Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/61881
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

Summary

هنا، نقدم بروتوكولاً لتقديم لمحة عن التفاعل بين المضيف والممرض أثناء الإصابة بالبروتيوميات المستندة إلى الطيف الكتلي. يستخدم هذا البروتوكول تحديد كمي خال من التسمية لقياس التغيرات في وفرة البروتين لكل من المضيف (على سبيل المثال، الضامة) والعوامل الممرضة (مثل Cryptococcus neoformans)في تجربة واحدة.

Abstract

إن الإنجازات التكنولوجية لقياس الطيف الكتلي (MS) التي تعتمد على البروتيوم الكمي تفتح العديد من الطرق غير المكتشفة لتحليل البروتيوم العالمي للكائن الحي في ظل ظروف مختلفة. هذه الاستراتيجية القوية المطبقة على تفاعلات مسببات الأمراض الميكروبية مع المضيف المطلوب يميز بشكل شامل كلا المنظورين نحو العدوى. هنا، سير العمل يصف الكم خالية من التسمية (LFQ) من infectome من Cryptococcus الأشكال الجديدة، وهو مسبب أمراض داخل الخلايا الكلي الفطرية التي هي العامل المسبب ل cryptococcosis المرض القاتل، في وجود خلايا الضامة خلد. ويفصّل البروتوكول تقنيات إعداد البروتين المناسبة لكل من الخلايا المسببة للأمراض والثدييات في إطار تجربة واحدة، مما يؤدي إلى تقديم الببتيد المناسب لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS/MS. تسمح الطبيعة العامة العالية لـ LFQ بنطاق ديناميكي واسع من تحديد البروتين وتحديد كميته ، بالإضافة إلى قابلية النقل إلى أي إعداد للعدوى المضيفة - الممرض ، مع الحفاظ على حساسية شديدة. تم تحسين هذه الطريقة لفهرسة واسعة، غير متحيزة ملامح وفرة البروتين من الممرض داخل ظروف محاكاة العدوى. وعلى وجه التحديد، فإن الطريقة التي تم إظهارها هنا توفر معلومات أساسية عن التسبب في الأورام الجديدة، مثل إنتاج البروتين اللازم للوعاء وتحدد البروتينات المضيفة الحرجة التي تستجيب للغزو الميكروبي.

Introduction

انتشار الالتهابات الفطرية الغازية في تزايد كبير ويرتبط مع معدلات الوفيات العالية غير المقبولة، والأكثر شيوعا ذكرت في الأفراد الذين لديهم استعداد المناعي1. Cryptococcus النيوفورمات هو الممرض الفطري الانتهازية سيئة السمعة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا داخل خلايا الضامة المضيفة. عدم كفاية نتائج التدخل المضاد للفطريات في نشر الفطريات ومظاهر تهدد الحياة من التهاب السحايا cryptococcal والتهاب السحايا2,3. وقد طالبت الزيادة العالمية في حالة المناعة زيادة موازية في استخدام العوامل المضادة للفطريات، التي العديد من الأنواع الفطرية، بما في ذلك C. النيوفورم، تطورت مقاومة متزايدة نحو4،5،6. ولذلك، لا بد من تنفيذ تكنولوجيات قوية وفعالة للإجابة على الأسئلة البيولوجية الحيوية المتعلقة باستجابة الدفاع المضيف والتنمّر الميكروبي.

العصر الجديد للتقدم التكنولوجي في القياس الطيفي الشامل (MS)، بما في ذلك توليد خطوط الأنابيب الحاسوبية الحيوية القوية، يوفر الأساس لرؤية تكاملية للتحليل على نطاق واسع من البحوث المضيفة المسببة للأمراض7،8. تحليل البروتيومي التقليدي الذي يحركه التسبب في التسبب في البروتيوم عادة ما يُحْسَر وجهة نظر العدوى من منظور المضيف أو الممرض، بما في ذلك منهجيات شاملة مثل التنميط الارتباط البروتيني، واللون اللوني المتقارب مع البروتيوميات،والتفاعلات 9. التحقيقات في ضراوة مسببات الأمراض الخطرة في نظام المضيف هي ذات أهمية سريرية هائلة; ومع ذلك، كان تطبيق تحليل منظور مزدوج في تجربة واحدة يعتبر سابقاً غير قابل للتحقيق. على سبيل المثال، غالباً ما تطغى على منظور الممرض نحو العدوى من قبل البروتينات المضيفة الوفيرة مما يؤدي إلى انخفاض الحساسية للكشف عن البروتينات الفطرية منخفضة وفيرة7. وعلاوة على ذلك، فإن تعقيد العينة العالية يدعو العديد من الأهداف للتحقيق في نظام تجريبي واحد وتثبت صعوبة في توضيح آليات العمل لبروتين مسبب للأمراض محددة.

البروتيوميات من أسفل إلى أعلى هو تقنية مرض التصلب العصبي المتعدد شعبية التي تمكن من إعداد العينة يمكن التحكم فيها، والتي يتم توليد الببتيدات عن طريق الهضم الأنزيمي تسلسل محددة تليها فصل الكروماتوغرافيا السائلة، وتحديد، والكمية من قبل MS10،11. هنا، نقدم طريقة توضح استراتيجية الاستحواذ المعتمدة على البيانات بهدف تحقيق تغطية غير متحيزة للبروتيوم القائم على العدوى أو "العدوى". على وجه التحديد، الكم خالية من التسمية (LFQ) يلقي الاعتماد على التسميات الكيميائية أو الأيضية لتحديد قوية ودقيقة للتغيرات مستوى البروتين عبر البروتينات المتعددة، والحد من معالجة العينات ومعالجة الخطوات12،13. هذا التطبيق العالمي يستجوب البروتينات المنتجة في لحظة معينة داخل خلية مستقلة عن أي إنتاج البروتين المتوقع؛ وهكذا، يمكن اكتشاف رؤى جديدة التي تعتبر حاسمة للعدوى.

تم تحسين سير العمل الموضح هنا لاستكشاف التغيرات في مستوى البروتين من C. neoformans خلال حالات محاكاة العدوى مع الخلايا المناعية المضيفة (الشكل 1). وبدلاً من الاعتماد على عزل وفصل أنواع الخلايا، يستخرج هذا النهج البروتيم المضيف والمسبب للمرض معاً، ويستخدم الفصل المعلوماتي الحيوي باستخدام قاعدتي بيانات خاصتين بالكائنات الحية لتمييز إنتاج البروتينات الخاصة بالأنواع. وتوفر هذه الطريقة مزايا لعدد غير محدود من العينات التي يتعين معالجتها دون اتخاذ خطوات إعداد إضافية مكلفة ضرورية في دراسات وضع العلامات القائمة على النظائر أو الكسر. وعلاوة على ذلك، يدعم هذا العمل بروتوكولات استخراج البروتين المحسنة القابلة للنقل إلى مجموعة واسعة من مسببات الأمراض الفطرية والبكتيرية القادرة على استهداف الخلايا المناعية المضيفة وتصيبها. وعموما، يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستكمال استخراج البروتين غير متحيزة ومعالجة العينة ل MS عالية الدقة، تليها البيانات والتحليل الإحصائي، قادرة على توفير ثروة من المعرفة من البروتينات الفطرية الهامة للعدوى جنبا إلى جنب مع التنميط الشامل للاستجابة الدفاع المضيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام خط خليد من الضامة المستمدة من الفئران BALB / ج للبروتوكول التالي وافق عليها جامعة غيلف استخدام الحيوان بروتوكول 4193. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق سلالات أخرى من الفئران أو مصادر أخرى من الخلايا الخالدة على البروتوكول المبين مع اختبار كاف لتحسين المعلمات التفصيلية. سوف ينتقل البروتوكول التالي الخطوات التي تبدأ بزينة مجمدة من خلايا الضامة. يتم تخزين الخلايا في 10٪ FBS (مصل الأبقار الجنينية)، 1٪ L-الجلوتامين و 5٪ القلم / ستريب (البنسلين-ستربتوميسين) خليط لDEM (Dulbecco معدلة النسر المتوسط) و 20٪ DMSO (ثنائيثيل سلفوكسيد).

1- زراعة الأشكال الجديدة من نوع C.

  1. باستخدام مخزون الجلسرين، سلالة البرية المتتالية C. neoformans (H99) على الخميرة استخراج بيبتون دكستروز (YPD) لوحة أجار لعزل مستعمرات واحدة.
  2. احتضان ليلة وضحاها لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
  3. حدد مستعمرة واحدة من سلالة البرية C. neoformans والثقافة في 5 مل من مرق YPD في فضفاضة توج 10 مل أنبوب الاختبار. أداء في رباعية.
  4. احتضان ليلة وضحاها ل 16 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
  5. في اليوم التالي ثقافة فرعية كل ثقافة بين عشية وضحاها في تخفيف 1:100 في مرق YPD 3 مل.
  6. قياس الكثافة البصرية (OD600nm)قيم الثقافة الفطرية لتحديد منتصف مرحلة السجل. اعتمادا على مقياس الطيفي، C. سلالة النمط البرية الجدد تصل إلى منتصف مرحلة سجل عادة بعد 6 إلى 8 ح حضانة في YPD مع عام600nm القيم OD تتراوح 1.0 إلى 1.5.
  7. مرة واحدة الخلايا تصل إلى منتصف مرحلة السجل، واتخاذ aliquot 10 ميكرولتر من تعليق الخلية الفطرية في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge نظيفة وتمييع 1:100 في العقيمة 1x الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت.

2. زراعة خلايا الضامة

ملاحظة: تأكد من أن بيئة العمل يتم تعقيمها قبل عمل ثقافة الخلية.

  1. إعداد متوسط ثقافة الخلية
    1. المضادات الحيوية تكمل المتوسطة: إضافة 10٪ FBS (مصل البقر الجنينية)، 1٪ L-الجلوتامين و 5٪ القلم / ستريب (البنسلين-ستريبتوميسين) خليط إلى DMEM (Dulbecco معدلة النسر المتوسط). تصفية المتوسطة من خلال نظام تصفية كاملة 0.2 ميكرومتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
    2. وسيط خالٍ من المضادات الحيوية: اتبع بروتوكولاً مماثلاً ولكن حذف خليط القلم/العقدية.
  2. خلايا الضامة البذرية
    ملاحظة: يجب تدفئة المضادات الحيوية تكمل المتوسطة (2.1.1.) إلى 37 درجة مئوية قبل عمل زراعة الخلية.
    1. ذوبان من خلايا الضامة بسرعة في 37 درجة مئوية حمام الخرز.
    2. غسل الخلايا من محلول التجميد عن طريق إعادة تعليق الخلايا في 1 مل المضادات الحيوية تكمل المتوسطة.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى احتياطات إضافية لضمان عدم lyse الخلايا بسبب الأنابيب القاسية.
    3. نقل الخلايا التي أعيد اعتمادها إلى أنبوب عقيم 15 مل.
    4. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. إزالة بعناية فائقة مع ماصة المصلية أو التعرق فراغ.
    6. بيليه resuspend بلطف في 10 مل من المضادات الحيوية تكمل المتوسطة.
    7. الخلايا الماصة بلطف إعادة توزيعها في طبق استزراع الخلايا 60 × 15 مم.
    8. طبق احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  3. المرور الأولي لخلايا الضامة
    ملاحظة: عادة ما تحتوي مخزونات الخلايا المجمدة على ما بين 5 إلى 10 ملايين خلية لكل قارورة (حوالي 1 مل). في اليوم التالي، سوف خلايا الضامة التي نجت من بروتوكول البذر تلتزم الجزء السفلي من طبق ثقافة الخلية وستكون جاهزة لـ passaging.
    1. المضادات الحيوية الدافئة تكمل المتوسطة (الخطوة 2.1.1) إلى 37 درجة مئوية قبل عمل زراعة الخلية. ضمان تعقيم بيئة العمل قبل العمل ثقافة الخلية. تصور الخلايا باستخدام المجهر الخفيف لضمان أن يتم الالتزام بالخلايا وصحية.
    2. إزالة خلية ثقافة المتوسطة من الطبق إما مع ماصة المصلية أو pirator فراغ.
    3. أضف بلطف 5-7 مل من PBS معقم درجة حرارة الغرفة (ملح الفوسفات المخزن) إلى طبق 60 × 15 ملم.
    4. إمالة بلطف الطبق لغسل الخلايا الملتزمة.
    5. إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة المصلية أو pirator فراغ.
    6. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة (المخزنة في 4 درجة مئوية) إلى الخلايا، وطبق إمالة لتوزيع برنامج تلفزيوني على جميع الخلايا، والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    7. إطلاق الخلايا عن طريق التنصت لطيف من الطبق، الأنابيب برنامج تلفزيوني الباردة ضد الخلايا، أو باستخدام مكشطة الخلية.
    8. أضف 9 مل من المضادات الحيوية الملحقة بالطبق.
    9. في طبق جديد 60 × 15 مم، أضف 9 مل من المضادات الحيوية الطازجة و1 مل من الخلايا التي يتم تثبيتها من الطبق الأصلي.
    10. مرة واحدة وقد تم شغل عدد من لوحات passaging المطلوب، يمكن التخلص من الخلايا resuspended من الطبق الأصلي.
    11. احتضان الطبق الجديد في الإعدادات المذكورة أعلاه (الخطوة 2.2.8).
    12. تنفيذ تمرير اللاحقة عندما الخلايا قد وصلت التقاء 70-80٪ (تقريبا كل 2 أيام اعتمادا على خط الخلية والمتوسطة المستخدمة).
      ملاحظة: يجب أن يتم تمرير خلايا الضامة خمس مرات كحد أدنى قبل تجارب العدوى. اعتمادا على خط الخلية، ينبغي إجراء تجارب العدوى من قبل 25 إلى 30 مقطعا. بعد 25 إلى 30 مقطعاً، يجب تجميد الخلايا أو التخلص منها. ويمكن اختيار القسم 2-4 أو 2-5 على أساس الخطط التجريبية. وسوف تستخدم المادة 2-4 في الفروع التالية.
  4. بذور خلايا الضامة قبل العدوى
    1. تنفيذ خطوات بروتوكول ترحيل التمرير 2.3.1 إلى 2.3.7.
    2. باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي تحديد كثافة الخلية (الخلايا / مل).
    3. نقل 0.3 × 106 خلايا الضامة إلى بئر واحد من لوحة ثقافة خلية 6-well.
    4. ضبط حجم إجمالي من جيدا إلى 1 مل باستخدام المضادات الحيوية الملحقة المتوسطة (الخطوة 2.1.1).
    5. كرر الخطوتين 2-4-3 و2-4-4 حتى يتم ملء 8 آبار (4 آبار تم ملئها في لوحتين منفصلتين).
    6. اختياريا، تعبئة الآبار المتبقية اثنين مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني للحفاظ على مستويات الرطوبة أثناء الحضانة.
    7. السماح للخلايا أن تنمو في ظل ظروف الحضانة المذكورة في الخطوة 2.2.8 ل 2 د قبل الإصابة.
  5. خلايا الضامة البذر في يوم العدوى
    1. تنفيذ خطوات بروتوكول ترحيل التمرير 2.3.1 إلى 2.3.7.
    2. باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي تحديد كثافة الخلية (الخلايا / مل).
    3. البذور 1.2 × 106 خلايا الضامة في بئر واحد من 6-جيدا خلية لوحة الثقافة.
    4. ضبط حجم إجمالي من جيدا إلى 1 مل باستخدام المضادات الحيوية الملحقة المتوسطة (2.1.1).
    5. كرر 2.4.3 و2.4.4 حتى تم ملء 8 آبار (4 آبار مملوءة في لوحتين منفصلتين).
    6. اختياريا، تعبئة الآبار المتبقية اثنين مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني للحفاظ على مستويات الرطوبة أثناء الحضانة.
    7. احتضان الخلايا في ظل الشروط المذكورة في الخطوة 2.2.8 ل 3 ساعة للسماح للخلايا بالتمسك بالآبار.

3. عدوى خلايا الضامة مع C. النموش

ملاحظة: عند الوصول إلى التقاء 70-80٪ ، سيكون هناك حوالي 1.2 × 106 خلايا الضامة في البئر. لتحقيق التعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) من 100:1، 1.2 × 108 الخلايا الفطرية مطلوبة لكل رد فعل. ويجب وضع الثقافات وفقا لذلك في رباعية بيولوجية.

تنويه : وزارة الداخلية من 100:1 حققت نتائج مرغوب فيها في مجموعتنا البحثية ، والمقصود كاقتراح للقراء. قد تكون هناك حاجة إلى وزارة الداخلية أقل لسلالات C. neoformans المعدية أو لخطوط خلايا الضامة الأقل مرونة. التحقق من العدوى (القسم 3.5) يمكن استخدامها لتحديد وزارة الداخلية المثالي لل C. الجدد معينة - تركيبات الضامة.

  1. إعداد الخلايا الفطرية
    1. اتبع الخطوة 1 لنمو الأشكال الجديدة C. إلى منتصف مرحلة السجل.
    2. جمع وطاردة مركزية في 1500 س ز لمدة 10 دقيقة، وغسل بلطف بيليه مع درجة حرارة الغرفة العقيمة PBS، وكرر لمجموع ثلاثة يغسل.
    3. خلايا إعادة الزرع في الخلايا الخالية من المضادات الحيوية المتوسطة (الخطوة 2.1.2) لتحقيق تركيز 1.2 × 108 خلايا / مل.
  2. إعداد خلايا الضامة
    1. تصور كل بئر في لوحة 6-جيدا لضمان أن الخلايا قد وصلت 70-80٪ التقاء. بدلا من ذلك، يمكن قياس الخلايا لتحقيق حوالي 1.2 × 106 خلايا الضامة في البئر.
    2. اتبع الخطوات 2.3.1 إلى 2.3.4.
  3. ثقافة المشاركة من C. النموشات الجديدة وخلايا الضامة
    1. إضافة 1 مل من الخلايا C. neoformans التي تم تعليقها (الخطوة 3.1.3) إلى 4 آبار تحتوي على خلايا الضامة المعدة في القسم 3-2.
      ملاحظة: يجب حساب عدد اللوحات المطلوبة قبل بدء التجربة. إضافة 1 مل من المضادات الحيوية الخالية من المتوسطة (الخطوة 2.1.2) إلى آبار فارغة.
    2. السماح للخلايا لاحتضان تحت شروط المدرجة (الخطوة 2.2.8) لمدة 3 ساعة.
    3. إزالة خلية ثقافة المتوسطة من لوحة إما مع ماصة المصلية أو pirator فراغ.
    4. أضف بلطف 1 مل من PBS العقيمة درجة حرارة الغرفة.
    5. إمالة بلطف لوحة لغسل غير المرفقة أو غير phagocytosed الخلايا خارج الخلية C. الخلايا الجدد.
    6. إزالة PBS باستخدام ماصة المصلية أو التعرق فراغ، كرر لمجموع ثلاثة يغسل. كرر 3.3.4 إلى 3.3.5 مرتين ازيد من ذلك.
  4. الضامة غير المصابة
    1. وبالمثل، استخدم 4 آبار من 6 صحن جيد لتكون بمثابة عينات الضامة فقط. أضف 1 مل من المضادات الحيوية الخالية من المضادات الحيوية (الخطوة 2.1.2) إلى هذه الآبار.
    2. كرر الخطوات من 3.3.2 إلى 3.3.6.
  5. التحقق من العدوى
    ملاحظة: باستخدام مقايسة سمية للخلايا، يمكن قياس إجادة العدوى. وسيسلط البروتوكول التالي الضوء على تطبيق منتج السمية الخلوية لقياس إطلاق LDH (اللاكتات dehydrogenase). ويمكن أيضاً استخدام منتجات أخرى للسمية الخلوية.
    1. إعداد C. عدوى النُمُج الجديدة من خلايا الضامة
      1. تكرار الخطوات 1 و2 و3 (حتى 3.5). يمكن إجراء فحص LDH في ثلاث ية، إذا كان المفضل.
      2. بعد الخطوة 3.3.6، أضف 1 مل من المضادات الحيوية الخالية من المضادات الحيوية المتوسطة (2.1.2) إلى كل بئر في لوحة 6-جيدا.
      3. الخطوتان 2-4-3 و2-4-4 حتى تم ملء 3 آبار بالإضافة إلى 3n (حيث n هو عدد النقاط الزمنية التي تم قياسها).
      4. احتضان الخلايا تحت شروط المسرودة في الخطوة 2.2.8.
      5. في نقاط زمنية مختارة (على سبيل المثال، 1، 3، 6، 12، و 24 ساعة) جمع فائق لقياس إطلاق LDH وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
      6. في نفس الوقت، سيتم خلايا الضامة غير المصابة lysed إلى قيمة محددة لأقصى سمية للخلايا.
      7. حساب السمية الخلوية على النحو التالي:
        Equation 1

4. عينة جمع

  1. المشاركة في الثقافة وجمع الضامة غير المصابة
    1. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى الخلايا (من 3.3.6 و 3.4.2) والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    2. إطلاق الخلايا من لوحة عن طريق التنصت لطيف من لوحة أو لطيف الأنابيب برنامج تلفزيوني الباردة ضد الخلايا.
      ملاحظة: يجب تجنب مكشط الخلية لأن هذا قد يسبب تحلل الخلايا.
    3. الخلايا الماصة في أنبوب 15 مل.
    4. خلايا الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة فائقة.
    5. خلايا العملية (كما هو مفصل في الخطوة 5) على الفور أو فلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية للمعالجة في وقت لاحق.

5. بروتيوم الخلوية

ملاحظة: يجب تحسين التحلل الكافي لنوع الخلية المحلل (أي، كمية الدورات والسعة يعتمد على حجم بيليه الخلية ونسبة الطاقة من نموذج sonicator التحقيق).

  1. تحلل خلية الضامة المصابة
    1. Resuspend خلايا الكريات (الخطوة 4.1.5) في 300 ميكرولتر من 100 mM تريس-HCl (pH 8.5) تتكون من حبوب كوكتيل مثبطات البروتياز المذابة حديثا.
      ملاحظة: يتم إضافة قرص كوكتيل مثبطات البروتياز إلى 10 مل من الثلج البارد 100 mM تريس-HCl (pH 8.5) قبل بدء التجربة.
    2. التحقيق سونيكات الخلايا في حمام الجليد لمدة 15 دورة من 30 ق على و 30 ق قبالة، لlyse الخلايا.
    3. خلايا الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 30 ق في 400 س ز، والحرص على عدم تشكيل بيليه ، فقط لإزالة السائل على جانبي الأنابيب تليها نقل العينة إلى 2 مل لو الربط microcentrifuge أنبوب.
    4. أضف 1:10 حجم 20٪ من SDS إلى تركيز نهائي بنسبة 2٪.
    5. إضافة 1:100 حجم من 1 م dithiothreitol (DTT) إلى تركيز نهائي من 10 mM وخلط العينة بدقة عن طريق الأنابيب، تليها الحضانة على كتلة التدفئة الحرارية في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 800 دورة في الدقيقة الانفعالات. بعد ذلك، بارد لدرجة حرارة الغرفة (يمكن أن يتم التبريد على الجليد).
    6. إضافة 1:10 حجم iodoacetamide M 0.55 (IAA) للحصول على تركيز نهائي من 55 mM وخلط العينة جيدا عن طريق الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة.
    7. إضافة 100٪ الأسيتون للحصول على تركيز النهائي من 80٪ الأسيتون وتخزين عينة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية لتعجيل البروتينات.
  2. هضم البروتين
    1. في اليوم التالي، وجمع بيليه راسب عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10،000 س ز و 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وغسل بيليه مع 500 ميكرولتر من 80٪ الأسيتون. كرر لمجموع اثنين من يغسل. بيليه الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة بعد يغسل.
    2. Resolubilize بيليه البروتين في 100 ميكرولتر من 8 M urea/40 mM HEPES، لضمان solubilization كاملة، دوامة أو سونيكات في حمام الماء المثلج لمدة 15 دورة من 30 s على و 30 ق قبالة.
      ملاحظة: يتم تحديد تعديل حجم اليوريا/HEPES على حجم الكريه الخلية المترسبة، إذا حدثت تعديلات يجب تعديل جميع وحدات التخزين المصب بشكل مناسب.
    3. كمي تركيز البروتين باستخدام مقايسة البروتين (على سبيل المثال، اختبار بروتين BCA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وضبط لقياس الخلفية عن طريق التطبيع فارغة مع 8 M urea/40 mM HEPES.
    4. إضافة 300 ميكرولتر من 50 mM بيكربونات الأمونيوم للحصول على تركيز النهائي من 2 م اليوريا.
      ملاحظة: فرصة لتطبيع تركيز البروتين لقياسات المصب، واقترح لهضم 100 ميكروغرام من البروتين وتخزين العينة المتبقية غير مهضومة عن طريق تجميد فلاش في النيتروجين السائل ثم تخزينها في -20 درجة مئوية على المدى القصير، أو في -80 درجة مئوية على المدى الطويل.
    5. إضافة 2:50 (الخامس / ث) نسبة الإنزيم إلى البروتين من خليط التربسين / ليس - C البروتياز على الجليد والاستفادة بلطف أنبوب لخلط، احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    6. بعد الحضانة، ووقف الهضم بإضافة 1:10 حجم وقف حل (20٪ acetonitrile، 6٪ حمض ثلاثي الفلوراستيكيك) وعينات أجهزة الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. جمع مكبر(يتكون من الببتيدات المهضمة)والتخلص من أي حطام بيليه أو الترسب.
  3. الببتيد desalting
    1. تفعيل C18 وقف والذهاب استخراج (المرحلة) تلميح (تتكون من 3 طبقات C18 الراتنج في 200 ميكرولتر ماصات تلميح) عن طريق إضافة 100 μL من 100٪ الأسيتريتريل والطرد المركزي في 1،000 س ز لمدة 2 دقيقة.
    2. اكويبيل طرف C18 STAGE بإضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت B (80٪ (v/v) acetonitrile، 0.5٪ (v/v) حمض الخليك) والطرد المركزي في 1000 x g لمدة 2 دقيقة.
    3. اكويبير طرف المرحلة C18 بإضافة 200 ميكرولتر من العازل A (2٪ (v/v) الأسيتونيتريل، 0.1٪ (v/v) حمض ثلاثي الفلوراسيدتيك، 0.5٪ (v/v) حمض الخليك) والطرد المركزي في 1000 x g لمدة 3-5 دقيقة.
    4. إضافة ~ 50 ميكروغرام من العينة المهضومة على تلميح C18 المرحلة والطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 3-5 دقيقة، أو حتى عينة مرت من خلال العمود تدور. فلاش تجميد العينة هضم المتبقية في النيتروجين السائل وتخزينها في -20 درجة مئوية، حتى الحاجة.
    5. اغسل طرف المرحلة C18 بـ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت A والطرد المركزي عند 1000 × غم لمدة 3-5 دقائق.
    6. أضف 50 ميكرولتر Buffer B إلى طرف C18 STAGE والطرد المركزي بسرعة 500 x g لمدة 2 دقيقة. جمع الببتيدات eluted في أنابيب PCR 0.2 مل.
    7. جفف الببتيدات المائلة في جهاز طرد مركزي فراغي لمدة 30-40 دقيقة بالسرعة القصوى. قد يتم تخزين العينات المجففة تماما في درجة حرارة الغرفة أو عند -20 درجة مئوية حتى معالجتها.
      ملاحظة: الببتيدات المجففة والمزدّرة هي عينات مناسبة من الخضوع لمرافق قياس الطيف الكتلي للمعالجة ويمكن شحنها في درجة الحرارة المحيطة.

6. قياس الطيف الكتلي

  1. إعادة الببتيدات في 10 ميكرولتر العازلة A وقياس التركيز اللازم لحقن ~ 1.5 إلى 3 ميكروغرام الببتيدات على العمود MS. كمية العينة تعتمد على الأجهزة.
  2. استخدام تدرج محدد مسبقا من الأسيتونتريل (حوالي 5-60٪) في 0.5٪ حمض الخليك على مدى الوقت المطلوب (على سبيل المثال، 2 ح) لفصل الببتيدات عن طريق الكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء، تليها التأين الكهربائي في مطياف الكتلة.
  3. الحصول على مسح MS باستخدام مطياف كتلة عالية الدقة في وضع الاعتماد على البيانات(م / ز 300 إلى 1650).
    ملاحظة: يتم تحديد النسبة المئوية للتدرج والطول بواسطة التجربة والمستخدم. تعتمد إعدادات مطياف الكتلة الدقيقة على الأجهزة والتجربة وتفضيل المستخدم.

7 - تحليل البيانات

ملاحظة: يمكن معالجة بيانات MS مع العديد من خطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية. في هذا البروتوكول، نحن وصف المعالجة باستخدام منصات MaxQuant و Perseus المتاحة للجمهور ولكن نوصي المستخدمين الفرديين لتقييم أدوات المعلوماتية الحيوية المناسبة للتحليل، والتفضيل، والاستخدام.

  1. تحميل ملفات البيانات غير المجهزة (مباشرة من أداة MS) باستخدام برنامج MaxQuant. تحديد البروتينات تحت معلمات البحث MaxQuant المعدلة؛ الحد الأدنى من اثنين من الببتيدات الفريدة اللازمة لتحديد البروتين باستخدام نهج الخداع الهدف لمعدل اكتشاف كاذبة من 1٪، تنفيذ الكم خالية من التسمية مع مطابقة بين أشواط، وتشمل الكائنات الحية ملف FASTA التي تم الحصول عليها من قاعدة بيانات UniProt (أي، Cryptococcus neoformans H99، musculus) لتحديد وتحديد كمية الببتيدات مع محرك البحث أندروميدا. استشارة أدوات MaxQuant العامة على الانترنت للحصول على الدروس التفصيلية (انظر جدول المواد).
  2. تحميل ملف إخراج MaxQuant ('proteingroups.txt') في Perseus.
  3. تصفية الصفوف التي تحتوي على ايجابيات كاذبة المحتملة والملوثات، فضلا عن تعديل فقط من قبل الببتيدات الموقع مع 'تصفية الصفوف على أساس عمود قاطع'.
  4. تحويل قيم البيانات على مقياس السجل2.
  5. إنشاء مجموعات مجموعات البيانات عن طريق توفير تعليق توضيحي قاطع للصفوف.
  6. تصفية مجموعة البيانات حسب القيم الصالحة لتحديد قطع للكشف عن البروتين.
    ملاحظة: لإجراء تحليل صارم وقوي، يقترح معدل تعريف 50٪. على سبيل المثال، إذا تمت معالجة أربعة نسخ متماثلة ثم سيتم تحديد عدد أدنى من ثلاث قيم صالحة.
  7. إذا كان المفضل، البيانات من قبل استبدال القيم المفقودة من التوزيع العادي.
    ملاحظة: يتم تحسين القيم المُقَلَّرة استناداً إلى التوزيع العادي وتوفر كثافة LFQ عشوائية لاستبدال العناصر النائبة 'NaN' لمحاكاة قياسات الوفرة النموذجية. ويوفر هذا التسريب منصة للتحليل الإحصائي في المراحل النهائية التي تتطلب بيانات قابلة للقياس الكمي.
  8. إضافة تعليقات توضيحية إلى صفوف البروتين (مثل أسماء البروتينات، مصطلحات علم الجينات).
    ملاحظة: هذا سير العمل Perseus ولدت الآن إطار عمل قوي لمزيد من المعالجة الحيوية، والتحليل الإحصائي، وتصور البيانات، والتشاور العامة Perseus أدوات على الانترنت للدروس مفصلة (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول المبين أعلاه يتيح تحديد وكمية البروتينات المستمدة من كل من الممرض الفطري، C. neoformans،والمضيف، خلايا الضامة، في تجربة واحدة. وبعد الاستزراع المشترك، يتم جمع الخلايا ومعالجتها معًا وفصلها بيولوجيًا على أساس ملامح الببتيد الخاصة بكل نوع. هذا هو نهج قوي لتحديد التفاعل بين العلاقة المضيفة - الممرض أثناء العدوى. يعتمد عدد البروتينات التي تم تحديدها من التجربة على مادة البداية، وإعداد العينة، وطول التدرج، وأدوات التصلب المتعدد، وسير العمل الحيوي. باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، فإننا عادة ما نحدد حوالي 8000 بروتين من التجربة مع 1500 بروتين C. neoformans و 6500 بروتين مضيف. بعد معالجة مجموعات البيانات، ونحن توليد تحليل المكونات الرئيسية (PCA) مؤامرة لمراقبة العوامل الحرجة التي تقود تحليلنا(الشكل 2A). وهنا نلاحظ أن أكبر عنصر للفصل بين البيانات مصاب في مقابل العينات غير المصابة، كما نتوقع من التصميم التجريبي (المكون 1، 79.8 في المائة)، والسمة الثانية المميزة للعينات هي التغير البيولوجي (المكون 2، 5.7 في المائة). بعد ذلك ، فإن ارتباط Pearson مقترنًا بالتكتل الهرمي من قبل مجموعات المسافة الإقليدية للعينات ويمكّن من القياس الكمي للتباين بين النسخ المتماثلة(الشكل 2B). في تحليلنا، لاحظنا تجميع متميز للعينات المصابة مقابل غير المصابة وتكرار تكرار تكرار تتراوح بين 95-96٪، مما يمثل قابلية التكاثر الجيدة بين النسخ المتماثل. وأخيراً، نقوم بإجراء اختبار t-الطالبتصحيح لاختبار الفرضية متعددة باستخدام معدل اكتشاف زائف بينجاميني هوشبرغ (FDR)(p-value ≤ 0.05; FDR = 0.01؛ s0 = 1) لتحديد البروتينات مع اختلافات كبيرة في وفرة أثناء الإصابة مقارنة مع الضوابط غير المصابة (الشكل 2C). هنا، نحدد 760 بروتين مع تغيرات كبيرة في الوفرة، بما في ذلك 117 البروتينات المضيفة مع 86 تظهر انخفاضا كبيرا و 31 تظهر زيادة كبيرة على العدوى. وتجدر الإشارة إلى أننا نلاحظ أيضاً زيادات كبيرة في وفرة البروتينات الفطرية، كما هو متوقع أثناء الإصابة. مع هذه البيانات، يتم إجراء التحليلات اللاحقة، بما في ذلك رسم خرائط الشبكة، في توصيف السيليكو، والتجارب المتابعة للتحقق من صحة البيانات واستكشاف الآليات الجزيئية التي تقوم عليها استجابة المضيف للوعاء.

Figure 1
الشكل 1: تدفق عمل البروتيوميات القائم على الطيف الكتلي لتحليل الضامة المصابة بالفورمات الجديدة C. يبدأ سير العمل مع مجموعة من الضامة إما مصابة بالتشوهات الجديدة أو عناصر التحكم غير المصابة. يتم استخراج البروتينات عن طريق الاضطرابات الميكانيكية والكيميائية، تليها الحد من و alkylation، وهطول الأسيتون، والهضم الأنزيمي. يتم تنقية الببتيدات على نصائح المرحلة C18، مفصولة من قبل الكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء، تخضع لتيونات الرذاذ الكهربائي، وقياسها على مطياف كتلة عالية الدقة. تتم معالجة البيانات وتحليلها وتصورها في منصات المعلوماتية الحيوية المتاحة للجمهور، MaxQuant (مع أندروميدا) و Perseus14،15،16. التجارب التي أجريت في رباعية البيولوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: بيانات تمثيلية لعدوى C. neoformans من خلايا الضامة. (أ)يوضح تحليل المكونات الرئيسية التمييز بين الضامة المصابة مقابل اللاعدوى (المكون 1، 79.8٪)، وتجميع المضاعفة البيولوجية (المكون 2، 5.7٪). (B) خريطة الحرارة من ارتباط بيرسون رسمها التسلسل الهرمي من قبل المسافات الإقليدية لإظهار تجميع العينات (المصابة ضد غير المصابة) وتكرار تكرار التكاثر (> 95٪). (C) مؤامرة بركان من البروتينات المحددة. الأزرق = البروتينات الفطرية مع تغير كبير في وفرة; أسود = بروتينات الضامة مع تغير كبير في وفرة. اختبار tللطالب(p-value≤ 0.05)، FDR = 0.01؛ s0 = 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول إعداد خلايا الضامة وجمع عينات من الثقافة المشتركة لمعالجة البروتين مع الحد الأدنى من التعطيل للخلايا. من المهم تنفيذ خطوات الغسيل والتطعيم وإزالة خلايا الضامة المتمسكة بلطف وعناية لمنع تحلل الخلايا غير الضرورية قبل جمعها. إنشاء وزارة الداخلية الصحيح للتجربة هو أيضا أمر بالغ الأهمية كما تلقيح مع وزارة الداخلية عالية بشكل مفرط يمكن أن يسبب موت الخلايا الضامة السريع وصعوبة في جمع ومعالجة العينات للتصلب المتعدد. على العكس من ذلك، فإن أعداد وزارة الداخلية منخفضة يؤدي إلى خلايا فطرية أقل بالزهنة والكشف المحدود للبروتينات الفطرية في النظام البيولوجي. للتغلب على هذه القيود، نوصي بإجراء تجارب اختبار مع MOIs مختلفة، مدعومة بفحوصات موت الخلايا (على سبيل المثال، قياس الـ LDH) لتحديد عدد الخلايا الفطرية التي تبدأ استجابة المضيف ولكنها لا تقتل الخلايا المضيفة قبل الجمع. بالنسبة للتجارب، نهدف إلى تحديد البروتينات الفطرية المرتبطة بالعدوى، والتي تتطلب نسبة عالية من البروتينات (100:1) للكشف عن البروتينات الفطرية بشكل كافٍ بين البروتينات المضيفة الوفيرة للغاية. نحن نقوم بشكل روتيني بالتقييس السمية الخلوية للجملة لتقييم تأثير وزارة الداخلية على موت الخلية المضيفة قبل إجراء التجربة بأكملها. توقيت حضانة الخلايا C. neoformans مع الضامة هو أيضا أمر بالغ الأهمية لأن الخلايا الفطرية قد تمتلك كبسولات كبيرة polysaccharides ، وبالتالي ، الضامة تتطلب المزيد من الوقت لالابتلاع. نختار لاستخدام وقت الحضانة الثقافة المشتركة من 3 ح للتجربة المبينة، كما وجدنا تغطية جيدة من البروتيوم الفطري في هذه المرحلة الزمنية وتوفير 'المفاجئة بالرصاص' استجابة المضيف. ومع ذلك، قد يرغب الباحثون في استكشاف نقاط زمنية سابقة ولاحقة ومراقبة كيفية تأثير التوقيت على إنتاج البروتين الفطري والمضيف. بدلا من ذلك ، فتيلة الضامة لopsonization وقد تم تنفيذها لمساعدة عملية البلعومات17،18.

لجمع العينات، إذا لم تتم معالجة العينات على الفور فلاش تجميد في النيتروجين السائل سوف تساعد على منع التدهور غير المرغوب فيه من البروتينات من قبل البروتياز الموجودة في العينات. وبالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للتحليلات البروتيومية المستندة إلى التصلب المتعدد، ينبغي أن تكون إمكانية التلوث من الغبار أو الكيراتين (مثل خلايا الجلد والشعر) محدودة من خلال استخدام قفازات النتريل والمعاطف المختبرية وغسل جميع الأسطح مع الإيثانول بنسبة 70٪ قبل بدء التجارب. وعلاوة على ذلك، والبروتوكولات المبينة أعلاه هي محددة لمجموعة عينة ثقافة المشتركة وصفها ولكن يمكن تعديلها لبروتين استخراج تدفق العمل الأمثل، حسب الحاجة19،20. وتشمل فرص تعديل سير العمل وتحسين لأنواع محددة من الخلايا تقنيات التعطيل الميكانيكية والكيميائية المحددة، ومدة ودرجة حرارة الهضم الأنزيمي، وفصل العينات. على سبيل المثال، يتم إجراء تحلل الخلايا النيوفورمية C. عادة عن طريق ضرب حبة ميكانيكية. ومع ذلك، لاحظنا زيادة تغطية البروتيوم بعد صوتنة التحقيق، وبالتالي، أوصي به لتعطيل الميكانيكية للخلايا المصابة19،21،22. على سبيل المثال، قد يقلل كسور عينات الببتيد إلى اسكوت عن طريق تجزئة عالية درجة الحرارة أو الكروماتوغرافيا استبعاد حجم تعقيد العينة وتحسين عمق التغطية على مطياف الكتلة9. وعلاوة على ذلك، لتحقيق عمق التغطية لتحديد حوالي 8000 من البروتينات المضيفة والفطرية، مطلوب نظام قياس الطيف الكتلي عالي الاستبانة (على سبيل المثال، QExactive Exploris، Fusion Lumos، timsTOF Pro).

استخدام LFQ لتحديد التغيرات في مستويات البروتين أثناء الإصابة هو نهج موثوق وفعال من حيث التكلفة لبروتيوميكس12القائم على MS . وهو يمكّن من القياس الكمي للبروتينات من حيث الوفرة النسبية دون الحاجة إلى خطوات إضافية لمعالجة العينات. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء التحليل بعد الانتهاء من التجربة، مع إقراض نفسها لتطبيقات عالمية وتصميم دراسة مرنة. ومع ذلك ، فإن قيود LFQ تشمل زيادة وقت الأجهزة حيث يجب تشغيل العينات بشكل تسلسلي ولا يمكن دمجها ، ويمكن أن تكون المقارنة بين العينات صعبة ، ويمكن أن تكون الحاجة إلى الذِهاب لتحل محل القيم المفقودة عالية23. وتشمل النهج البديلة لقياس وفرة البروتين الأيضية (على سبيل المثال، وضع العلامات النظيرية المستقرة للأحماض الأمينية في زراعة الخلايا) والتقنيات الكيميائية (مثل العلامات الجماعية) لوضع العلامات، التي تسمح بالجمع بين العينات لتقليل وقت الأداة، وتوفير قابلية مقارنة موثوقة بين العينات، وتؤدي عادة إلى قيم أقلفقداناً 24،25. ومع ذلك، تتطلب هذه الأساليب خطوات إضافية مناولة العينات ومعالجتها، وزيادة تعقيد التجارب المعملية الرطبة والوقت، فضلاً عن الحاجة إلى تصميم تجريبي ثابت. لاختيار طريقة القياس الكمي الأمثل للتجارب المقترحة، ينبغي للمستخدمين النظر في تصميم الدراسة وإمكانية المقارنة بين العينات، وتعقيد المختبرات الرطبة وتحليل البيانات، فضلا عن توافر الأجهزة الزمنية والتكلفة.

الجدة من البروتوكول المقدمة هي القدرة على تحديد التغيرات في proteome من كل من المضيف والعوامل المسببة للأمراض وجهات النظر في تجربة واحدة. عمق تغطية كل من البروتيوم تمكن من رؤية جديدة في كيفية مسبب المرض يبدأ العدوى وكيف يستجيب المضيف في الدفاع. وتجدر الإشارة إلى أن النهج يركز على الإصابة بالخلايا بأكملها؛ ومع ذلك، توجد فرص لتحديد الردود الفرعية على العدوى أو الردود المجزأة على العدوى من خلال الجمع بين تقنيات التعريب المكاني (على سبيل المثال، الطرد المركزي، الإثراء، وضع العلامات)26،27. هنا، ونحن بالتفصيل التفاعل بين الضامة والعوامل المسببة للأمراض الفطرية، C. النموشات الجديدة. ومع ذلك، فإن هذا النهج عالمي، ويمكن تطبيقه على التفاعلات بين مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية. على سبيل المثال، استخدمنا مؤخرا سير عمل مماثل للكشف عن الاستجابات العامة والموقع محددة من العدلات المستمدة من نموذج مورين من التهاب القرنية العين28،29،30. وعلاوة على ذلك، يمكن دمج مجموعات البيانات التي تُنتج عن هذا البروتوكول في البروفيوم المختبري وفرزها من مسببات الأمراض للكشف عن البروتينات ذات الوفرة المتغيرة في وجود خلايا مضيفة. مثل هذه البروتينات، التي يشار إليها باسم البروتينات المرتبطة بالعدوى، توفر مجموعة كبيرة من عوامل الفوعة المعروفة والجديدة لمزيد من التوصيف، بما في ذلك التنظيم الزمني، والتوطين، والتفاعلات المباشرة البروتين البروتيني مع المضيف. وعموما، يوفر سير عمل البروتيوميكس القائم على MS المحدد بشكل محدد فرصة جديدة لدراسة العلاقة المعقدة بين المضيف والعوامل الممرضة في تجربة واحدة مع عالمية وفهم غير متوفرة بشكل شائع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عن عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور جوناثان كريغر من شركة حلول المعلوماتية الحيوية لتشغيله مطياف الكتلة للتجارب التمثيلية ، وكذلك أعضاء مجموعة Geddes-McAlister لمساعدتهم في الإعداد التجريبي والتغذية المرتدة للمخطوطة. يعترف المؤلفون بالدعم التمويلي، جزئياً، من مؤسسة بانتينغ للبحوث – جائزة اكتشاف الزمالة Jarislowsky, صندوق أبحاث الحدود الجديدة – استكشاف (NFRFE-2019-00425)، والمؤسسة الكندية للابتكار (JELF 38798) لJ.G.M.، فضلا عن منحة الدراسات العليا NSERC كندا – منحة الماجستير والدراسات العليا أونتاريو لB.B., والملكة إليزابيث الثانية منحة الدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا ل.S.S..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
  2. Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
  4. Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
  5. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
  6. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
  7. Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
  8. Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
  9. Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
  10. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  11. Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
  12. Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  13. Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
  14. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  15. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  16. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
  17. Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
  18. Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
  19. Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
  20. Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
  21. Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
  22. Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
  23. Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
  24. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  25. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  26. Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
  27. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
  28. Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
  29. Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
  30. Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 164، البروتيوميات القائمة على الطيف الكتلي، الكم الخالي من التسمية، التفاعلات المضيفة-الممرضة، ثقافة الخلايا الثديية، مسببات الأمراض الفطرية، Cryptococcus neoformans
خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ball, B., Sukumaran, A.,… More

Ball, B., Sukumaran, A., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (164), e61881, doi:10.3791/61881 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter