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Immunology and Infection

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/61881

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Abstract

Los logros tecnológicos de la proteómica cuantitativa basada en espectrometría de masas (EM) abren muchas vías no descubiertas para analizar el proteoma global de un organismo en condiciones variables. Esta poderosa estrategia aplicada a las interacciones de patógenos microbianos con el huésped deseado caracteriza ampliamente ambas perspectivas hacia la infección. En este documento, el flujo de trabajo describe la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) del infectoma de Cryptococcus neoformans, un patógeno intracelular facultativo facultativo fúngico que es el agente causal de la enfermedad mortal cryptococcosis, en presencia de células de macrófago inmortalizadas. El protocolo detalla las técnicas adecuadas de preparación de proteínas para células patógenas y mamíferos dentro de un solo experimento, lo que resulta en la presentación adecuada de péptidos para el análisis de cromatografía líquida (LC)-EM/EM. La naturaleza genérica de alto rendimiento de LFQ permite un amplio rango dinámico de identificación y cuantificación de proteínas, así como transferibilidad a cualquier entorno de infección de patógeno huésped, manteniendo una sensibilidad extrema. El método está optimizado para catalogar perfiles extensos e imparciales de abundancia de proteínas de un patógeno dentro de condiciones que imitan infecciones. Específicamente, el método demostrado aquí proporciona información esencial sobre la patogénesis C. neoformans, como la producción de proteínas necesaria para la virulencia e identifica proteínas huésped críticas que responden a la invasión microbiana.

Introduction

La prevalencia de infecciones fúngicas invasivas está aumentando enormemente y está correlacionada con tasas de mortalidad inaceptablemente altas, más comúnmente notificadas en individuos con predisposiciones inmunodeficientes1. Cryptococcus neoformans es un famoso patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivir intracelularmente dentro de las células de macrófago huésped. La intervención antifúngica inadecuada da como resultado la difusión fúngica y manifestaciones potencialmente mortales de meningitis criptocócica y meningoencefalitis2,3. El aumento global del estatus inmunodeprimido ha exigido un aumento paralelo en el uso de agentes antifúngicos, en el que muchas especies fúngicas, incluyendo C. neoformans, han evolucionado cada vez más la resistencia hacia4,5,6. Por lo tanto, es imperativo implementar tecnologías sólidas y eficientes para responder a preguntas biológicas vitales con respecto a la respuesta de la defensa del huésped y la patogénesis microbiana.

La nueva era del avance tecnológico en espectrometría de masas (EM), incluida la generación de potentes tuberías computacionales y bioinformáticas, proporciona la base para una visión integrativa para el análisis a gran escala de la investigación de patógenos de host7,8. El análisis proteómico convencional impulsado por patógenos comúnmente perfila la vista de la infección desde la perspectiva del huésped o patógeno, incluyendo metodologías integrales tales como perfiles de correlación de proteínas, cromatografía de afinidad combinada con proteómica e interactómica9. Las investigaciones sobre la virulencia de patógenos peligrosos en un sistema huésped son de inmensa importancia clínica; sin embargo, la aplicación de un análisis de doble perspectiva en un solo experimento se consideraba antes inalcanzable. Por ejemplo, la perspectiva del patógeno hacia la infección a menudo se desborda por proteínas huésped altamente abundantes, lo que resulta en una sensibilidad reducida para la detección de proteínas fúngicas de baja abundancia7. Además, la alta complejidad de la muestra invita a muchos objetivos a investigar en un solo sistema experimental y resulta difícil de dilucidar los mecanismos de acción para una proteína patógena específica.

La proteómica ascendente es una técnica popular de EM que permite la preparación manejable de muestras, en la que los péptidos se generan mediante digestión enzimática específica de la secuencia seguida de separación, identificación y cuantificación de cromatografía líquida por MS10,11. Aquí, presentamos un método que demuestra una estrategia de adquisición dependiente de los datos con el propósito de lograr una cobertura imparcial de un proteoma o 'infectoma' basado en infecciones. En concreto, la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) arroja la dependencia de las etiquetas químicas o metabólicas para una identificación robusta y precisa de los cambios en el nivel de proteínas en múltiples proteomas, reduciendo la manipulación y el procesamiento de muestraspasos 12,13. Esta aplicación universal interroga las proteínas producidas en un momento dado dentro de una célula independientemente de cualquier producción de proteína esperada; por lo tanto, se pueden descubrir nuevos conocimientos que son críticos para la infección.

El flujo de trabajo descrito aquí está optimizado para explorar los cambios en el nivel de proteínas de C. neoformans durante las condiciones de imitación de infecciones con células inmunes huésped (Figura 1). En lugar de basarse en el aislamiento y separación de los tipos celulares, este enfoque extrae el proteoma huésped y patógeno juntos, y utiliza la separación bioinformática utilizando dos bases de datos específicas del organismo para distinguir la producción de proteínas específicas de especies. Este método ofrece ventajas para un número ilimitado de muestras que se procesarán sin los costosos pasos de preparación necesarios en estudios de etiquetado o fraccionamiento basados en isótopos. Además, este flujo de trabajo admite protocolos optimizados de extracción de proteínas transferibles a una amplia gama de patógenos fúngicas y bacterianos capaces de atacar e infectar las células inmunes huésped. En general, este protocolo describe los pasos para completar una extracción de proteínas imparcial y procesamiento de muestras para EM de alta resolución, seguido de datos y análisis estadísticos, capaces de proporcionar una gran cantidad de conocimiento de proteínas fúngicas significativas para la infección combinadas con un perfil integral de la respuesta de defensa del huésped.

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Protocol

Una línea inmortalizada de macrófagos derivados de ratones BALB/c fueron utilizados para el siguiente protocolo aprobado por el Protocolo de Utilización Animal 4193 de la Universidad de Guelph. En particular, otras cepas de ratones u otras fuentes de células inmortalizadas se pueden aplicar al protocolo descrito con pruebas suficientes para optimizar los parámetros detallados. El siguiente protocolo navegará por los pasos que comienzan con un vial congelado de células de macrófago. Las células se almacenan en 10% FBS (suero bovino fetal), 1% L-glutamina y 5% Pen/Estreptomicina (Penicillin-Streptomicina) mezcla a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) y 20% DMSO (sulfóxido de dimetil).

1. Cultivo de C. neoformans

  1. Usando una caldo de glicerol, cola de agar de tipo salvaje C. neoformans (H99) sobre peptona dextrosa de extracto de levadura (YPD) para aislar colonias individuales.
  2. Incuba durante la noche durante 16 h a 37 °C en una incubadora estática.
  3. Seleccione una sola colonia de cepa y cultivo de neoformanos de tipo C. en 5 ml de caldo YPD en un tubo de ensayo de 10 ml ligeramente tapado. Actuar en cuadrúplicado.
  4. Incuba durante la noche durante 16 h a 37 °C en una incubadora de temblores a 200 rpm.
  5. Al día siguiente subcultura cada cultura durante la noche en una dilución de 1:100 en caldo YPD de 3 ml.
  6. Mida los valores de densidad óptica (OD600nm)de la referencia cultural fúngica para determinar la fase de registro medio. Dependiendo del espectrofotómetro, la cepa de tipo salvaje C. neoformans alcanza la fase de registro medio comúnmente después de la incubación de 6 a 8 h en YPD con valores generales de OD600nm que van de 1.0 a 1.5.
  7. Una vez que las células lleguen a la fase de registro medio, tome una alícuota de 10 μL de suspensión de células fúngicas en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml y diluya 1:100 en solución salina estéril de 1x fosfato amortiguado (PBS). Cuente el número de células usando un hemociclo.

2. Cultivo de células de macrófago

NOTA: Asegúrese de que el entorno de trabajo esté esterilizado antes del trabajo de cultivo celular.

  1. Preparación del medio de cultivo celular
    1. Medio suplementado con antibióticos: Añadir 10% FBS (suero bovino fetal), 1% L-glutamina y 5% Pen/Estreptococo (Penicilina-Estreptomicina) mezcla a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filtre el medio a través de un sistema de filtro completo de 0,2 μm y guárdelo a 4 °C.
    2. Medio libre de antibióticos: Siga el protocolo idéntico pero omita la mezcla de pluma/estreptococo.
  2. Células de macrófago de siembra
    NOTA: El medio suplementado con antibióticos (2.1.1.) debe calentarse a 37 °C antes del trabajo de cultivo celular.
    1. Descongelar el vial de las células del macrófago rápidamente en el baño de cuentas a 37 °C.
    2. Lave las células de la solución de congelación resuspendiendo las células en un medio con antibióticos de 1 ml.
      NOTA: Se requiere precaución adicional para garantizar que las células no selicen debido a la tubería dura.
    3. Transfiera las células resuspendidas a un tubo estéril de 15 ml.
    4. Células de pellets centrifugando a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica o aspirador al vacío.
    6. Pellet suavemente resuspend en 10 ml de medio suplementado con antibióticos.
    7. Pipeta suavemente resuspended células en un plato tratado con cultivo celular de 60 x 15 mm.
    8. Incubar el plato a 37 °C con un 5% de CO2 durante la noche.
  3. Paso inicial de células de macrófago
    NOTA: Las poblaciones de células congeladas normalmente contendrán entre 5 y 10 millones de células por vial (aprox. 1 ml). El día siguiente, las células de macrófago que han sobrevivido al protocolo de siembra se adherirán a la parte inferior del plato de cultivo celular y estarán listas para la transferencia.
    1. Medio caliente suplementado con antibióticos (paso 2.1.1) a 37 °C antes del trabajo de cultivo celular. Asegúrese de que el entorno de trabajo esté esterilizado antes del trabajo de cultivo celular. Visualice las células utilizando un microscopio de luz para garantizar que las células se cumplan y estén sanas.
    2. Retire el medio de cultivo celular del plato, ya sea con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
    3. Agregue suavemente 5-7 ml de PBS estéril a temperatura ambiente (solución salina amortiguada por fosfato) al plato de 60 x 15 mm.
    4. Incline suavemente el plato para lavar las células adherentes.
    5. Retire PBS con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
    6. Añadir 1 ml de PBS frío (almacenado a 4 °C) a las células, inclinar el plato para distribuir PBS sobre todas las células, y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
    7. Libere las células tocando suavemente el plato, pipeteando PBS frío contra las células, o usando un raspador de células.
    8. Agregue 9 ml de medio con antibióticos al plato.
    9. En un nuevo plato de 60 x 15 mm, agregue 9 ml de medio recién complementado con antibióticos y 1 ml de células resuspended del plato original.
    10. Una vez que se ha llenado el número de placas de passaging deseadas, se pueden descartar las células resuspended del plato original.
    11. Incubar el nuevo plato en los ajustes mencionados anteriormente (paso 2.2.8).
    12. Realice la passaging posterior cuando las células hayan alcanzado el 70-80% de confluencia (aproximadamente cada 2 días dependiendo de la línea celular y el medio utilizados).
      NOTA: Las células de macrófago deben pasarse un mínimo de cinco veces antes de los experimentos de infección. Dependiendo de la línea celular, los experimentos de infección deben realizarse por 25 a 30 pasajes. Después de 25 a 30 pasajes, las células deben congelarse o desecharse. La sección 2.4 o 2.5 se puede elegir en función de los planes experimentales. La sección 2.4 se utilizará para las siguientes secciones.
  4. Semillas de células de macrófago antes de la infección
    1. Realice los pasos del protocolo de passaging 2.3.1 a 2.3.7.
    2. El uso de un hemocítómetro o contador de células automatizado determina la densidad celular (células/ml).
    3. Transfiera 0,3 x10 6 células de macrófago a un solo pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos.
    4. Ajuste el volumen total de pozo a 1 ml utilizando medio suplementado con antibióticos (paso 2.1.1).
    5. Repita los pasos 2.4.3 y 2.4.4 hasta que se hayan llenado 8 pozos (4 pozos llenos en dos placas separadas).
    6. Opcionalmente, llene los dos pozos restantes con 1 ml de PBS a temperatura ambiente para mantener los niveles de humedad durante la incubación.
    7. Permitir que las células crezcan en condiciones de incubación mencionadas en el paso 2.2.8 para 2 d antes de la infección.
  5. Sembrar células de macrófago el día de la infección
    1. Realice los pasos del protocolo de passaging 2.3.1 a 2.3.7.
    2. El uso de un hemocítómetro o contador de células automatizado determina la densidad celular (células/ml).
    3. Semillas 1.2 x 106 células de macrófago en un solo pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos.
    4. Ajuste el volumen total de pozo a 1 ml utilizando medio suplementado con antibióticos (2.1.1).
    5. Repita 2.4.3 y 2.4.4 hasta que se hayan llenado 8 pozos (4 pozos llenos en dos placas separadas).
    6. Opcionalmente, llene los dos pozos restantes con 1 ml de PBS a temperatura ambiente para mantener los niveles de humedad durante la incubación.
    7. Incubar células en condiciones mencionadas en el paso 2.2.8 para 3 h para permitir que las células se adhieran a los pozos.

3. Infección de células de macrófago con C. neoformans

NOTA: Al alcanzar un 70-80% de confluencia, habrá aproximadamente 1,2 x 106 células de macrófago por pozo. Para lograr la multiplicidad deseada de infección (MOI) de 100:1, se requieren 1,2 x 108 células fúngicas para cada reacción. Las culturas deben establecerse en consecuencia en cuadruplicato biológico.

DESCARGO DE RESPONSABILIDAD: Un MOI de 100:1 ha logrado resultados deseables en nuestro grupo de investigación y está destinado como una sugerencia a los lectores. Puede ser necesario un MOI más bajo para cepas más infecciosas de C. neoformans o para líneas celulares de macrófago menos resistentes. La verificación de la infección (sección 3.5) se puede utilizar para determinar el MOI ideal para determinados C. neoformans – combinaciones de macrófago.

  1. Preparación de células fúngicas
    1. Siga el paso 1 para el crecimiento de C. neoformans a la fase de registro medio.
    2. Recoger y centrifugar células a 1.500 x g durante 10 minutos, lavar suavemente pellet con PBS estéril a temperatura ambiente, y repetir para un total de tres lavados.
    3. Células resuspend en medio de cultivo celular libre de antibióticos (paso 2.1.2) para lograr una concentración de 1,2 x 108 células/ml.
  2. Preparación de células de macrófago
    1. Visualice cada pozo en la placa de 6 pozos para asegurarse de que las células han alcanzado el 70-80% de confluencia. Alternativamente, las células se pueden medir para lograr aproximadamente 1,2 x 106 células de macrófago por pozo.
    2. Siga los pasos 2.3.1 a 2.3.4.
  3. Co-cultivo de C. neoformans y células de macrófago
    1. Agregue 1 ml de las células C. neoformans resuspended (paso 3.1.3) a 4 pozos que contengan células de macrófago preparadas en la sección 3.2.
      NOTA: El número de placas necesarias deberá calcularse antes de comenzar el experimento. Añadir 1 ml de medio libre de antibióticos (paso 2.1.2) a pozos vacíos.
    2. Permitir que las células se incuban en condiciones enumeradas (paso 2.2.8) durante 3 h.
    3. Retire el medio de cultivo celular de la placa con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
    4. Agregue suavemente 1 ml de PBS estéril a temperatura ambiente.
    5. Incline suavemente la placa para lavar las células extracelulares C. neoformans no unidas o no fagocitos.
    6. Retire PBS usando una pipeta serológica o aspirador al vacío, repita para un total de tres lavados. Repita 3.3.4 a 3.3.5 dos veces más.
  4. Macrófagos no infectados
    1. Del mismo modo, utilice 4 pozos de una placa de 6 pozos para servir como muestras solo de macrófago. Añadir 1 ml de medio libre de antibióticos (paso 2.1.2) a estos pozos.
    2. Repita los pasos del 3.3.2 al 3.3.6.
  5. Verificación de la infección
    NOTA: Utilizando un ensayo de citotoxicidad, se puede medir el dominio de la infección. El siguiente protocolo destacará la aplicación de un producto de citotoxicidad para medir la liberación de LDH (lactato deshidrogenasa). También se pueden utilizar otros productos de citotoxicidad.
    1. Preparación de la infección de C. neoformans de células de macrófago
      1. Repite los pasos 1, 2 y 3 (hasta 3.5). El ensayo LDH se puede realizar en triplicado, si se prefiere.
      2. Siguiendo el paso 3.3.6, agregue 1 ml de medio libre de antibióticos (2.1.2) a cada pozo en la placa de 6 pozos.
      3. Repita los pasos 2.4.3 y 2.4.4 hasta que se hayan llenado 3 pozos más 3n pozos (donde n es el número de puntos de tiempo medidos).
      4. Incubar células en condiciones enumeradas en el paso 2.2.8.
      5. En los puntos de tiempo seleccionados (por ejemplo, 1, 3, 6, 12 y 24 horas) recoger sobrenadante para la medición de la liberación de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante
      6. Al mismo tiempo, las células de macrófago no infectadas se usarán a un valor determinado para la citotoxicidad máxima.
      7. Calcule la citotoxicidad de la siguiente manera:
        Equation 1

4. Colección de muestras

  1. Co-cultura y colección de macrófago no infectado
    1. Añadir 1 ml de PBS frío a las células (de 3.3.6 y 3.4.2) y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min.
    2. Libere las células de la placa tocando suavemente la placa o canalizando suavemente pbs frío contra las células.
      NOTA: El raspador de células debe evitarse, ya que esto podría causar lisis de las células.
    3. Pipeta resuspended células en un tubo de 15 ml.
    4. Centrífugas a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y retire el sobrenadante.
    5. Células de proceso (como se detalla en el paso 5) inmediatamente o flash congelado en nitrógeno líquido y almacenado a -80 °C para su procesamiento posterior.

5. Proteoma celular

NOTA: Se debe optimizar suficiente lisis para el tipo de célula analizado (es decir, la cantidad de ciclos y amplitudes depende del tamaño del pellet celular y del porcentaje de potencia del modelo sonicador de sonda).

  1. Lisis celular de macrófago infectada
    1. Células peletadas resuspend (paso 4.1.5) en 300 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) que consiste en un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa recién disuelto.
      NOTA: Un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa se añade a 10 ml de frío helado 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) antes de comenzar el experimento.
    2. Sondear células sonicadas en un baño de hielo durante 15 ciclos de 30 s encendidos y 30 s apagados, para liar las células.
    3. Células centrífugas brevemente para 30 s a 400 x g,cuidado de no formar un pellet, sólo para eliminar líquido en los lados de los tubos seguido de la transferencia de la muestra a un tubo de microcentrífuga lo-bind de 2 ml.
    4. Añadir 1:10 volumen de 20% SDS a una concentración final de 2%.
    5. Añadir 1:100 volumen de 1 M dithiothreitol (TDT) a una concentración final de 10 mM y mezclar la muestra a fondo mediante pipeteo, seguido de incubación en un bloque de calefacción térmica a 95 °C durante 10 minutos a 800 rpm de agitación. A continuación, frío a temperatura ambiente (el enfriamiento se puede hacer en hielo).
    6. Añadir 1:10 volumen de 0.55 M iodoacetamida (IAA) para obtener una concentración final de 55 mM y mezclar la muestra a fondo por pipeteo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos.
    7. Añadir 100% acetona para obtener una concentración final de acetona del 80% y almacenar la muestra durante la noche a -20 °C para precipitar proteínas.
  2. Digestión de proteínas
    1. Al día siguiente, recoger el pellet precipitado por centrifugación durante 10 minutos a 10.000 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 500 μL de acetona al 80%. Repita para un total de dos lavados. Pellet seco al aire a temperatura ambiente después de los lavados.
    2. Resolubilizar pellet proteico en 100 μL de 8 M urea/40 mM HEPES, para asegurar una solubilización completa, vórtice o sonicato en un baño de agua helada durante 15 ciclos de 30 s encendido y 30 s de descuento.
      NOTA: El ajuste del volumen de urea/HEPES se determina en el tamaño del pellet de celda precipitado, si se producen alteraciones todos los volúmenes aguas abajo deben ajustarse adecuadamente.
    3. Cuantifique la concentración de proteínas utilizando un ensayo proteico (por ejemplo, ensayo proteico BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y ajuste para la medición de fondo mediante la normalización en blanco con HEPES de 8 M urea/40 mM.
    4. Añadir 300 μL de bicarbonato de amonio de 50 mM para obtener una concentración final de 2 M de urea.
      NOTA: Oportunidad de normalizar la concentración de proteínas para mediciones aguas abajo, sugerida para digerir 100 μg de proteína y almacenar la muestra no digerida restante por congelación repentina en nitrógeno líquido y luego almacenar a -20 °C a corto plazo, o a -80 °C para largo plazo.
    5. Añadir 2:50 (v/w) relación enzima-proteína de la mezcla de trippsina /Lys-C proteasa en hielo y suavemente toque tubo para mezclar, incubar durante la noche a temperatura ambiente.
    6. Después de la incubación, detenga la digestión añadiendo 1:10 solución de parada de volumen (20% acetonitrilo, 6% ácido trifluoroacético) y muestras de centrífuga a 10.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    7. Recoger sobrenadante(consta de péptidos digeridos)y desechar cualquier residuo peletado o precipitarse.
  3. Desalting peptídica
    1. Active una punta de extracción C18 Stop And Go (STAGE) (que consiste en 3 capas de resina C18 en una punta de pipeta de 200 μL) añadiendo 100 μL de acetonitrilo al 100% y centrífuga a 1.000 x g durante 2 minutos.
    2. Equilibrar la punta C18 STAGE añadiendo 50 μL de acetonitrilo buffer B (80% (v/v), ácido acético del 0,5% (v/v) ) y centrífuga a 1.000 x g durante 2 minutos.
    3. Eequilibrar la punta C18 STAGE añadiendo 200 μL de acetonitrilo buffer A (2% (v/v), ácido trifluoroacético del 0,1% (v/v), ácido acético del 0,5% (v/v) y centrífuga a 1.000 x g durante 3-5 minutos.
    4. Añadir ~ 50 μg de muestra digerida en la punta C18 STAGE y centrífuga a 1.000 x g durante 3-5 minutos, o hasta que la muestra haya pasado a través de la columna de giro. Flash congelar la muestra digerida restante en nitrógeno líquido y almacenar a -20°C, hasta que sea necesario.
    5. Lave la punta C18 STAGE con 200 μL de buffer A y centrífuga a 1.000 x g durante 3-5 min.
    6. Añadir 50 μL Buffer B a la punta C18 STAGE y centrífuga a 500 x g durante 2 min. Recoger péptidos elutados en tubos PCR de 0,2 ml.
    7. Seque los péptidos elutados en una centrífuga de vacío durante 30-40 minutos a la velocidad máxima. Las muestras completamente secas pueden almacenarse a temperatura ambiente o a -20 °C hasta que se procesen.
      NOTA: Péptidos secos y desalados son envíos de muestras apropiados a instalaciones de espectrometría de masas para su procesamiento y pueden enviarse a temperatura ambiente.

6. Espectrometría de masas

  1. Reconstituir péptidos en 10 μL Buffer A y medir la concentración necesaria para inyectar ~1.5 a 3 μg péptidos en la columna MS. La cantidad de muestra dependerá de la instrumentación.
  2. Utilice un gradiente predeterminado de acetonitrilo (aprox. 5-60 %) 0,5% de ácido acético durante el tiempo deseado (por ejemplo, 2 h) para separar péptidos por cromatografía líquida de alto rendimiento, seguido de ionización de electrospray en el espectrómetro de masas.
  3. Adquiera exploraciones de EM utilizando un espectrómetro de masa de alta resolución en modo de adquisición dependiente de datos(m/z 300 a 1650).
    NOTA: El porcentaje de degradado y la longitud están determinados por el experimento y el usuario. La configuración precisa del espectrómetro de masa depende de la instrumentación, el experimento y la preferencia del usuario.

7. Análisis de datos

NOTA: Los datos de MS se pueden procesar con numerosas canalizaciones bioinformáticas. En este protocolo, describimos el procesamiento utilizando las plataformas MaxQuant y Perseus disponibles públicamente, pero recomendamos a los usuarios individuales que evalúen las herramientas bioinformáticas adecuadas para el análisis, la preferencia y el uso.

  1. Cargue archivos de datos no procesados (directamente desde el instrumento MS) mediante el software MaxQuant. Identificar proteínas bajo los parámetros de búsqueda maxquant modificados; mínimo de dos péptidos únicos necesarios para la identificación de proteínas utilizando un enfoque de señuelo objetivo para una tasa de descubrimiento falsa del 1%, implementar la cuantificación libre de etiquetas con la coincidencia entre corridas, incorporar el archivo FASTA de organismos obtenido de la base de datos UniProt (es decir, Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus)para identificar y cuantificar los péptidos actuales con el motor de búsqueda de Andrómeda. Consulte las herramientas públicas en línea de MaxQuant para obtener tutoriales detallados (consulte Tabla de materiales).
  2. Cargue el archivo de salida MaxQuant ('proteingroups.txt') en Perseus.
  3. Filtre filas que contengan posibles falsos positivos y contaminantes, así como solo modificadas por péptidos de sitio con el 'Filtrar filas basadas en columna categórica'.
  4. Transforme los valores de datos en la escala del registro2.
  5. Cree grupos de conjuntos de datos proporcionando anotación categórica a las filas.
  6. Filtre el dataset por valores válidos para definir un corte para la detección de proteínas.
    NOTA: Para un análisis riguroso y robusto se sugiere una tasa de identificación del >50%. Por ejemplo, si se procesaran cuatro réplicas, se seleccionaría un número mínimo de tres valores válidos.
  7. Si es preferible, impute los datos reemplazando los valores que faltan de la distribución normal.
    NOTA: Los valores imputados están optimizados en función de la distribución normal y proporcionan una intensidad aleatoria de LFQ para reemplazar los marcadores de posición 'NaN' para simular mediciones de abundancia típicas. Esta imputación proporciona una plataforma para el análisis estadístico descendente que requiere datos cuantificables.
  8. Añadir anotaciones a las filas de proteínas (por ejemplo, nombres de proteínas, términos de ontología génica).
    NOTA: Este flujo de trabajo de Perseus generado es ahora un marco sólido para el procesamiento bioinformática adicional, el análisis estadístico y la visualización de datos, consultar herramientas públicas en línea de Perseus para tutoriales detallados (consulte Tabla de materiales).

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Representative Results

El protocolo descrito anteriormente permite la identificación y cuantificación de proteínas derivadas tanto del patógeno fúngico, C. neoformans,como del huésped, células de macrófago, en un solo experimento. Tras el co-cultivo, las células se recogen y procesan juntas y se separan bioinformáticamente en función de perfiles péptidos específicos de cada especie. Este es un enfoque poderoso para definir la interacción de la relación huésped-patógeno durante la infección. El número de proteínas identificadas a partir del experimento depende del material inicial, la preparación de muestras, la longitud del gradiente, la instrumentación de EM y el flujo de trabajo bioinformática. Usando el protocolo descrito en este documento, normalmente, identificamos aproximadamente 8.000 proteínas del experimento con 1.500 proteínas neoformas C. y 6.500 proteínas huésped. Tras el procesamiento de los conjuntos de datos, generamos una gráfica de análisis de componentes principales (PCA) para observar factores críticos que impulsan nuestro análisis (Figura 2A). Aquí observamos que el mayor componente de separación entre los datos está infectado frente a muestras no infectadas, como anticiparíamos del diseño experimental (componente 1, 79,8%), y una segunda característica distintiva de las muestras es la variabilidad biológica (componente 2, 5,7%). A continuación, una correlación de Pearson combinada con la agrupación en clústeres jerárquicos por distancia euclidiana agrupa las muestras y permite cuantificar la variabilidad entre las réplicas (Figura 2B). En nuestro análisis, observamos una agrupación distinta de muestras infectadas frente a muestras no infectadas y replicamos reproducibilidad que oscila entre el 95 y el 96%, lo que representa una buena reproducibilidad entre las réplicas. Por último, realizamos la prueba t-testde un estudiante corregida para múltiples pruebas de hipótesis utilizando una tasa de descubrimiento falso Benjamini-Hochberg (FDR) (p-valor ≤ 0.05; FDR = 0,01; s0 = 1) para identificar proteínas con diferencias significativas en la abundancia durante la infección en comparación con los controles no infectados (Figura 2C). Aquí, identificamos 760 proteínas con cambios significativos en la abundancia, incluyendo 117 proteínas huésped con 86 mostrando una disminución significativa y 31 mostrando un aumento significativo de la infección. En particular, también observamos aumentos significativos en la abundancia de proteínas fúngicas, como se esperaba durante la infección. Con estos datos, se realizan análisis posteriores, incluyendo mapeo de red, caracterización silico y experimentos de seguimiento para validar los datos y explorar los mecanismos moleculares que sustentan la respuesta del anfitrión a la virulencia.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis de macrófagos infectados con C. neoformansEl flujo de trabajo comienza con la recopilación de macrófagos infectados con C. neoformans o controles no infectados. Las proteínas se extraen por alteración mecánica y química, seguidas de la reducción y alquilación, la precipitación de acetona y la digestión enzimática. Los péptidos se purifican en puntas C18 STAGE, separadas por cromatografía líquida de alto rendimiento, sometidas a ionización por electrospray y medidas en un espectrómetro de masa de alta resolución. Los datos se procesan, analizan y visualizan en las plataformas bioinformáticas disponibles públicamente, MaxQuant (con Andrómeda) y Perseo14,15,16. Experimentos realizados en cuatriplicato biológico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Datos representativos de la infección por C. neoformans de células de macrófago. (A) El análisis de componentes principales demuestra la distinción entre el macrófago infectado frente al macrófago no infectado (componente 1, 79,8%) y la agrupación de réplicas biológicas (componente 2, 5,7%). B) Mapa de calor de la correlación de Pearson trazado por la agrupación jerárquica por distancia euclidiana para mostrar la agrupación de muestras (infectadas frente a no infectadas) y replicar la reproducibilidad (>95%). (C) Parcela volcánica de proteínas identificadas. Azul = proteínas fúngicas con cambios significativos en la abundancia; negro = proteínas de macrófago con cambios significativos en la abundancia. T -testdel estudiante (p-value ≤ 0.05), FDR = 0.01; s0 = 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de células de macrófago y la recolección de muestras de co-cultivo para el procesamiento de proteínas con una interrupción mínima de las células. Es importante realizar pasos de lavado, inoculación y eliminación de células de macrófago adherentes de forma suave y cuidadosa para evitar la lisis innecesaria de las células antes de la recolección. Establecer el MOI correcto para el experimento también es crítico, ya que la inoculación con un MOI excesivamente alto puede causar muerte rápida de células de macrófago y dificultades en la recolección y procesamiento de muestras para la EM. Por el contrario, los bajos números de MOI conducirán a menos células fúngicas fagocitos y a la detección limitada de proteínas fúngicas en el sistema biológico. Para superar estas limitaciones, recomendamos realizar experimentos de prueba con diferentes IVM, apoyados por ensayos de muerte celular (por ejemplo, cuantificación de LDH) para definir el número de células fúngicas que inician una respuesta de host pero no matan las células huésped antes de la recolección. Para los experimentos, nuestro objetivo es identificar proteínas fúngicas asociadas a infecciones, que requieren un MOI alto (100:1) para detectar adecuadamente proteínas fúngicas entre proteínas huésped altamente abundantes. Realizamos rutinariamente ensayos de citotoxicidad de macrófago para evaluar el impacto del MOI en la muerte de la célula huésped antes de realizar todo el experimento. El tiempo de incubación de células de C. neoformans con macrófagos también es crucial, ya que las células fúngicas pueden poseer grandes cápsulas de polisacáridos y, por lo tanto, el macrófago requiere más tiempo para el engullimiento. Seleccionamos utilizar un tiempo de incubación de co-cultura de 3 h para el experimento descrito, ya que encontramos una buena cobertura del proteoma fúngico en este momento y para proporcionar un 'snap-shot' de respuesta del anfitrión; sin embargo, los investigadores pueden desear explorar los puntos de tiempo anteriores y posteriores y observar cómo el tiempo afecta la producción de hongos y proteínas huésped. Alternativamente, se ha realizado el cebado del macrófago para la opsonización para ayudar al proceso fagocítico17,18.

Para la recolección de muestras, si las muestras no se procesan inmediatamente la congelación repentina en nitrógeno líquido ayudará a prevenir la degradación no deseada de las proteínas por proteasas presentes en las muestras. Además, para los análisis proteómicos basados en LA, el potencial de contaminación por polvo o queratina (por ejemplo, células de la piel y el cabello) debe limitarse mediante el uso de guantes de nitrilo, batas de laboratorio y lavado de todas las superficies con 70% de etanol antes de comenzar los experimentos. Además, los protocolos descritos anteriormente son específicos del conjunto de muestras de co-cultivo descrito, pero se pueden modificar para la optimización del flujo de trabajo de extracción de proteínas, según sea necesario19,20. Las oportunidades para modificar el flujo de trabajo y optimizar para tipos de células específicos incluyen las técnicas de interrupción mecánica y química seleccionadas, la duración y temperatura de la digestión enzimática y la separación de las muestras. Por ejemplo, la lisis de las células C. neoformans se realiza típicamente mediante la paliza mecánica de cuentas; sin embargo, hemos observado una mayor cobertura de proteoma después de la sonicación de la sonda y por lo tanto, recomendarlo para la interrupción mecánica de las células infectadas19,21,22. Por ejemplo, fraccionar muestras de péptidos en alícuotas por cromatografía de alto pH o exclusión de tamaño puede reducir la complejidad de la muestra y mejorar la profundidad de cobertura en el espectrómetro demasas 9. Además, para lograr la profundidad de cobertura para identificar aproximadamente 8.000 proteínas huésped y fúngica, se requiere un sistema de espectrometría de masas de alta resolución (por ejemplo, QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).

El uso de LFQ para cuantificar los cambios en los niveles de proteínas durante la infección es un enfoque fiable y rentable para la proteómica basada en LA12. Permite cuantificar las proteínas por abundancia relativa sin necesidad de pasos adicionales de procesamiento de muestras. Además, el análisis se realiza después de la finalización del experimento, prestándose a aplicaciones universales y un diseño de estudio flexible. Sin embargo, las limitaciones de LFQ incluyen un mayor tiempo de instrumentación, ya que las muestras deben ejecutarse secuencialmente y no se pueden combinar, la comparabilidad entre muestras puede ser difícil y la necesidad de imputación para reemplazar los valores que faltan puede ser alta23. Los enfoques alternativos para cuantificar la abundancia de proteínas incluyen técnicas metabólicas (por ejemplo, etiquetado estable de isótopos de aminoácidos en el cultivo celular) y técnicas de etiquetado químicas (por ejemplo, etiquetas de masa tándem), que permiten combinar muestras para reducir el tiempo de los instrumentos, proporcionar una comparabilidad confiable entre las muestras, y comúnmente conducir a valores menos perdidos24,25. Sin embargo, estos enfoques requieren pasos adicionales de manejo y procesamiento de muestras, mayor complejidad y tiempo de los experimentos de laboratorio húmedo, así como requerir un diseño experimental fijo. Para elegir un método de cuantificación óptimo para los experimentos propuestos, los usuarios deben considerar el diseño del estudio y la comparabilidad de las muestras, la complejidad del laboratorio húmedo y el análisis de datos, así como la disponibilidad y el costo del tiempo de instrumentación.

La novedad del protocolo presentado es la capacidad de definir cambios en el proteoma desde las perspectivas huésped y patógeno en un solo experimento. La profundidad de cobertura de ambos proteomas permite una nueva visión de cómo el patógeno inicia la infección y cómo el huésped responde en defensa. En particular, el enfoque se centra en la infección de toda la célula; sin embargo, existen oportunidades para definir subprotemas o respuestas compartimentadas a la infección mediante la combinación con técnicas de localización espacial (por ejemplo, centrifugación, enriquecimiento, etiquetado)26,27. Aquí, detallamos la interacción entre los macrófagos y el patógeno fúngico, C. neoformans; sin embargo, el enfoque es universal y puede aplicarse a las interacciones entre una amplia gama de sistemas biológicos. Por ejemplo, recientemente utilizamos un flujo de trabajo similar para descubrir respuestas generales y específicas del sitio de neutrófilos derivadas de un modelo murino de queratitis ocular28,29,30. Además, los conjuntos de datos infectómicos generados a partir de este Protocolo se pueden integrar con proteoma in vitro y perfilado secretome de un patógeno para detectar proteínas con abundancia alterada en presencia de células huésped. Estas proteínas, conocidas como proteínas asociadas a la infección, proporcionan una plétora de factores de virulencia conocidos y novedosos para una mayor caracterización, incluyendo la regulación temporal, la localización y las interacciones directas proteína-proteína con el huésped. En general, el flujo de trabajo proteómico basado en EM descrito proporciona una nueva oportunidad para investigar la intrincada relación entre el huésped y el patógeno en un solo experimento con universalidad y comprensión que no está comúnmente disponible.

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Disclosures

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Dr. Jonathan Krieger de Bioinformatics Solutions Inc. por operar el espectrómetro de masas para experimentos representativos, así como a los miembros del grupo Geddes-McAlister por su ayuda con la configuración experimental y la retroalimentación manuscrita. Los autores reconocen el apoyo a la financiación, en parte, de la Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), y la Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) para J.G.M., así como NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., y Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

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References

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Inmunología e infección Número 164 Proteómica basada en espectrometría de masas cuantificación libre de etiquetas interacciones huésped-patógeno cultivo celular de mamíferos patógeno fúngico Cryptococcus neoformans
Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento
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Ball, B., Sukumaran, A., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (164), e61881, doi:10.3791/61881 (2020).

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