Summary
A Microextração de Fase Sólida de Vaporização Total (TV-SPME) vaporiza completamente uma amostra líquida enquanto os analitos são sorbados em uma fibra SPME. Isso permite a particionamento do analito entre apenas o vapor solvente e o revestimento de fibra SPME.
Abstract
Cromatografia gasosa – Espectrometria de Massa (GC-MS) é uma técnica frequentemente utilizada para a análise de numerosos analitos de interesse forense, incluindo substâncias controladas, líquidos inflamáveis e explosivos. O GC-MS pode ser acoplado à Microextração de Fase Sólida (SPME), na qual uma fibra com revestimento sorptivo é colocada no espaço da cabeça acima de uma amostra ou imersa em uma amostra líquida. Os analitos são sorbados sobre a fibra que é então colocada dentro da entrada aquecida gc para desorção. A Microextração de Fase Sólida (TV-SPME) utiliza a mesma técnica do SPME de imersão, mas imergi a fibra em um extrato de amostra completamente vaporizado. Esta vaporização completa resulta em uma divisória entre apenas a fase de vapor e a fibra SPME sem interferência de uma fase líquida ou quaisquer materiais insolúveis. Dependendo do ponto de ebulição do solvente utilizado, a TV-SPME permite grandes volumes de amostra (por exemplo, até centenas de microliters). A derivatização on-fiber também pode ser realizada utilizando TV-SPME. A TV-SPME tem sido usada para analisar drogas e seus metabólitos em cabelo, urina e saliva. Esta técnica simples também tem sido aplicada a drogas de rua, lipídios, amostras de combustível, resíduos explosivos pós-explosão e poluentes na água. Este artigo destaca o uso de TV-SPME para identificar adúlteros ilegais em amostras muito pequenas (quantidades de microliteres) de bebidas alcoólicas. Tanto o gama-hidroxibutirato (GHB) quanto o gama-butyrolactona (GBL) foram identificados em níveis que seriam encontrados em bebidas espetadas. A derivação por um agente trimetilsilyl permitiu a conversão da matriz aquosa e GHB em seus derivados TMS. No geral, a TV-SPME é rápida, fácil e não requer preparação de amostra, além de colocar a amostra em um frasco de headspace.
Introduction
A Microextração de Fase Sólida (SPME) é uma técnica de amostragem na qual uma amostra líquida ou sólida é colocada em um frasco de espaço para a cabeça e uma fibra SPME, revestida com um material polimérico, é então introduzida no headspace da amostra (ou imersa em uma amostra líquida). O analito é sorbado sobre a fibra e, em seguida, a fibra é colocada dentro da entrada GC para desorção1,2. A Microextração de Fase Sólida (TV-SPME) é uma técnica semelhante à spme de imersão, mas vaporiza completamente uma amostra líquida antes que os analitos sejam adsorvidos na fibra. Isso permite particionamento do analito entre apenas o vapor solvente e o revestimento da fibra, permitindo que mais do analito seja adsorvida na fibra e resultando em boa sensibilidade3. Existem várias fibras SPME disponíveis e a fibra deve ser escolhida com base no analito de interesse, solvente/matriz e agente de derivatização. Consulte a Tabela 1 para analitos de TV-SPME estabelecidos.
| amostra | Analyte | Fibra SPME recomendada | Referência(s) |
| Cabelo Humano | Nicotina, cotinina | Polidimethylsiloxano/divinylbenzeno (PDMS/DVB), poliacrilato (PA) | 3 |
| Pó sem fumo | Nitroglicerina, difenilamina | Polidimimetilsiloxano (PDMS), polietileno glicol (PEG) | 7, 8 |
| Combustível de corrida | Metanol, nitrometano | gancho | 9 |
| Água | Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos | PDMS | 10 |
| Bebidas | ɣ-ácido hidroxibutírico, ɣ-butyrolactona | PDMS | Este Trabalho |
| Pó Sólido | Metanfetamina, anfetamina | PDMS/DVB | inédito |
Mesa 1. Fibras SPME recomendadas com analitos de TV-SPME estabelecidos.
Para realizar a TV-SPME, os analitos são dissolvidos em um solvente e uma alíquota dessa mistura é colocada em um frasco de headspace. As amostras não precisam ser filtradas porque apenas os analitos solventes e voláteis vaporizarão. Devem ser utilizados volumes específicos de amostras líquidas para garantir a vaporização total da amostra. Esses volumes são determinados utilizando-se a Lei do Gás Ideal para calcular o número de mols de um solvente multiplicado pelo volume molar do líquido (Equação 1).
Equação 1
onde Vo é o volume da amostra (mL), P é a pressão de vapor do solvente (barra), Vv é o volume do frasco (L), R é a constante de gás ideal (0,083145 
), M é a massa molar do solvente (g/mol), T é temperatura (K), e é a densidade do 
solvente (g/mL). 3
Para usar a pressão correta do vapor, a equação de Antoine (Equação 2) é usada para explicar a influência da temperatura:4
Equação 2
onde T é temperatura e A, B e C são as constantes antoine para o solvente. A equação 2 pode ser substituída na Equação 1, rendendo:
Equação 3
A equação 3 dá o volume da amostra (Vo) que pode ser completamente vaporizado em função da temperatura e do solvente utilizado.
Para realizar a derivatização com TV-SPME, a fibra SPME é primeiramente exposta a um frasco contendo o agente de derivatização por um período de tempo predeterminado, dependendo do analito. A fibra SPME é então exposta a um novo frasco contendo o analito de interesse. Este frasco é aquecido dentro de um agitador aquecido. O analito é então adsorvido na fibra com o agente de derivatização. A derivatização do analito e/ou da matriz ocorre na fibra antes de ser inserida na entrada gc para desabedação. A Figura 1 mostra uma representação do processo TV-SPME com derivatização.
Figura 1: Representação do processo TV-SPME com derivatização. A fibra SPME entra primeiro no frasco de derivatização onde o agente de derivatização (círculos amarelos) sorb sobre a fibra. A fibra é então introduzida à amostra (círculos azuis) e aquecida. A formação do derivado (círculos verdes) ocorre na fibra durante o tempo de extração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A TV-SPME é benéfica porque permite que o analito seja derivado durante o processo de extração, o que reduz o tempo de análise. Outros métodos, como a injeção líquida, exigem que o analito reaja com o agente derivatante em solução antes de ser injetado no GC. A TV-SPME também requer pouca ou nenhuma preparação amostral. Uma matriz contendo um analito pode ser colocada diretamente no frasco do espaço para a cabeça e analisada. Muitos compostos de interesse são compatíveis com TV-SPME. Os compostos devem ser solúveis em um solvente e suficientemente voláteis para permitir a vaporização. Além disso, os compostos devem ser termicamente estáveis a serem analisados pelo GC-MS. A TV-SPME tem sido usada para analisar drogas e metabólitos de drogas, combustíveis de corrida, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e materiais explosivos3,5,6,7,8,9,10.
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Protocol
1. Preparação geral da amostra de TV-SPME e análise de GC-MS
NOTA: Se a amostra já estiver dissolvida em uma matriz, pule para o Passo 1.2.
- Extrair ou dissolver a amostra sólida em solvente suficiente (água, metanol, acetona, etc.) para alcançar a concentração desejada. Amostras líquidas podem ser usadas "como está".
NOTA: A quantidade de amostra sólida utilizada depende da concentração desejada da amostra. Concentrações abaixo de 1 ppm (c/v) são recomendadas para evitar sobrecarregar a coluna GC. Analito deve ser solúvel em solvente orgânico escolhido.- Certifique-se de que a amostra foi totalmente dissolvida.
- Calcule o volume necessário para vaporizar totalmente a amostra usando a Equação 3 na temperatura escolhida. Por exemplo, se o experimento for realizado a 60 °C, calcule o volume necessário para vaporizar completamente o solvente a 60 °C.
- Transfira este volume de amostra para um frasco de espaço para a cabeça e fixe a tampa. Métodos aceitáveis para a transferência de amostras líquidas na escala de microliter incluem manualmente através de seringa de vidro, uma seringa de vidro eletrônico ou um robô autosampler capaz de transferências líquidas para preparação de amostras.
- Se derivatizar a amostra, prepare o agente de derivação adequado colocando ~1 mL do agente em um frasco de headspace.
- Escolha o agente de derivação com base no tipo de derivatização necessária: alquilação, aciilação ou silicação. Neste caso, o agente de derivatização recomendado para os grupos funcionais de ácido carboxílico e álcool encontrados no GHB é O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamida (BSTFA). O agente de derivatização pode ser usado "como está" e não requer diluição. Um mL de agente de derivatização é suficiente para garantir a saturação completa da fibra SPME.
ATENÇÃO: Os agentes de derivatização são tóxicos e devem ser manuseados em um capô de fumaça.
- Escolha o agente de derivação com base no tipo de derivatização necessária: alquilação, aciilação ou silicação. Neste caso, o agente de derivatização recomendado para os grupos funcionais de ácido carboxílico e álcool encontrados no GHB é O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamida (BSTFA). O agente de derivatização pode ser usado "como está" e não requer diluição. Um mL de agente de derivatização é suficiente para garantir a saturação completa da fibra SPME.
- Defina a temperatura de incubação/extração adequada com base no cálculo da etapa 1.2. Esta temperatura garante vaporização total, extração suficiente da amostra e derivação completa (se necessário).
- Selecione parâmetros GC-MS (programa de temperatura do forno, taxa de fluxo, temperatura de entrada, etc.) com base na classe dos compostos de interesse. Consulte o Passo 3 para um conjunto de parâmetros de exemplo.
- Certifique-se de que o forro de entrada adequado (por exemplo, 2 mm de diâmetro interno ou menos) esteja na entrada GC.
- Certifique-se de que a fibra SPME foi devidamente condicionada e está em boas condições de trabalho antes de iniciar a análise.
- Varie os parâmetros de condicionamento com base no tipo de fibra SPME utilizada. Consulte as instruções de fibra SPME para obter temperatura e tempo de condicionamento adequados. Em geral, analisar vários espaços em branco de fibra SPME até que sejam reprodutíveis é suficiente para caracterizar uma fibra SPME como totalmente condicionada.
2. Preparação amostral de gamma-hidroxibutirato (GHB) e Gamma-butyrolactona (GBL)
- Prepare uma amostra de GHB e/ou GBL na água com uma concentração inferior a 1 ppm.
- Transfira 1 μL desta amostra para um frasco de headspace de 20 mL usando um dos métodos descritos em 1.2.1.
- Note-se que a análise de amostras aquosas requer os volumes amostrais mais baixos. Por exemplo, um μL de água será completamente vaporizado em um frasco de 20 mL de headspace a 60 °C.
- Tampe o frasco imediatamente.
- Coloque ~1 mL de BSTFA + 1% trimtilcloosilano (TMCS) em um frasco e tampa separados de 20 mL.
NOTA: O GBL não derivatiza. Uma etapa de derivação ainda é necessária, no entanto, é garantir que o solvente de água se desvae e não interfira na amostra.
ATENÇÃO: O BSTFA é tóxico e deve ser manuseado em um capô de fumaça.
3. Parâmetros GC-MS e configuração para GHB e GBL na água
- Crie um método usando os seguintes parâmetros GC-MS:
Temperatura inicial do forno: 60 °C mantida por 1 minuto.
Programa de forno: 15 °C/minuto.
Temperatura final do forno: 280 °C, mantida por 1 minuto.
Vazão: 2,5 mL/minuto (fluxo otimizado de velocidade para uma coluna de 0,25 mm de i.d.).
Temperatura da entrada: 250 °C.
Temperatura da linha de transferência: 280 °C. - Certifique-se de que um forro de entrada SPME estreito (2 mm ou menos) tenha sido colocado dentro da entrada GC.
- Certifique-se de que a fibra SPME PDMS/DVB foi devidamente condicionada e está em bom estado de funcionamento antes da análise.
NOTA: As fibras PDMS/DVB SPME devem ser condicionadas na entrada gc a 250 °C por 30 minutos. As fibras PDMS/DVB SPME devem ser de cor off-white. - Execute o GC-MS na amostra.
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Representative Results
Foi realizado um estudo de volume GBL para demonstrar a sensibilidade da TV-SPME em comparação com o headspace e a imersão SPME. Uma amostra de 100ppmv de GBL na água foi preparada e colocada em frascos de headspace de 20 mL com volumes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 e 10.000 μL. A razão de fase das amostras permitida para TV-SPME (1-3 μL), Headspace SPME (10 – 3.000 μL) e Imersão SPME (10.000 μL). Todas as amostras foram analisadas em triplicado e a área média de pico foi traçada em relação ao volume amostral. No geral, os volumes amostrais que permitiram a TV-SPME demonstraram mais sensibilidade do que o espaço para cabeça ou spme de imersão para GBL em água, como mostrado na Figura 2. Uma comparação dos cromatógrafos para cada método é mostrada na Figura 3.
Figura 2: Gráfico da área média de pico versus volume amostral para GBL na água. Foi realizado um estudo de volume GBL para demonstrar a eficácia da TV-SPME em comparação com o headspace e a imersão SPME. Uma amostra de 100ppmv de GBL na água foi preparada e colocada em frascos de headspace de 20 mL com volumes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, e 10000 μL. Todas as amostras foram analisadas em triplicados e as barras de erro correspondem ao desvio padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cromatogramas de íons totais para GBL na água. (100 ppm) para 3 μL (azul), 300 μL (vermelho) e 10.000 μL (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Amostras realistas de vinho cravadas com uma dose eficaz de GHB e GBL são mostradas na Figura 4 e Figura 5, respectivamente. Essas amostras também mostram a interconversão de GBL e GHB. Quando a TV-SPME for executada corretamente, um pico acentuado e abundante resultará como mostrado na Figura 6. A TV-SPME tem boa sensibilidade e, portanto, as concentrações adequadas devem ser usadas para não sobrecarregar a coluna. Quando altas concentrações estiverem presentes, o pico de assimetria resultará como mostrado na Figura 5 e Figura 7. Nestes casos, diluir a amostra ou usar uma injeção dividida pode melhorar a forma de pico.
Figura 4: Amostra realista de GHB no vinho com concentração de 8 mg/mL. Picos: 1) GBL, 2) ácido hexanoico-TMS, 3) GHB-TMS2, 4) ácido benzóico-TMS, 5) ácido octanoico-TMS, 6) glicerol-TMS3, * denota um siloxano ciano cíclico (fibra/coluna sanricada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Amostra realista de GBL no vinho com concentração de 10 mg/mL. Picos: 1) GBL, 2) ácido hexanoico-TMS, 3) Siloxano, 4) trimetil (2-feniletoxi) silano, 5) GHB-TMS2. TIC mostra GBL convertendo em GHB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Cromatograma de íon total para GBL em água com concentração de 0,1 ppm. Resultados seguindo o método TV-SPME descrito anteriormente para GBL na água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Cromatograma de íon total para GBL em água com concentração de 10 ppm. Resultados seguindo o método TV-SPME descrito anteriormente para GBL na água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ao derivar, o analista deve garantir que o método permita que os analitos sejam totalmente derivados antes de serem desordados no GC. A derivatização parcial pode resultar em um pico representando o analito derivatizado e um pico representando o analito subivatizado. A derivatização parcial também resultará em uma menor sensibilidade para o analito, pois menos dele pode adsorbar a fibra.
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Discussion
A TV-SPME tem alguns benefícios sobre a injeção líquida GC em que grandes tamanhos de amostra (por exemplo, 100 μL) podem ser usados sem modificações de instrumentos. A TV-SPME também tem alguns dos mesmos benefícios que o HEADSpace SPME. O SPME do headspace não requer nenhuma extração ou filtragem porque quaisquer compostos não ativos permanecerão no frasco do headspace e não serão adsorvidos na fibra, produzindo uma amostra limpa. Este método também ajuda a eliminar os efeitos da matriz devido a este ser um sistema de duas fases (headspace e fibra) em oposição a um sistema trifásica (amostra, espaço para cabeça e fibra) como o SPME do headspace padrão. TV-SPME é como imersão SPME nessa imersão SPME também é um sistema de duas fases. Com a imersão SPME, uma fibra é imersa em uma amostra líquida (tipicamente aquosa) contendo o analito em vez de extrair o analito de seu vapor. TV-SPME difere da imersão SPME porque a imersão SPME requer uma matriz polar/aquosa para gerar força motriz suficiente para os analitos saírem da fase da solução e do sorb para o revestimento de fibras. Além disso, o SPME de imersão requer volumes amostrais muito maiores (por exemplo, mL).
Muitos solventes podem ser usados com TV-SPME, incluindo metanol, acetona, água e acetonitrilo. As fibras SPME não devem ser expostas ou imersas em clorofórmio, pois esses solventes podem danificar o revestimento de fibras. Vinte frascos de vidro de tampa de parafuso de 20 mL foram encontrados para ter o melhor desempenho com métodos TV-SPME. Recomenda-se o uso de um autosampler com TV-SPME. Embora muitos parâmetros do método TV-SPME possam ser ajustados conforme desejado, o volume adequado e a temperatura de extração devem ser usados para cada solvente. O volume da amostra e a temperatura de extração são proporcionais entre si e devem ser ajustados em conformidade. Por exemplo, a temperatura de extração de um método pode ser reduzida, mas o volume da amostra também deve ser reduzido. Este volume pode ser encontrado ajustando a Equação 3.
Podem ser feitas modificações no procedimento de derivatização. A derivatização pode ser realizada antes ou após a extração, à temperatura ambiente ou aquecida no agitador, expondo a fibra ao vapor do agente de derivatização ou por imersão direta da fibra no agente de derivatização.
Há limitações ao método TV-SPME, incluindo a necessidade de compostos solúveis, térmicamente estáveis e voláteis. A TV-SPME requer fibras SPME caras que podem ter seu revestimento despojado ou quebrado durante a análise. Essas limitações são superadas por benefícios como grandes volumes de amostra em relação aos volumes típicos de injeção de GC, alta sensibilidade e não necessidade de filtragem. A TV-SPME é preferida para o HEADspace SPME porque mais da amostra é extraída na fibra e os efeitos da matriz são reduzidos. TV-SPME também é preferido para imersão SPME porque a imersão SPME consome muito mais amostra do que TV-SPME. A TV-SPME permite a derivatização durante o processo de extração, o que reduz o tempo de análise em comparação com métodos como a injeção líquida que exigem que o analito seja derivado antes da injeção. A TV-SPME também requer pouca ou nenhuma preparação amostral. A TV-SPME é simples, eficiente e sensível para a análise de uma grande variedade de amostras, incluindo drogas, materiais explosivos e combustíveis de corrida.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Justiça (Prêmio nº 2015-DN-BX-K058 & 2018-75-CX-0035). As opiniões, achados e conclusões aqui expressas são do autor e não refletem necessariamente as das organizações financiados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Syringe | Gerstel | 100111-014-00 | |
| BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM) | Regis Technologies Inc. | 50442882 | |
| eVol XR Sample Dispensing System Kit | ThermoFisher Scientific | 66002-024 | |
 -Butyrolactone (GBL) |
Sigma-Aldrich | B103608-26G | |
| -Hydroxy Butyric Acid (GHB) |
Cayman Chemicals | 9002506 | |
| Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm | Restek | 23083 | |
| Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm | Restek | 23091 | |
| Optima water for HPLC | Fisher Chemical | W71 | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) | Supelco | 57341-U | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB) | Supelco | 57293-U | |
| Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner | Restek | 23313 |
References
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- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , John Wiley & Sons. (1997).
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