Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/61881
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

Abstract

ההישגים הטכנולוגיים של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוססי פרוטאומיקה כמותית פותחים אפיקים רבים שטרם התגלו לניתוח הפרוטאום העולמי של האורגניזם בתנאים משתנים. אסטרטגיה רבת עוצמה זו המיושמת על האינטראקציות של פתוגנים מיקרוביאליים עם המארח הרצוי מאפיינת באופן מקיף את שתי נקודות המבט כלפי זיהום. בזאת, זרימת העבודה מתארת כימות ללא תווית (LFQ) של ההדבקה של Cryptococcus neoformans, פתוגן תאי פטרייתי פטרייתי שהוא הסוכן הסיבתי של המחלה הקטלנית cryptococcosis, בנוכחות תאי מקרופאגים מונצחים. הפרוטוקול מפרט את טכניקות הכנת החלבון המתאימות הן לתאי פתוגן והן לתאי יונקים בניסוי אחד, וכתוצאה מכך הגשת פפטיד מתאימה לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS/MS. האופי הגנרי בעל התפוקה הגבוהה של LFQ מאפשר מגוון דינמי רחב של זיהוי וכימות חלבונים, כמו גם יכולת העברה לכל הגדרת זיהום מארח-פתוגן, תוך שמירה על רגישות קיצונית. השיטה מותאמת לקטלוג פרופילי שפע חלבון נרחבים ובלתי משוחדים של פתוגן בתנאים של חיקוי זיהום. באופן ספציפי, השיטה המודגמת כאן מספקת מידע חיוני על C. neoformans pathogenesis, כגון ייצור חלבונים הדרושים לארסיות ומזהה חלבונים מארחים קריטיים המגיבים לפלישה מיקרוביאלית.

Introduction

השכיחות של זיהומים פטרייתיים פולשניים גדלה במידה ניכרת והיא מתואמת עם שיעורי תמותה גבוהים באופן בלתי מתקבל על הדעת, המדווחים בדרך כלל אצל אנשים עם נטייה אימונודפטית1. Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי ידוע לשמצה המסוגל לשרוד תאיים בתוך תאי מקרופאג מארחים. התערבות פטרייתית לקויה גורמת להפצה פטרייתית וביטויים מסכני חיים של דלקת קרום המוח cryptococcal ודלקת קרום המוח2,3. העלייה העולמית במעמד immunocompromised דרשה עלייה מקבילה בשימוש בחומרים נגד פטריות, שבו מינים פטרייתיים רבים, כולל C. neoformans, פיתחו יותר ויותר התנגדות כלפי4,5,6. לכן, חובה ליישם טכנולוגיות חזקות ויעילות כדי לענות על שאלות ביולוגיות חיוניות לגבי תגובת ההגנה המארחת ופתוגנזה מיקרוביאלית.

העידן החדש של התקדמות טכנולוגית בספקטרומטריית מסה (MS), כולל יצירת צינורות חישוביים וביואינפורמטיים רבי עוצמה, מספק את הבסיס לחזון אינטגרטיבי לניתוח בקנה מידה גדול של מחקרמארח-פתוגן 7,8. ניתוח פרוטאומי קונבנציונלי מונחה פתוגנזה בדרך כלל פרופילים ההשקפה של זיהום מנקודת המבט המארח או פתוגן, כולל מתודולוגיות מקיפות כגון פרופיל מתאם חלבון, כרומטוגרפיה זיקה בשילוב עם פרוטאומיקה, ו אינטראקציה9. חקירות על ארסיות של פתוגנים מסוכנים במערכת מארחת הן בעלות חשיבות קלינית עצומה; עם זאת, היישום של ניתוח פרספקטיבה כפולה בניסוי יחיד נחשב בעבר לבלתי ניתן להשגה. לדוגמה, נקודת המבט של הפתוגן כלפי זיהום הוא המום לעתים קרובות על ידי חלבונים מארחים בשפע מאוד וכתוצאה מכך רגישות מופחתת לגילוי של חלבונים פטרייתיים בשפע נמוך7. יתר על כן, מורכבות המדגם הגבוהה מזמינה מטרות רבות לחקור במערכת ניסיונית אחת ומוכיחה מאתגרת להבהיר מנגנוני פעולה לחלבון פתוגן ספציפי.

פרוטאומיקה מלמטה למעלה היא טכניקת MS פופולרית המאפשרת הכנת מדגם לניהול, שבה פפטידים נוצרים על ידי עיכול אנזימטי ספציפי לרצף ואחריו הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית, זיהוי וכימות על ידי MS10,11. כאן, אנו מציגים שיטה המדגימה אסטרטגיית רכישה תלוית נתונים שמטרתה להשיג כיסוי לא משוחד של פרוטאום מבוסס זיהום או 'זיהום'. באופן ספציפי, כימות ללא תווית (LFQ) שופך את התלות בתוויות כימיות או מטבוליות לזיהוי חזק ומדויק של שינויים ברמת החלבון על פני פרוטאומים מרובים, הפחתת טיפול במדגם ועיבוד שלבים12,13. יישום אוניברסלי זה חוקר חלבונים המיוצרים ברגע נתון בתוך תא ללא תלות בכל ייצור חלבון צפוי; לכן, תובנות חדשניות עשויות להתגלות כי הם קריטיים לזיהום.

זרימת העבודה המתוארת בזאת מותאמת במיוחד כדי לחקור שינויים ברמת החלבון של C. neoformans במהלך תנאי חיקוי זיהום עם תאים חיסוניים מארחים (איור 1). במקום להסתמך על בידוד והפרדה של סוגי תאים, גישה זו מחלצת את פרוטאום המארח והפתוגן יחד, ומשתמשת בהפרדה ביואינפורמטית באמצעות שני מסדי נתונים ספציפיים לאורגניזם כדי להבחין בין ייצור חלבונים ספציפי למינים. שיטה זו מציעה יתרונות עבור מספר בלתי מוגבל של דגימות להיות מעובד ללא שלבי הכנה יקרים במיוחד הדרושים במחקרי תיוג מבוססי איזוטופ או שבר. יתר על כן, זרימת עבודה זו תומכת בפרוטוקולי מיצוי חלבונים ממוטבים הניתנים להעברה למגוון רחב של פתוגנים פטרייתיים ובקטריאליים המסוגלים למקד ולהדביק תאים חיסוניים מארחים. בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר את השלבים להשלמת מיצוי חלבון לא משוחד ועיבוד מדגם לטרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, ואחריו נתונים וניתוח סטטיסטי, המסוגלים לספק שפע של ידע בחלבונים פטרייתיים משמעותיים לזיהום בשילוב עם פרופיל מקיף של תגובת ההגנה המארחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שורה מונצחת של מקרופאגים הנגזרים מעכברי BALB/c שימשו לפרוטוקול הבא שאושר על ידי פרוטוקול ניצול בעלי חיים 4193 של אוניברסיטת גואלף. יש לציין, זנים אחרים של עכברים או מקורות אחרים של תאים מונצחים ניתן להחיל על הפרוטוקול המתואר עם בדיקות מספיקות כדי לייעל את הפרמטרים המפורטים. הפרוטוקול הבא ינווט את השלבים המתחילים בבקבוקון קפוא של תאי מקרופאגים. התאים מאוחסנים ב-10% FBS (סרום שור עוברי), 1% ל-גלוטמין ו-5% תערובת עט/סטרפטומיצין (פניצילין-סטרפטומיצין) ל-DMEM (מדיום הנשר שעבר שינוי של דולבקו) ו-20% DMSO (דימתיל סולפוקסיד).

1. פולחן של ג. ניאופורמנס

  1. באמצעות מניית גליצרול, פס wildtype C. neoformans זן (H99) על שמרים תמצית פפטון דקסטרוז (YPD) צלחת אגר לבודד מושבות בודדות.
  2. דגירה לילה במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור סטטי.
  3. בחר מושבה אחת של זן ותרבות wildtype C. neoformans ב 5 מ"ל של מרק YPD במבחנה 10 מ"ל כתרים רופף. בצע בהכפלה מרובעת.
  4. דגירה לילה במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב 200 סל"ד.
  5. למחרת תת תרבות כל תרבות לילה בדילול 1:100 לתוך מרק YPD 3 מ"ל.
  6. מדידת ערכי צפיפות אופטית (OD600nm)של תרבות פטרייתית כדי לקבוע את שלב אמצע יומן הרישום. בהתאם ספקטרופוטומטר, C. neoformans זן wildtype מגיע באמצע שלב יומן בדרך כלל בעקבות דגירה 6 עד 8 שעות ב- YPD עם ערכי ODכלליים 600nm הנעים בין 1.0 ל 1.5.
  7. ברגע שהתאים מגיעים לשלב אמצע היומן, קח aliquot 10 μL של השעיית תא פטרייתי לתוך צינור נקי 1.5 מ"ל microcentrifuge לדלל 1:100 מלוחים סטריליים 1x פוספט אגירה (PBS). לספור את מספר התאים באמצעות המוציטרומטר.

2. Culturing של תאי מקרופאג

הערה: ודא שסביבת העבודה מעוקרת לפני עבודת תרבות התאים.

  1. הכנת מדיום תרבות התא
    1. מדיום עם תוספי אנטיביוטיקה: הוסיפו 10% FBS (סרום שור עוברי), 1% ל-גלוטמין ו-5% תערובת עט/סטרפטוצין (פניצילין-סטרפטומיצין) לתערובת DMEM (בינוני הנשר שעבר שינוי של Dulbecco). יש לסנן מדיום באמצעות מערכת סינון מלאה של 0.2 מיקרומטר ולאחסן ב-4°C.
    2. מדיום ללא אנטיביוטיקה: בצע פרוטוקול זהה אך להשמיט תערובת עט / סטרפטוקוקוס.
  2. זריעת תאי מקרופאג'
    הערה: יש לחמם מדיום עם תוספי אנטיביוטיקה (2.1.1.) ל-37°C לפני עבודת תרבות התאים.
    1. להפשיר בקבוקון של תאי מקרופאג במהירות באמבט חרוזים 37 °C (60 °F).
    2. לשטוף תאים של פתרון הקפאה על ידי resuspending התאים במדיום 1 מ"ל תוספי אנטיביוטיקה.
      הערה: אמצעי זהירות נוספים נדרשים כדי להבטיח שהתאים לא יתפזרו עקב צנרת קשה.
    3. העבר תאים שעברו שימוש חוזר לצינור סטרילי של 15 מ"ל.
    4. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הסר בזהירות על טבעי עם פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום.
    6. בעדינות resuspend גלולה ב 10 מ"ל של אנטיביוטיקה בתוספת בינונית.
    7. בעדינות פיפטה respended תאים לתוך 60 x 15 מ"מ תאים מטופלים צלחת.
    8. צלחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לילה.
  3. מעבר ראשוני של תאי מקרופאג'
    הערה: מלאי תאים קפואים יכיל בדרך כלל בין 5 ל-10 מיליון תאים לכל בקבוקון (כ- 1 מ"ל). ביום שלאחר מכן, תאי מקרופאג ששרדו את פרוטוקול הזריעה ידבקו לתחתית צלחת תרבות התא ויהיו מוכנים לתזוזה.
    1. מדיום חם בתוספת אנטיביוטיקה (שלב 2.1.1) עד 37 מעלות צלזיוס לפני עבודת תרבות התא. ודא שסביבת העבודה מעוקרת לפני עבודת תרבות התאים. דמיינו תאים באמצעות מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהתאים דבקים ובריאים.
    2. הסר מדיום תרבות התא מן המנה או עם פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום.
    3. הוסיפו בעדינות 5-7 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר (מלוחים עם אגירת פוספט) לתבשיל 60 x 15 מ"מ.
    4. להטות בעדינות את המנה לשטוף תאים דבקים.
    5. הסר PBS באמצעות פיפטה סרולוגית או שאפתן ואקום.
    6. מוסיפים 1 מ"ל של PBS קר (מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס) לתאים, להטות את המנה כדי להפיץ PBS על כל התאים, ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות.
    7. שחרר תאים על ידי הקשה עדינה של המנה, pipeting PBS קר נגד התאים, או באמצעות מגרד תאים.
    8. מוסיפים 9 מ"ל של מדיום תוספי אנטיביוטיקה למנה.
    9. בצלחת חדשה של 60 x 15 מ"מ, הוסיפו 9 מ"ל של מדיום טרי בתוספת אנטיביוטיקה ו-1 מ"ל של תאים שעברו שימוש חוזר מהמנה המקורית.
    10. לאחר שמספר לוחות ההעברה הרצויים מולאו, ניתן להשליך תאים שעברו שימוש חוזר מהמנה המקורית.
    11. דגירה את המנה החדשה בהגדרות שהוזכרו לעיל (שלב 2.2.8).
    12. בצע את המעבר הבא כאשר התאים הגיעו 70-80% מפגש (בערך כל 2 ימים בהתאם לקו התא ובינוני בשימוש).
      הערה: יש להעביר תאי מקרופאג' לפחות חמש פעמים לפני ניסויי זיהום. בהתאם לקו התא, ניסויי זיהום צריכים להתבצע על ידי 25 עד 30 מעברים. לאחר 25 עד 30 מעברים, יש להקפיא או להשליך תאים. ניתן לבחור בסעיף 2.4 או 2.5 על סמך תוכניות הניסוי. סעיף 2.4 ישמש עבור הסעיפים הבאים.
  4. זריעת תאי מקרופאג' לפני ההדבקה
    1. בצע את שלבי פרוטוקול המעבר 2.3.1 עד 2.3.7.
    2. שימוש בהמוציטרומטר או במונה תאים אוטומטי קובע את צפיפות התא (תאים/מ"ל).
    3. העבר 0.3 x 106 תאי מקרופאג' לבאר אחת של לוח תרבות תאים של 6 בארות.
    4. התאם את הנפח הכולל של היטב ל 1 מ"ל באמצעות מדיום תוספי אנטיביוטיקה (שלב 2.1.1).
    5. חזור על שלבים 2.4.3 ו 2.4.4 עד 8 בארות מולאו (4 בארות מלאות בשתי צלחות נפרדות).
    6. באופן אופציונלי, מלאו את שתי הבארות הנותרות ב-1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר כדי לשמור על רמות הלחות במהלך הדגירה.
    7. אפשר לתאים לגדול בתנאי דגירה המוזכרים בשלב 2.2.8 עבור 2 d לפני ההדבקה.
  5. זריעת תאי מקרופאג' ביום ההדבקה
    1. בצע את שלבי פרוטוקול המעבר 2.3.1 עד 2.3.7.
    2. שימוש בהמוציטרומטר או במונה תאים אוטומטי קובע את צפיפות התא (תאים/מ"ל).
    3. זרע 1.2 x 106 תאי מקרופאג לתוך באר אחת של צלחת תרבית תאים 6-well.
    4. התאם את הנפח הכולל של היטב ל 1 מ"ל באמצעות מדיום תוספי אנטיביוטיקה (2.1.1).
    5. חזור על 2.4.3 ו 2.4.4 עד 8 בארות מולאו (4 בארות מלאות בשתי צלחות נפרדות).
    6. באופן אופציונלי, מלאו את שתי הבארות הנותרות ב-1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר כדי לשמור על רמות הלחות במהלך הדגירה.
    7. דגירה תאים בתנאים שהוזכרו בשלב 2.2.8 עבור 3 שעות כדי לאפשר לתאים לדבוק בארות.

3. זיהום של תאי מקרופאג' עם C. neoformans

הערה: עם ההגעה 70-80% מפגש, יהיו כ. 1.2 x 106 תאי מקרופאג לכל באר. כדי להשיג את הריבוי הרצוי של זיהום (MOI) של 100:1, 1.2 x 108 תאים פטרייתיים נדרשים עבור כל תגובה. תרבויות חייבות להיות מוגדרות בהתאם פי ארבעה ביולוגית.

כתב ויתור: MOI של 100:1 השיג תוצאות רצויות בקבוצת המחקר שלנו והוא נועד כהצעה לקוראים. ייתכן שיידרש MOI נמוך יותר עבור זנים זיהומיות יותר של C. neoformans או עבור קווי תאים מקרופאגים גמישים פחות. אימות של זיהום (סעיף 3.5) יכול לשמש כדי לקבוע את MOI האידיאלי עבור C. neoformans מסוים – שילובי מקרופאגים.

  1. הכנת תאים פטרייתיים
    1. בצע את שלב 1 לצמיחה של C. neoformans לשלב אמצע יומן.
    2. לאסוף וצנטריפוגה תאים ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות, בעדינות לשטוף גלולה עם PBS טמפרטורת החדר סטרילי, ולחזור על סך של שלוש שטיפות.
    3. Resuspend תאים במדיום תרבית תאים ללא אנטיביוטיקה (שלב 2.1.2) כדי להשיג ריכוז של 1.2 x 108 תאים / מ"ל.
  2. הכנת תאי מקרופאג'
    1. דמיינו כל באר בצלחת של 6 בארות כדי להבטיח שהתאים הגיעו ל-70-80% מפגש. לחלופין, ניתן למדוד תאים כדי להשיג כ. 1.2 x 106 תאי מקרופאג ' לבאר.
    2. בצע את שלבים 2.3.1 עד 2.3.4.
  3. תרבות משותפת של C. ניאופורמנים ותאי מקרופאג'
    1. הוסף 1 מ"ל של תאי C. neoformans שעברו שימוש חוזר (שלב 3.1.3) ל- 4 בארות המכילות תאי מקרופאג שהוכנו בסעיף 3.2.
      הערה: יהיה צורך לחשב את מספר הלוחיות הנדרש לפני תחילת הניסוי. הוסף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (שלב 2.1.2) לבארות ריקות.
    2. אפשר לתאים להדגיר בתנאים המפורטים (שלב 2.2.8) למשך 3 שעות.
    3. הסר מדיום תרבות התא מהצלחת או עם פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום.
    4. הוסיפו בעדינות 1 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
    5. להטות בעדינות את הצלחת לשטוף תאים חוץ תאי C. neoformans שאינם מחוברים או שאינם phagocytosed.
    6. הסר PBS באמצעות פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום, לחזור על עצמו בסך הכל שלוש שטיפות. חזור על 3.3.4 עד 3.3.5 פעמים נוספות.
  4. מקרופאגים לא מודבקים
    1. כמו כן, השתמש 4 בארות של צלחת 6 באר לשמש דגימות מקרופאג בלבד. הוסף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (שלב 2.1.2) לבארות אלה.
    2. חזור על שלבים 3.3.2 עד 3.3.6.
  5. אימות זיהום
    הערה: באמצעות בדיקת ציטוקסיות, ניתן למדוד מיומנות זיהום. הפרוטוקול הבא ידגיש את היישום של מוצר cytotoxicity כדי למדוד LDH (לקטט דהידרוגנאז) לשחרר. ניתן להשתמש גם במוצרי ציטוקסיטיות אחרים.
    1. הכנת זיהום C. neoformans של תאי מקרופאג'
      1. חזרה על שלבים 1, 2 ו- 3 (עד 3.5). ניתן לבצע את מבחני LDH המשולשים, אם הם מועדפים.
      2. לאחר שלב 3.3.6, להוסיף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (2.1.2) לכל באר בצלחת 6-well.
      3. חזור על שלבים 2.4.3 ו- 2.4.4 עד 3 בארות בתוספת בארות 3n מולאו (כאשר n הוא מספר נקודות הזמן שנמדדו).
      4. דגירה תאים בתנאים המפורטים בשלב 2.2.8.
      5. בנקודות זמן נבחרות (לדוגמה, 1, 3, 6, 12 ו- 24 שעות) אוספים סופרנאטנט למדידת שחרור LDH בהתאם להוראות היצרן
      6. במקביל, תאי מקרופאג' לא מושפעים יועברו לערך שנקבע עבור ציטוטוקסיות מרבית.
      7. חשב ציטוקסיות באופן הבא:
        Equation 1

4. אוסף לדוגמה

  1. תרבות משותפת ואוסף מקרופאג' לא מודבק
    1. מוסיפים 1 מ"ל של PBS קר לתאים (מ 3.3.6 ו 3.4.2) ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות.
    2. שחרר תאים מהצלחת על ידי הקשה עדינה של הצלחת או צינור עדין PBS קר נגד התאים.
      הערה: מגרד תאים יש להימנע כמו זה יכול לגרום תמוגה של תאים.
    3. פיפטה הכניסה תאים לצינור של 15 מ"ל.
    4. תאי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant.
    5. לעבד תאים (כמפורט בשלב 5) מיד או פלאש קפוא חנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר.

5. פרוטאום תאי

הערה: יש למטב תמוגה מספקת עבור סוג התא שנותח (כלומר, כמות המחזורים והמאטורות תלויה בגודל גלולת התא ובאחוז הכוח של דגם סוניקטור בדיקה).

  1. תמוגה נגועה של תאי מקרופאג'
    1. Resuspend תאים כדוריים (שלב 4.1.5) ב 300 μL של 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) המורכב טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז מומס טרי.
      הערה: טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז אחת מתווספת ל-10 מ"ל של קר כקרח 100 מ"מ טריס-HCl (pH 8.5) לפני תחילת הניסוי.
    2. בדיקה sonicate תאים באמבט קרח במשך 15 מחזורים של 30 s על ו 30 s כבוי, כדי lyse התאים.
    3. תאי צנטריפוגה לזמן קצר במשך 30 s ב 400 x גרם, נזהר לא ליצור גלולה, רק כדי להסיר נוזל בצדי צינורות ואחריו העברת מדגם צינור 2 מ"ל Lo-bind microcentrifuge.
    4. הוסף 1:10 נפח של 20% SDS לריכוז הסופי של 2%.
    5. הוסף 1:100 נפח של 1 M dithiothreitol (DTT) לריכוז הסופי של 10 מ"מ ומערבבים את המדגם ביסודיות על ידי pipetting, ואחריו דגירה על בלוק חימום תרמי ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 800 סל"ד נסער. לאחר מכן, קריר לטמפרטורת החדר (קירור יכול להיעשות על קרח).
    6. הוסף 1:10 נפח של 0.55 M iodoacetamide (IAA) כדי לקבל ריכוז סופי של 55 מ"מ ולערבב את המדגם ביסודיות על ידי pipetting. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 20 דקות.
    7. הוסף 100% אצטון כדי לקבל ריכוז סופי של 80% אצטון ולאחסן מדגם לילה ב -20 מעלות צלזיוס כדי לזרז חלבונים.
  2. עיכול חלבונים
    1. למחרת, לאסוף את גלולת משקעים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 x g ו 4 מעלות צלזיוס. להשליך supernatant ולשטוף גלולה עם 500 μL של 80% אצטון. חוזרים על הפעולה במשך שתי שטיפות בסך הכל. גלולה יבשה אוויר בטמפרטורת החדר לאחר שטיפות.
    2. Resolubilize גלולת חלבון ב 100 μL של 8 M אוריאה / 40 מ"מ HEPES, כדי להבטיח solubilization מלא, מערבולת או sonicate באמבט מי קרח במשך 15 מחזורים של 30 s על ו 30 s off.
      הערה: התאמת נפח אוריאה / HEPES נקבעת על גודל גלולת תא מזרז, אם שינויים מתרחשים כל אמצעי האחסון במורד הזרם חייב להיות מותאם כראוי.
    3. לכמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון (למשל, בדיקת חלבון BCA) בהתאם להוראות היצרן ולהתאים למדידת רקע על ידי נורמליזציה ריקה עם 8 M אוריאה/40 מ"מ HEPES.
    4. הוסף 300 μL של 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט כדי לקבל ריכוז סופי של 2 M אוריאה.
      הערה: הזדמנות לנרמל את ריכוז החלבון למדידות במורד הזרם, הציע לעכל 100 מיקרוגרם של חלבון ולאחסן את המדגם הנותר מעוכל על ידי הקפאת פלאש בחנקן נוזלי ואז לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס לטווח קצר, או ב -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך יותר.
    5. הוסיפו 2:50 (v/w) יחס אנזים לחלבון של תערובת פרוטאז טריפסין/ליס-C על קרח והקש בעדינות על הצינור כדי לערבב, דגירה לילה בטמפרטורת החדר.
    6. לאחר הדגירה, להפסיק את העיכול על ידי הוספת 1:10 נפח עצירת פתרון (20% אצטוניטריל, 6% חומצה trifluoroacetic) ודגימות צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לאסוף supernatant (מורכב פפטידים מתעכלים) ולזרוק כל פסולת כדורית או משקעים.
  3. התפלת פפטיד
    1. הפעל C18 עצור וללכת חילוץ (STAGE) עצה (המורכב 3 שכבות שרף C18 ב 200 טיפ פיפטה μL) על ידי הוספת 100 μL של 100% אצטוניטריל וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 2 דקות.
    2. השווה את קצה שלב C18 על ידי הוספת 50 μL של חוצץ B (80% (v / v) אצטוניטריל, 0.5% (v / v) חומצה אצטית) וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 2 דקות.
    3. השווה את קצה שלב C18 על ידי הוספת 200 μL של חוצץ A (2% (v / v) אצטוניטריל, 0.1% (v / v) חומצה trifluoroacetic, 0.5% (v / v) חומצה אצטית) וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 3-5 דקות.
    4. הוסף ~ 50 מיקרוגרם של מדגם מתעכל על קצה שלב C18 וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 3-5 דקות, או עד המדגם עבר דרך עמודת ספין. פלאש להקפיא את המדגם המתעכל הנותר בחנקן נוזלי ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס, עד הצורך.
    5. לשטוף את קצה שלב C18 עם 200 μL של חוצץ A וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 3-5 דקות.
    6. הוסף 50 μL מאגר B לקצה שלב C18 וצנטריפוגה ב 500 x g במשך 2 דקות. לאסוף פפטידים eluted בצינורות PCR 0.2 מ"ל.
    7. יבש את הפפטידים המרופטים בצנטריפוגה ואקום במשך 30-40 דקות במהירות מקסימלית. דגימות מיובשות לחלוטין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר או ב -20 מעלות צלזיוס עד מעובד.
      הערה: פפטידים מיובשים ומותפלים הם הגשות מדגם מתאימות למתקני ספקטרומטריית מסה לעיבוד וניתן לשלוח אותם בטמפרטורת הסביבה.

6. ספקטרומטריית מסה

  1. לשקם פפטידים ב 10 μL מאגר A ולמדוד את הריכוז הדרוש כדי להזריק ~ 1.5 כדי 3 פפטידים מיקרוגרם על עמודה MS. כמות הדגימה תהיה תלויה במכשור.
  2. השתמש הדרגתי שנקבע מראש של אצטוניטריל (כ. 5-60%) ב 0.5% חומצה אצטית על פני הזמן הרצוי (למשל, 2 שעות) כדי להפריד פפטידים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, ואחריו יינון electrospray לתוך ספקטרומטר המסה.
  3. השג סריקות MS באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה במצב רכישה תלוי נתונים (m/z 300 עד 1650).
    הערה: אחוז ואורך הדרגתי נקבעים על-ידי הניסוי והמשתמש. הגדרות ספקטרומטר מסה מדויקות תלויות במכשור, בניסוי ובהעדפת המשתמש.

7. ניתוח נתונים

הערה: ניתן לעבד נתוני MS עם צינורות ביואינפורמטיקה רבים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים עיבוד באמצעות הפלטפורמות הזמינות לציבור של MaxQuant ו- Perseus, אך ממליצים למשתמשים בודדים להעריך כלים ביואינפורמטיים המתאימים לניתוח, להעדפה ולשימוש.

  1. טען קבצי נתונים לא מעובדים (ישירות ממכשיר MS) באמצעות תוכנת MaxQuant. זהה חלבונים תחת פרמטרי החיפוש של MaxQuant ששונו; מינימום של שני פפטידים ייחודיים הדרושים לזיהוי חלבונים באמצעות גישת פיתיון יעד לשיעור גילוי כוזב של 1%, ליישם כימות ללא תווית עם התאמה בין ריצות, לשלב את האורגניזמים קובץ FASTA המתקבל ממסד הנתונים UniProt (כלומר, Cryptococcus neoformans H99, שרירים) כדי לזהות ולכמת פפטידים הנוכחי עם מנוע החיפוש אנדרומדה. התייעץ עם כלים מקוונים ציבוריים של MaxQuant לקבלת הדרכות מפורטות (ראה טבלת חומרים).
  2. העלה את קובץ הפלט MaxQuant ('קבוצות חלבונים.txt') לתוך פרסאוס.
  3. סנן שורות המכילות תוצאות חיוביות ומזהמים פוטנציאליים כוזבים, וכן השתנה רק על-ידי פפטידים של אתר באמצעות 'סנן שורות בהתבסס על עמודה קטגורית'.
  4. המר ערכי נתונים בסולם יומןרישום 2.
  5. צור קבוצות ערכה של נתונים על-ידי מתן ביאור קטגורי לשורות.
  6. סנן ערכת נתונים לפי ערכים חוקיים כדי להגדיר ניתוק לגילוי חלבונים.
    הערה: לניתוח מחמיר וחזק מוצע שיעור זיהוי של >50%. לדוגמה, אם עובדו ארבעה שכפולים, ייבחר מספר מינימלי של שלושה ערכים חוקיים.
  7. אם הדבר עדיף, הקבץ נתונים על-ידי החלפת ערכים חסרים בהתפלגות הנורמלית.
    הערה: ערכים לא מזוהים ממוטבים על בסיס התפלגות רגילה ומספקים עוצמת LFQ אקראית להחלפת מצייני מיקום 'NaN' כדי לדמות מדידות שפע טיפוסיות. אימפוטציה זו מספקת פלטפורמה לניתוח סטטיסטי במורד הזרם הדורש נתונים הניתנים לכימות.
  8. הוסף ביאורים לשורות החלבון (למשל שמות חלבונים, מונחים אונטולוגיים של גנים).
    הערה: זרימת עבודה זו של פרסאוס שנוצרה היא כעת מסגרת איתנה לעיבוד ביואינפורמטי נוסף, ניתוח סטטיסטי ופריטים חזותיים של נתונים, עיין בכלים המקוונים הציבוריים של פרסאוס לקבלת הדרכות מפורטות (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר זיהוי וכימות של חלבונים הנגזרים הן מהפתוגן הפטריוני, C. neoformansוהן מהמארח, תאי מקרופאג', בניסוי אחד. בעקבות תרבות משותפת, תאים נאספים ומעובדים יחד ומופרדים ביו-אינפורמטית בהתבסס על פרופילי פפטיד ספציפיים לכל מין. זוהי גישה רבת עוצמה להגדרת יחסי הגומלין של יחסי המארח-פתוגן במהלך ההדבקה. מספר החלבונים שזוהו מהניסוי תלוי בחומר ההתחלתי, בהכנת הדגימה, באורך השיפוע, במכשור טרשת נפוצה ובזרימת עבודה ביואינפורמטית. באמצעות הפרוטוקול המתואר בזאת, אנו מזהים בדרך כלל כ- 8,000 חלבונים מהניסוי עם 1,500 חלבונים ניאופורמנים ו- 6,500 חלבונים מארחים. לאחר עיבוד ערכות הנתונים, אנו יוצרים עלילה לניתוח רכיבים עיקריים (PCA) כדי לבחון גורמים קריטיים המניעים את הניתוח שלנו (איור 2A). כאן, אנו רואים את המרכיב הגדול ביותר של הפרדה בין הנתונים נגוע לעומת דגימות שאינן נגועות, כפי שהיינו מצפים מהתכנון הניסיוני (רכיב 1, 79.8%), ומאפיין הבחנה שני של הדגימות הוא שונות ביולוגית (רכיב 2, 5.7%). לאחר מכן, מתאם פירסון בשילוב עם קיבוץ הירארכי לפי מרחק אוקלידי מקבץ את הדגימות ומאפשר כימות השונות בין השכפולים (איור 2B). בניתוח שלנו, ראינו אשכולות ברורים של דגימות נגועות לעומת לא נגועות לשכפל רבייה הנעים בין 95-96%, המייצגים רבייה טובה בין השכפולים. לבסוף, אנו מבצעים בדיקת tשל סטודנט מתוקנת לבדיקות השערה מרובות באמצעות שיעור גילוי כוזב של Benjamini-Hochberg (FDR) (p-value ≤ 0.05; רוזוולט = 0.01; s0 = 1) כדי לזהות חלבונים עם הבדלים משמעותיים בשפע במהלך ההדבקה בהשוואה לבקרות שאינן נגועות (איור 2C). כאן, אנו מזהים 760 חלבונים עם שינויים משמעותיים בשפע, כולל 117 חלבונים מארחים עם 86 המראים ירידה משמעותית ו -31 מראים עלייה משמעותית עם ההדבקה. יש לציין, אנו גם רואים עלייה משמעותית בשפע של חלבונים פטרייתיים, כצפוי במהלך ההדבקה. עם נתונים אלה, ניתוחים עוקבים, כולל מיפוי רשת, אפיון silico, וניסויי מעקב מבוצעים כדי לאמת את הנתונים ולחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים ביסוד התגובה המארחת לארסיות.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית לניתוח מקרופאגים נגועים ב- C. neoformans. זרימת העבודה מתחילה באיסוף מקרופאגים נגועים בפקדים C. neoformans או שאינם נגועים. חלבונים מופקים על ידי הפרעה מכנית וכימית, ואחריו הפחתה ואלקילציה, משקעים אצטון, ועיכול אנזימטי. פפטידים מטוהרים על גבי טיפים שלב C18, מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, נתון ליינון electrospray, ונמדד על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. הנתונים מעובדים, מנותחים ומדמיינים בפלטפורמות הביואינפורמטיקה הזמינות לציבור, MaxQuant (עם אנדרומדה) ופרסאוס14,15,16. ניסויים שבוצעו בשריר הארבע ראשי הביולוגי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: נתונים מייצגים עבור זיהום C. neoformans של תאי מקרופאגים. (A)ניתוח רכיבים עיקריים מדגים הבחנה בין מקרופאג' נגוע לעומת מקרופג' שאינו נגוע (רכיב 1, 79.8%), לבין קיבוץ באשכולות של משכפלים ביולוגיים (רכיב 2, 5.7%). (ב)מפת חום של מתאם פירסון מותווה על ידי קיבוץ באשכולות הירארכיים לפי מרחק אוקלידי כדי להראות קיבוץ באשכולות של דגימות (נגועות לעומת לא נגועות) ולשכפל רבייה (>95%). (C)חלקת הר געש של חלבונים מזוהים. כחול = חלבונים פטרייתיים עם שינוי משמעותי בשפע; שחור = חלבוני מקרופאג עם שינוי משמעותי בשפע. מבחן tשל התלמיד (p-ערך ≤ 0.05), רוזוולט = 0.01; s0 = 1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים הכנת תאי מקרופאג ואיסוף דגימות תרבות משותפת לעיבוד חלבונים עם הפרעה מינימלית לתאים. חשוב לבצע שלבים של כביסה, מחוסן והסרה של תאי מקרופאגים חסידים בעדינות ובזהירות כדי למנוע תמוגה מיותרת של תאים לפני האיסוף. הקמת MOI הנכון עבור הניסוי הוא גם קריטי כמו מחוסן עם MOI גבוה מדי יכול לגרום מוות תאי מקרופאג מהיר וקושי באיסוף ועיבוד דגימות עבור MS. לעומת זאת, מספרי MOI נמוכים יובילו פחות תאים פטרייתיים phagocytosed וזיהוי מוגבל של חלבונים פטרייתיים במערכת הביולוגית. כדי להתגבר על מגבלות כאלה, אנו ממליצים לבצע ניסויי בדיקה עם MOIs שונים, הנתמכים על ידי מבחני מוות של תאים (למשל, כימות LDH) כדי להגדיר את מספר התאים הפטריות היוזמים תגובה מארחת אך אינם הורגים את התאים המארחים לפני האיסוף. עבור הניסויים, אנו שואפים לזהות חלבונים פטרייתיים הקשורים לזיהום, הדורשים MOI גבוה (100:1) כדי לזהות כראוי חלבונים פטרייתיים בקרב חלבונים מארחים בשפע רב. אנו מבצעים באופן שגרתי בדיקות ציטוטוקסיות מקרו-אפאג' כדי להעריך את השפעת MOI על מוות תאי מארח לפני ביצוע הניסוי כולו. תזמון הדגירה של תאי C. neoformans עם מקרופאגים הוא גם חיוני כמו תאים פטרייתיים עשויים להחזיק כמוסות פוליסכרידים גדולים ולכן, מקרופאג דורשים יותר זמן לבלוע. אנו בוחרים להשתמש בזמן דגירה של תרבות משותפת של 3 שעות לניסוי המתואר, שכן מצאנו כיסוי טוב של הפרוטום הפטרייתי בנקודת זמן זו ולספק "הצמד ירה" של תגובת המארח; עם זאת, החוקרים עשויים לרצות לחקור נקודות זמן מוקדמות ומאוחרות יותר ולבחון כיצד התזמון משפיע על ייצור החלבון הפטריות והמארח. לחלופין, יצירת מקרופאג' עבור opsonization בוצעה כדי לסייע בתהליך phagocytic17,18.

עבור איסוף מדגם, אם דגימות אינן מעובדות מיד פלאש הקפאה בחנקן נוזלי יעזור למנוע השפלה לא רצויה של חלבונים על ידי פרוטאזות נוכח בדגימות. בנוסף, עבור ניתוחים פרוטאומיים מבוססי MS, פוטנציאל הזיהום מאבק או קרטין (למשל, תאי עור ושיער) צריך להיות מוגבל באמצעות כפפות ניטריל, מעילי מעבדה, ושטיפה של כל המשטחים עם 70% אתנול לפני תחילת הניסויים. יתר על כן, הפרוטוקולים שתוארו לעיל הם ספציפיים למדגם תרבות משותפת להגדיר המתואר אבל ניתן לשנות עבור אופטימיזציה זרימת עבודה מיצוי חלבון, לפיהצורך 19,20. הזדמנויות לשינוי זרימת העבודה ואופטימיזציה לסוגי תאים ספציפיים כוללות את טכניקות ההפרעה המכנית והכימית שנבחרו, משך וטמפרטורה של עיכול אנזימטי והפרדת הדגימות. לדוגמה, תמוגה של תאי C. neoformans מבוצעת בדרך כלל על ידי מכות חרוזים מכניות; עם זאת, ראינו כיסוי פרוטאום מוגבר בעקבות sonication בדיקה ולכן, ממליץ על זה לשיבוש מכני של התאים הנגועים19,21,22. לדוגמה, פיצול דגימות פפטיד לתוך aliquots על ידי שבר pH גבוה או כרומטוגרפיה אי הכללה גודל עשוי להפחית את המורכבות מדגם ולשפר את עומק הכיסוי על ספקטרומטר מסה9. יתר על כן, כדי להשיג את עומק הכיסוי כדי לזהות כ. 8,000 חלבונים מארחים ופטריות, נדרשת מערכת ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (למשל, QExactive Exploris, פיוז'ן לומוס, timsTOF Pro).

השימוש ב- LFQ לכימות שינויים ברמות החלבון במהלך ההדבקה הוא גישה אמינה וחסכונית עבור פרוטאומיקה מבוססת MS12. היא מאפשרת כימות חלבונים על ידי שפע יחסי ללא צורך בשלבי עיבוד מדגם נוספים. בנוסף, הניתוח מבוצע לאחר השלמת הניסוי, ומעניק את עצמו ליישומים אוניברסליים ולעיצוב מחקר גמיש. עם זאת, המגבלות של LFQ כוללות זמן מכשור מוגבר שכן דגימות חייבות לפעול ברצף ולא ניתן לשלב אותן, ההשלכה בין הדגימות יכולה להיות מאתגרת, והצורך בהדחה להחלפת ערכים חסרים יכול להיות גבוה23. גישות חלופיות לכימות שפע חלבונים כוללות טכניקות תיוג מטבוליות (למשל, איזוטופ יציב של חומצות אמינו בתרבית התאים) וטכניקות תיוג כימיות (למשל, תגי מסה טנדם), המאפשרות שילוב דגימות כדי לקצר את זמן המכשיר, לספק מיון אמין בין דגימות, ובדרך כלל להוביל לערכים פחות חסרים24,25. עם זאת, גישות כאלה דורשות שלבי טיפול ועיבוד מדגמיים נוספים, מורכבות וזמן מוגברים של ניסויי מעבדה רטובה, וכן דורשים תכנון ניסיוני קבוע. כדי לבחור שיטת כימות אופטימלית לניסויים מוצעים, על המשתמשים לשקול תכנון מחקר והשוואת דגימות, מורכבות מעבדה רטובה וניתוח נתונים, כמו גם זמינות זמן מכשור ועלות.

החידוש בפרוטוקול המוצג הוא היכולת להגדיר שינויים בפרוטום הן מנקודת המבט המארחת והן מנקודת המבט של הפתוגן בניסוי אחד. עומק הכיסוי של שני הפרוטומים מאפשר תובנה חדשה לגבי האופן שבו הפתוגן יוזם זיהום וכיצד המארח מגיב בהגנה. יש לציין כי הגישה מתמקדת בהדבקה של התא כולו; עם זאת, הזדמנויות להגדיר תת פרוטאומים או תגובות ממודרות לזיהום קיימות באמצעות שילוב עם טכניקות לוקליזציה מרחבית (למשל, צנטריפוגה, העשרה, תיוג)26,27. כאן, אנו מפרטים את האינטראקציה בין מקרופאגים לבין הפתוגן הפטריוני, C. neoformans; עם זאת, הגישה היא אוניברסלית, וניתן ליישם אותה על אינטראקציות בין מגוון רחב של מערכות ביולוגיות. לדוגמה, השתמשנו לאחרונה בזרימת עבודה דומה כדי לחשוף תגובות כלליות וספציפיות לאתר של נויטרופילים הנגזרים ממודל מורין של קרטיטיס עינית28,29,30. יתר על כן, ערכות נתונים זיהומיות שנוצרו מפרוטוקול זה ניתן לשלב עם פרוטאום במבחנה פרופיל סודי של פתוגן כדי לזהות חלבונים עם שפע שונה בנוכחות תאים מארחים. חלבונים כאלה, המכונים חלבונים הקשורים לזיהום, מספקים שפע של גורמי ארסיות ידועים וחדשניים לאפיון נוסף, כולל ויסות זמני, לוקליזציה ואינטראקציות ישירות בין חלבון לחלבון עם המארח. בסך הכל, זרימת העבודה הפרוטאומית המבוססת על MS מספקת הזדמנות חדשה לחקור את היחסים המורכבים בין מארח לפתוגן בניסוי יחיד עם אוניברסליות והבנה שאינם זמינים בדרך כלל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר ג'ונתן קריגר מ-Bioinformatics Solutions Inc. על הפעלת ספקטרומטר המסה לניסויים ייצוגיים, כמו גם לחברי קבוצת גדס-מקליסטר על עזרתם בהקמה ניסיונית ובמשוב לכתבי יד. המחברים מכירים בתמיכה במימון, בין השאר, מקרן המחקר בנטינג – פרס גילוי מלגת ג'ירסלובסקי, הקרן החדשה למחקר גבולות – חקר (NFRFE-2019-00425), והקרן הקנדית לחדשנות (JELF 38798) עבור J.G.M., כמו גם NSERC קנדה בוגר מלגת – מאסטרס אונטריו בוגר מלגת B.B., ואת המלכה אליזבת השנייה בוגר מלגת מדע וטכנולוגיה עבור A.S..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
  2. Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
  4. Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
  5. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
  6. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
  7. Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
  8. Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
  9. Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
  10. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  11. Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
  12. Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  13. Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
  14. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  15. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  16. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
  17. Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
  18. Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
  19. Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
  20. Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
  21. Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
  22. Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
  23. Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
  24. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  25. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  26. Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
  27. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
  28. Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
  29. Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
  30. Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 164 פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה כימות ללא תווית אינטראקציות מארח-פתוגן תרבות תאי יונקים פתוגן פטרייתי קריפטוקוס ניאופורמנים
זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ball, B., Sukumaran, A.,… More

Ball, B., Sukumaran, A., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (164), e61881, doi:10.3791/61881 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter