis du avleder prøven, klargjør du riktig avledningsmiddel ved å plassere ~ 1 ml av midlet i et hetteglass med hoderom.
- Velg avledningsmiddelet basert på typen avledning som trengs: alkylering, acylering eller silyasjon. I dette tilfellet er det anbefalte avledningsmiddelet for karboksylsyre- og alkoholfunksjonsgruppene som finnes på GHB O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamid (BSTFA). Avledningsmiddelet kan brukes "som det er" og krever ikke fortynning. En ml av avledningsmiddel er nok til å sikre fullstendig metning av SPME-fiberen.
FORSIKTIG: Avledningsmidler er giftige og bør håndteres i en avtrekkshette.
- Velg avledningsmiddelet basert på typen avledning som trengs: alkylering, acylering eller silyasjon. I dette tilfellet er det anbefalte avledningsmiddelet for karboksylsyre- og alkoholfunksjonsgruppene som finnes på GHB O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamid (BSTFA). Avledningsmiddelet kan brukes "som det er" og krever ikke fortynning. En ml av avledningsmiddel er nok til å sikre fullstendig metning av SPME-fiberen.
- Still inn riktig inkubasjons-/ekstraksjonstemperatur basert på beregningen i trinn 1.2. Denne temperaturen sikrer total fordampning, tilstrekkelig prøveutvinning og fullstendig avledning (om nødvendig).
- Velg GC-MS-parametere (ovnstemperaturprogram, strømningshastighet, innløpstemperatur, etc.) basert på klassen av interesseforbindelsen(e). Se trinn 3 hvis du vil se et eksempelparametersett.
- Påse at riktig innløpsforing (f.eks. 2 mm indre diameter eller mindre) er i GC-innløpet.
- Forsikre deg om at SPME-fiberen er riktig kondisjonert og er i god stand før du begynner analysen.
- Varier kondisjoneringsparametrene basert på typen SPME fiber som brukes. Se SPME fiberinstruksjoner for riktig kondisjoneringstemperatur og -tid. Generelt er det tilstrekkelig å analysere flere SPME fiberemner til de er reproduserbare for å karakterisere en SPME fiber som fullt betinget.
2. Gamma-hydroksybutyrat (GHB) og Gamma-butyrolactone (GBL) prøvepreparering
- Forbered en prøve av GHB og/eller GBL i vann med en konsentrasjon på mindre enn 1 ppm.
- Overfør 1 μL av denne prøven til et 20 ml hoderoms hetteglass ved hjelp av en av metodene beskrevet i 1.2.1.
- Vær oppmerksom på at analysen av vandige prøver krever de laveste utvalgsvolumene. For eksempel vil en μL vann helt fordampe til et 20 ml hoderomsflaske ved 60 °C.
- Hette hetteglasset umiddelbart.
- Plasser ~1 ml BSTFA + 1% trimethylchlorosilane (TMCS) i et separat 20 ml hetteglass og hette.
MERK: GBL avledes ikke. Et avledningstrinn er imidlertid fortsatt nødvendig for å sikre at vannløsningsmidlet avledes og ikke forstyrrer prøven.
FORSIKTIG: BSTFA er giftig og bør håndteres i en avtrekkshette.
3. GC-MS-parametere og oppsett for GHB og GBL i vann
- Opprett en metode ved hjelp av følgende GC-MS-parametere:
Innledende ovnstemperatur: 60 °C holdt i 1 minutt.
Ovn program: 15 °C/minutt.
Endelig ovnstemperatur: 280 °C, holdt i 1 minutt.
Strømningshastighet: 2,5 ml/minutt (hastighetsoptimalisert strømning for en 0,25 mm i.d.-kolonne).
Innløpstemperatur: 250 °C.
Overføring linjetemperatur: 280 °C. - Sørg for at en smal (2 mm i.d. eller mindre) SPME-innløpsforing er plassert inne i GC-innløpet.
- Kontroller at PDMS/DVB SPME-fiberen er riktig kondisjonert og er i god stand før analyse.
MERK: PDMS/DVB SPME-fibrene bør kondisjoneres i GC-innløpet ved 250 °C i 30 minutter. PDMS/DVB SPME-fibre bør være en off-white farge. - Kjør GC-MS på eksemplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En GBL-volumstudie ble utført for å demonstrere følsomheten til TV-SPME sammenlignet med headspace og nedsenking SPME. En 100 ppmv prøve av GBL i vann ble tilberedt og plassert i 20 ml hoderomsflasker med volumer på 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 og 10 000 μL. Faseforholdet mellom prøvene som er tillatt for TV-SPME (1-3 μL), Headspace SPME (10 – 3000 μL) og Immersion SPME (10 000 μL). Alle prøver ble analysert i triplikat og det gjennomsnittlige toppområdet ble plottet mot prøvevolumet. Samlet sett viste prøvevolumer som tillot TV-SPME mer følsomhet enn headspace eller nedsenking SPME for GBL i vann som vist i figur 2. En sammenligning av kromatogrammer for hver metode vises i figur 3.
Figur 2: Graf over gjennomsnittlig toppområde kontra prøvevolum for GBL i vann. En GBL volumstudie ble utført for å demonstrere effekten av TV-SPME sammenlignet med headspace og nedsenking SPME. En 100 ppmv prøve av GBL i vann ble tilberedt og plassert i 20 ml hoderomsflasker med volumer på 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 og 10000 μL. Alle prøver ble analysert i triplikat og feilfelt tilsvarer standardavviket for gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Totalt ionkromatogrammer for GBL i vann. (100 ppm) for 3 μL (blå), 300 μL (rød) og 10 000 μL (grønn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Realistiske prøver av vin pigget med en effektiv dose GHB og GBL er vist i henholdsvis figur 4 og figur 5. Disse prøvene viser også interkonversjon av GBL og GHB. Når TV-SPME utføres riktig, vil en skarp, rikelig topp resultere som vist i figur 6. TV-SPME har god følsomhet og derfor bør riktige konsentrasjoner brukes til ikke å overbelaste kolonnen. Når det er høye konsentrasjoner, vil topp asymmetri resultere som vist i figur 5 og figur 7. I disse tilfellene kan fortynning av prøven eller bruk av en delt injeksjon forbedre toppformen.
Figur 4: Realistisk prøve av GHB i vin med en konsentrasjon på 8 mg/ml. Topper: 1) GBL, 2) heksansyre-TMS, 3) GHB-TMS2, 4) benzosyre-TMS, 5) oktansyre-TMS, 6) glyserol-TMS3, * betegner en syklisk siloksan (fiber / kolonneblødning). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Realistisk prøve av GBL i vin med en konsentrasjon på 10 mg/ml. Topper: 1) GBL, 2) heksanosyre-TMS, 3) Siloksan, 4) trimetyl (2-fenyletoksy) silan, 5) GHB-TMS2. TIC viser GBL-konvertering til GHB. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Totalt ionkromatogram for GBL i vann med konsentrasjon på 0,1 ppm. Resultater etter TV-SPME-metoden som tidligere er beskrevet for GBL i vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Totalt ionkromatogram for GBL i vann med en konsentrasjon på 10 ppm. Resultater etter TV-SPME-metoden som tidligere er beskrevet for GBL i vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved avledning bør analytikeren sørge for at metoden gjør det mulig å avlede analytten(e) fullstendig før den desorbertes i GC. Delvis avledning kan resultere i en topp som representerer den avledede analytten og en topp som representerer den underivatiserte analytten. Delvis avledning vil også resultere i lavere følsomhet for analytten, da mindre av det kan adsorbere på fiberen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TV-SPME har noen fordeler i forhold til væskeinjeksjon GC ved at store prøvestørrelser (f.eks. 100 μL) kan brukes uten instrumentmodifikasjoner. TV-SPME har også noen av de samme fordelene som headspace SPME. Headspace SPME krever ingen ekstraksjon eller filtrering fordi noen ikke-flyktige forbindelser vil forbli i hoderom hetteglasset og vil ikke bli adsorbert på fiberen, noe som gir en ren prøve. Denne metoden bidrar også til å eliminere matriseeffekter på grunn av at dette er et tofaset system (hoderom og fiber) i motsetning til et trefaset system (prøve, hoderom og fiber) som standard headspace SPME. TV-SPME er som nedsenking SPME ved at nedsenking SPME også er et tofaset system. Med nedsenking SPME er en fiber nedsenket i en væske (vanligvis vandig) prøve som inneholder analytten i motsetning til å trekke ut analytten fra dampen. TV-SPME skiller seg fra nedsenking SPME fordi nedsenking SPME krever en polar / vandig matrise for å generere tilstrekkelig drivkraft for analytter til å forlate løsningsfasen og sorb til fiberbelegget. I tillegg krever spme for nedsenking mye større prøvevolumer (f.eks. ml).
Mange løsningsmidler kan brukes med TV-SPME, inkludert metanol, aceton, vann og acetonitril. SPME-fibre skal ikke utsettes for eller nedsenkes i kloroform, da disse løsningsmidlene kan skade fiberbelegget. Tjue ml skruehett glasshoderom hetteglass har vist seg å ha den beste ytelsen med TV-SPME-metoder. Det anbefales å bruke en autosampler med TV-SPME. Mens mange parametere for TV-SPME-metoden kan justeres etter ønske, må riktig volum og ekstraksjonstemperatur brukes til hvert løsningsmiddel. Prøvevolum og ekstraksjonstemperatur er proporsjonal med hverandre og må justeres tilsvarende. For eksempel kan utvinningstemperaturen til en metode reduseres, men prøvevolumet må også reduseres. Dette volumet kan bli funnet ved å justere Formel 3.
Endringer i avledningsprosedyren kan gjøres. Avledning kan utføres pre- eller post-ekstraksjon, ved romtemperatur eller oppvarmet i agitatoren, ved å utsette fiberen for dampen til derivatiseringsmiddelet eller ved direkte nedsenking av fiberen i derivatiseringsmiddelet.
Det er begrensninger i TV-SPME-metoden, inkludert behovet for at forbindelser skal være løselige, termisk stabile og flyktige. TV-SPME krever dyre SPME-fibre som kan få belegget strippet eller ødelagt under analyse. Disse begrensningene oppveies av fordeler som store prøvevolumer i forhold til typiske GC-injeksjonsvolumer, høy følsomhet og ikke behov for filtrering. TV-SPME foretrekkes fremfor headspace SPME fordi mer av prøven ekstraheres på fiber- og matriseeffektene reduseres. TV-SPME foretrekkes også fremfor nedsenking av SPME fordi spme for nedsenking bruker mye mer prøve enn TV-SPME. TV-SPME tillater avledning under ekstraksjonsprosessen som reduserer analysetiden sammenlignet med metoder som væskeinjeksjon som krever at analytten avledes før injeksjon. TV-SPME krever også lite eller ingen prøveforberedelse. TV-SPME er enkel, effektiv og følsom for analyse av et bredt utvalg av prøver, inkludert narkotika, eksplosive materialer og racingbrensel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Institute of Justice (Award No. 2015-DN-BX-K058 &2018-75-CX-0035). Meningene, funnene og konklusjonene som uttrykkes her, er forfatterens og gjenspeiler ikke nødvendigvis finansieringsorganisasjonens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Syringe | Gerstel | 100111-014-00 | |
| BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM) | Regis Technologies Inc. | 50442882 | |
| eVol XR Sample Dispensing System Kit | ThermoFisher Scientific | 66002-024 | |
 -Butyrolactone (GBL) |
Sigma-Aldrich | B103608-26G | |
| -Hydroxy Butyric Acid (GHB) |
Cayman Chemicals | 9002506 | |
| Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm | Restek | 23083 | |
| Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm | Restek | 23091 | |
| Optima water for HPLC | Fisher Chemical | W71 | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) | Supelco | 57341-U | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB) | Supelco | 57293-U | |
| Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner | Restek | 23313 |
References
- Pawliszyn, J. B. Method and Device for Solid Phase Microextraction and Desorption. United States patent. , (2005).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , John Wiley & Sons. (1997).
- Rainey, C. L., Bors, D. E., Goodpaster, J. V. Design and optimization of a total vaporization technique coupled to solid-phase microextraction. Analytical Chemistry. 86 (22), 11319-11325 (2014).
- Sinnott, R. Chemical Engineering Design: Chemical Engineering. 6, Elsevier. (2005).
- Davis, K. Detection of Illicit Drugs in Various Matrices Via Total Vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME). , Indiana University - Purdue University Indianapolis. Master of Science thesis (2019).
- Ash, J., Hickey, L., Goodpaster, J. Formation and identification of novel derivatives of primary amine and zwitterionic drugs. Forensic Chemistry. 10, 37-47 (2018).
- Sauzier, G., Bors, D., Ash, J., Goodpaster, J. V., Lewis, S. W. Optimisation of recovery protocols for double-base smokeless powder residues analysed by total vaporisation (TV) SPME/GC-MS. Talanta. 158, 368-374 (2016).
- Bors, D., Goodpaster, J. Mapping smokeless powder residue on PVC pipe bomb fragments using total vaporization solid phase microextraction. Forensic science international. 276, 71-76 (2017).
- Bors, D., Goodpaster, J. Chemical analysis of racing fuels using total vaporization and gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). Analytical Methods. 8 (19), 3899-3902 (2016).
- Beiranvand, M., Ghiasvand, A. Design and optimization of the VA-TV-SPME method for ultrasensitive determination of the PAHs in polluted water. Talanta. 212, 120809 (2020).
