Summary
여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.
Abstract
질량 분석법 (MS)기반 정량 적 프로테오믹스의 기술적 성과는 다양한 조건에서 유기체의 글로벌 프로테오메를 분석하기위한 많은 알려지지 않은 길을 열어줍니다. 원하는 숙주로 미생물 병원체의 상호 작용에 적용되는 이 강력한 전략은 감염에 대한 두 관점을 포괄적으로 특성화합니다. 본 명세서에서, 워크플로우는 불멸의 대식세포 세포의 존재에서 치명적인 질병 크립토코코시스의 원인성 제제인 크립토코커스 네오포만의 감염체의 라벨없는 정량화(LFQ)를 설명한다. 이 프로토콜은 단일 실험 내에서 병원균 과 포유류 세포 모두에 적합한 단백질 제제 기술을 자세히 설명하여 액체 크로마토그래피 (LC)-MS / MS 분석을위한 적절한 펩타이드 제출을 초래합니다. LFQ의 높은 처리량 일반 특성은 광범위한 동적 단백질 식별 및 정량화뿐만 아니라 모든 숙주 병원체 감염 설정으로의 전달 가능성을 허용하여 극도의 감도를 유지합니다. 이 방법은 감염 모방 조건 내에서 병원균의 광범위하고 편견없는 단백질 풍부 프로파일을 카탈로그화하도록 최적화되어 있습니다. 구체적으로, 여기서 입증된 방법은 독성에 필요한 단백질 생산과 같은 C. neoformans 병인에 대한 필수 정보를 제공하고 미생물 침입에 대응하는 중요한 숙주 단백질을 식별한다.
Introduction
침습적 곰팡이 감염의 보급은 크게 증가하고 면역 결핍 성소1을가진 개별에서 가장 일반적으로 보고된 받아들일 수 없을 정도로 높은 사망률과 상관관계가 있습니다. Cryptococcus neoformans는 호스트 대식세포 세포 내의 세포 내 생존을 할 수 있는 악명 높은 기회성 곰팡이 병원체입니다. 부적절한 항진균 개입은 곰팡이 보급과 크립토 코칼 뇌막염 및 뇌막염2,3의생명을 위협하는 증상을 초래합니다. 면역 손상 상태의 글로벌 증가는 항진균제의 사용에 병렬 증가를 요구하고있다, 있는 많은 곰팡이 종, C. neoformans를 포함하여, 점점4,5,6을향해 저항을 진화하고있다. 따라서 호스트 방어 반응 및 미생물 병인에 관한 중요한 생물학적 질문에 답하기 위해 강력하고 효율적인 기술을 구현하는 것이 필수적입니다.
강력한 전산 및 생물정보 파이프라인 의 생성을 포함한 질량 분광법(MS)의 기술 발전의 새로운 시대는 호스트 병원체 연구7,8의대규모 분석을 위한 통합 비전의 토대를 제공한다. 기존의 병원성 중심의 프로테오믹 분석은 일반적으로 단백질 상관 관계 프로파일링, 프로테오믹스와 결합된 친화성 크로마토그래피, 및 상호작용제9와같은 포괄적인 방법론을 포함하여 숙주 또는 병원체 원근으로부터의 감염의 시야를 프로파일링한다. 호스트 시스템에 있는 위험한 병원체의 독성에 대한 조사는 엄청난 임상 중요성입니다; 그러나 단일 실험에서 이중 원근 분석을 적용한 것은 이전에는 달성할 수 없는 것으로 간주되었습니다. 예를 들어, 감염을 향한 병원균의 관점은 종종 풍부하게 풍부한 숙주 단백질에 의해 압도되어 저농축 곰팡이 단백질7의검출을 위한 감도가 감소한다. 더욱이, 높은 견본 복잡성은 단 하나 실험 시스템에서 조사하기 위하여 많은 표적을 초대하고 특정 병원체 단백질을 위한 행동의 기계장치를 해명하기 위하여 도전적이다는 것을 증명합니다.
상향식 프로테오믹스는 펩타이드가 서열 특이적 효소 소화에 의해 생성되는 관리식 시료 준비를 가능하게 하는 인기 있는 MS 기법이며, 이어서 MS10,11에의한 액체 크로마토그래피 분리, 식별 및 정량화가 뒤따릅니다. 여기서는 감염 기반 프로테오메 또는 '감염성'의 편견없는 커버리지를 달성하기 위한 데이터 의존적 획득 전략을 보여주는 방법을 제시합니다. 구체적으로, 라벨없는 정량화(LFQ)는 여러 프로테옴에 걸쳐 단백질 수준 변화를 견고하고 정확하게 식별하기 위해 화학 물질 또는 대사 라벨에 대한 의존도를 떨어뜨리고, 샘플 처리 및 처리단계(12,13)를감소시킵니다. 이 보편적인 응용 프로그램은 어떤 예상 된 단백질 생산과 는 별개로 세포 내에서 주어진 순간에 단백질을 생산; 따라서, 감염에 중요한 새로운 통찰력이 발견될 수 있습니다.
본 명세서에 기재된 워크플로우는 숙주 면역 세포를 가진 감염 모방 조건 동안 C. neoformans의 단백질 수준 변화를 탐구하도록 최적화된다(그림1). 세포 모형의 분리 및 분리에 의지하는 대신, 이 접근은 호스트와 병원체 proteome를 함께 추출하고, 종 특정 단백질 생산을 구별하기 위하여 2개의 유기체 특정 데이터베이스를 사용하여 생물정보 분리를 이용합니다. 이 방법은 동위원소 기반 라벨링 연구 또는 분수에 필요한 추가 비용이 많이 드는 준비 단계 없이 무제한의 샘플을 처리할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한, 이 워크플로우는 숙주 면역 세포를 표적으로 하고 감염시킬 수 있는 광범위한 곰팡이 및 세균성 병원체로 이전할 수 있는 최적화된 단백질 추출 프로토콜을 지원합니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 고분해능 MS를 위한 편견없는 단백질 추출 및 샘플 처리를 완료하는 단계를 설명하고, 그 다음에 는 데이터 및 통계 분석이 선행된 호스트 방어 반응의 포괄적인 프로파일링과 결합된 감염에 중요한 곰팡이 단백질에 대한 풍부한 지식을 제공할 수 있는 단계입니다.
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Protocol
BALB/c 마우스에서 파생된 대식세포의 불멸의 선은 겔프 동물 활용 프로토콜 4193 대학에 의해 승인된 다음 프로토콜에 사용되었다. 특히, 마우스 또는 불멸의 세포의 다른 소스의 다른 변종은 상세한 매개 변수를 최적화하기에 충분한 테스트를 통해 설명된 프로토콜에 적용될 수 있다. 다음 프로토콜은 대식세포 세포의 얼어붙은 유리병으로 시작하는 단계를 탐색합니다. 세포는 10% FBS(태아 소 혈청), 1% L-글루타민 및 5% 펜/스트렙(페니실린-스트렙토마이신) 혼합물에서 DMEM(덜벡코의 수정이글 미디엄) 및 20% DMSO(디메틸 설프리산화물)에 저장됩니다.
1. C. 네오포맨의 배양
- 글리세롤 스톡을 사용하여, 일행 야생형 C. 네오포만스 스트레인(H99)을 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 천판에 사용하여 단일 콜로니를 분리한다.
- 정적 인큐베이터에서 37 °C에서 16 시간 동안 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 느슨하게 덮인 10 mL 테스트 튜브에서 YPD 국물의 5 mL에서 야생 형 C. 네오포만스 변형과 문화의 단일 식민지를 선택합니다. 네 배로 수행합니다.
- 200 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 37 °C에서 16 시간 동안 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 다음 날 소문화는 각각 1:100 희석하여 3mL YPD 국물에 희석한다.
- 중간 로그 단계를 결정하기 위해 곰팡이 배양의 광학 밀도(OD600nm)값을 측정합니다. 분광계에 따라 C. 네오포만스 야생형 균주는 YPD에서 6~8h 인큐베이션을 일반적으로 따르는 중간 로그 단계에 도달하며, 일반 OD600nm 값은 1.0~1.5에 달한다.
- 세포가 중간 로그 단계에 도달하면 곰팡이 세포 현탁액의 10 μL 알리쿼트(aliquot)를 깨끗한 1.5mL 미세센심분리기 튜브로 가져가서 멸균 1x 인산정제식염(PBS)에서 1:100을 희석한다. 혈종계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
2. 대식세포 배양
참고: 세포 배양 작업 전에 작업 환경을 살균해야 합니다.
- 세포 배양 배지의 준비
- 항생제 보충 매체: DMEM (덜벡코의 수정 된 독수리 매체)에 10 % FBS (태아 소 혈청), 1 % L-글루타민 및 5 % 펜 / 스트렙 (페니실린 - 스트렙토 마이신) 혼합물을 추가합니다. 0.2 μm 완전 필터 시스템을 통해 배지를 걸게 하고 4°C에 보관하십시오.
- 항생제 없는 매체: 동일한 프로토콜을 따르지만 펜/스트렙 혼합물을 생략합니다.
- 종자 대식세포
참고: 항생제 보충 배지 (2.1.1.) 세포 배양 작업 전에 37°C로 따뜻하게 해야 합니다.- 대식세포의 해동 유리병은 37°C 비드 목욕에서 빠르게 해동한다.
- 1 mL 항생제 보충 배지에서 세포를 다시 중단하여 동결 용액의 세포를 세척한다.
참고: 가혹한 파이펫팅으로 인해 세포가 lyse하지 않도록 추가 예방 조치가 필요합니다. - 재생된 세포를 멸균 15mL 튜브로 이송합니다.
- 펠릿 세포는 실온에서 5 분 동안 400 × g에서 원심 분리에 의해.
- 세로지학적 파이펫 이나 진공 흡인기로 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
- 항생제 보충 배지의 10 mL에서 부드럽게 펠릿을 다시 중단합니다.
- 부드럽게 파이펫은 60 x 15mm 세포 배양 처리 접시에 세포를 재중단.
- 37°C에서 하룻밤 사이에 5% CO2로 접시를 배양합니다.
- 대식세포 세포의 초기 통과
참고: 냉동 셀 주식은 일반적으로 바이알 당 5~1,000만 개의 세포(약 1mL)를 함유합니다. 후속 일에, 파종 프로토콜에서 살아남은 대식세포는 세포 배양 접시의 바닥에 부착되고 통과할 준비가 될 것입니다.- 따뜻한 항생제 보충 배지 (단계 2.1.1) ~ 37°C 세포 배양 작업 전에. 세포 배양 작업 전에 작업 환경을 살균하십시오. 세포를 부착하고 건강하게 보장하기 위해 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 시각화합니다.
- 혈청 피펫 또는 진공 흡인기로 접시에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
- 60 x 15mm 접시에 멸균 실온 PBS(인산염 완충식식염)를 5-7mL 부드럽게 넣습니다.
- 접시를 부드럽게 기울여 부착된 세포를 씻습니다.
- 세로지학적 파이펫 또는 진공 흡인기로 PBS를 제거합니다.
- 감기 PBS 1mL(4°C에 저장)을 세포에 추가하고, 접시를 기울여 모든 세포에 PBS를 분배하고, 실온에서 1분 동안 앉을 수 있도록 한다.
- 접시를 부드럽게 두드리거나, 셀에 대해 차가운 PBS를 피펫팅하거나, 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 방출합니다.
- 9mL의 항생제 보충 배지를 접시에 넣습니다.
- 새로운 60 x 15mm 접시에 9mL의 신선한 항생제 보충 매체와 원래 요리에서 1 mL의 재생 된 세포를 추가하십시오.
- 원하는 패세이징 플레이트의 수가 채워지면 원래 요리에서 다시 중단 된 셀을 버릴 수 있습니다.
- 위에서 언급한 설정에서 새 접시를 배양합니다(2.2.8단계).
- 세포가 70-80%에 도달하면 후속 패세이징을 수행합니다(셀라인 및 사용된 매체에 따라 약 2일마다).
참고: 대식세포는 감염 실험 전에 최소 5배 이상 통과되어야 한다. 세포주에 따라 감염 실험은 25~30개의 구절에 의해 수행되어야 합니다. 25~30개의 구절 이후에 는 세포를 동결하거나 폐기해야 합니다. 섹션 2.4 또는 2.5는 실험 계획에 따라 선택할 수 있다. 섹션 2.4는 다음 섹션에 사용됩니다.
- 감염 전 대식세포 파종
- 패세이징 프로토콜 단계 2.3.1 ~ 2.3.7을 수행합니다.
- 혈류계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포 밀도(cells/mL)를 결정합니다.
- 0.3 x 106 대식세포 세포를 6웰 세포 배양판의 단일 웰로 옮기다.
- 항생제 보충 배지(단계 2.1.1)를 사용하여 1mL까지 의 총 부피를 조정합니다.
- 8 개의 우물이 채워졌을 때까지 2.4.3 및 2.4.4 단계를 반복하십시오 (4 개의 우물이 두 개의 별도 판으로 채워져 있음).
- 선택적으로, 인큐베이션 동안 수분 수준을 유지하기 위해 실온 PBS의 1 mL로 나머지 두 개의 우물을 채웁니다.
- 감염 전 2d에 대해 2.2.8 단계에서 언급된 잠복기 하에서 세포가 성장할 수 있도록 한다.
- 감염 당일 대식세포 파종
- 패세이징 프로토콜 단계 2.3.1 ~ 2.3.7을 수행합니다.
- 혈류계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포 밀도(cells/mL)를 결정합니다.
- 종자 1.2 x 106 대식세포는 6웰 세포 배양 플레이트의 단일 웰로 한다.
- 항생제 보충 배지(2.1.1)를 사용하여 총 1mL까지 잘 의 총 부피를 조정합니다.
- 8 개의 우물이 채워졌을 때까지 2.4.3 및 2.4.4를 반복하십시오 (4 개의 우물이 두 개의 별도 판으로 채워져 있음).
- 선택적으로, 인큐베이션 동안 수분 수준을 유지하기 위해 실온 PBS의 1 mL로 나머지 두 개의 우물을 채웁니다.
- 세포가 우물에 부착할 수 있도록 3h에 대해 2.2.8 단계에서 언급된 조건하에서 세포를 배양한다.
3. C. 네오포만을 가진 대식세포 감염
참고: 70-80%에 도달하면 우물당 약 1.2 x 106 대식세포세포가 존재합니다. 100:1의 감염(MOI)의 원하는 복합성을 달성하기 위해서는, 1.2 x 108 곰팡이 세포는 각 반응에 대해 요구된다. 배양은 생물학적 네 배로 설정해야합니다.
면책 조항: 100:1의 MOI는 우리의 연구 그룹에서 바람직한 결과를 달성하고 독자에게 제안으로 의미된다. 더 낮은 MOI는 더 전염성 C. neoformans 균주 또는 덜 탄력있는 대식세포주에 필요할 수 있습니다. 감염의 검증 (섹션 3.5) 특정 C. neoformans에 대한 이상적인 MOI를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 - 대식세포 조합.
- 곰팡이 세포의 준비
- C. 네오포만의 성장을 위한 1단계를 따라 중간 로그 단계로 이동하십시오.
- 10분 동안 1,500 x g의 원심분리기 세포를 수집하고, 멸균 실온 PBS로 펠릿을 부드럽게 씻고, 총 3개의 세척을 반복합니다.
- 항생제 없는 세포 배양 배지에서 세포를 재중단 (단계 2.1.2) 1.2 x 108 세포/mL의 농도를 달성 하.
- 대식세포 제제
- 세포가 70-80%에 도달하도록 6웰 플레이트에서 각 우물을 시각화합니다. 대안적으로, 세포는 약 1.2 x 106 대식세포 세포를 잘 달성하기 위해 측정될 수 있다.
- 2.3.1에서 2.3.4단계 팔로우합니다.
- C. 네오포만 및 대식세포 공동배양
- 3.2절에 제조된 대식세포세포를 포함하는 4개의 우물에 재부유된 C. neoformans 세포(Step 3.1.3)의 1mL를 추가한다.
참고: 실험을 시작하기 전에 필요한 플레이트 수를 계산해야 합니다. 빈 우물에 항생제없는 배지 (단계 2.1.2)의 1 mL을 추가합니다. - 세포가 나열된 조건(단계 2.2.8)에서 3h에 대해 배양하도록 허용합니다.
- 혈청 피펫 또는 진공 흡인기로 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
- 멸균 실온 PBS 1mL를 부드럽게 추가합니다.
- 접시를 부드럽게 기울여 비 부착되거나 비 phagocytosed 외세포 C. neoformans 세포를 세척합니다.
- 세로지학적 파이펫 또는 진공 흡인기로 PBS를 제거하고 총 3개의 세차재를 반복합니다. 3.3.4에서 3.3.5로 두 번 더 반복합니다.
- 3.2절에 제조된 대식세포세포를 포함하는 4개의 우물에 재부유된 C. neoformans 세포(Step 3.1.3)의 1mL를 추가한다.
- 감염되지 않은 대식세포
- 마찬가지로, 6 웰 플레이트의 4 개의 우물을 사용하여 대식세포 전용 샘플 역할을합니다. 이 우물에 항생제 없는 배지(단계 2.1.2)의 1mL을 추가합니다.
- 3.3.2 ~ 3.3.6 단계를 반복합니다.
- 감염 검증
참고: 세포 독성 분석기를 사용하여 감염 능력을 측정할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 LDH (젖산 탈수소 효소) 방출을 측정하는 세포 독성 제품의 적용을 강조합니다. 다른 세포 독성 제품도 사용할 수 있습니다.- 대식세포 세포의 C. 네오포만 감염 제제
- 1, 2 및 3단계(최대 3.5)를 반복합니다. LDH 분석은 선호하는 경우 삼중에서 수행 될 수있다.
- 다음 단계 3.3.6, 6 웰 플레이트에 각각 의 항생제 없는 배지(2.1.2)의 1mL을 추가한다.
- 3 개의 우물과 3n 우물이 채워졌을 때까지 2.4.3 및 2.4.4 단계를 반복하십시오 (여기서 n은 측정 된 시간 포인트의 수입니다).
- 2.2.8 단계에 나열된 조건하에서 세포를 배양합니다.
- 선택한 시점(예: 1, 3, 6, 12 및 24시간)에서 제조업체의 지침에 따라 LDH 릴리스 측정을 위한 상퍼를 수집합니다.
- 동시에, 감염되지 않은 대식세포세포는 최대 세포 독성을 위해 결정된 값으로 용인된다.
- 다음과 같이 세포 독성을 계산하십시오.
- 대식세포 세포의 C. 네오포만 감염 제제
4. 샘플 컬렉션
- 공동 배양 및 감염되지 않은 대식세포 수집
- 감기 PBS 1mL(3.3.6 및 3.4.2)를 세포에 넣고 실온에서 1분 동안 앉을 수 있도록 합니다.
- 플레이트의 부드러운 도청 또는 부드러운 파이펫 차가운 PBS를 세포에 대 한 눌러 플레이트에서 세포를 방출 합니다.
참고: 세포 스크레이퍼는 세포의 리시스를 유발할 수 있으므로 피해야 합니다. - 파이펫은 세포를 15mL 튜브로 재중단했습니다.
- 원심분리기 세포는 400 x g에서 실온에서 5분 동안, 상류체를 제거합니다.
- 처리 세포(5단계에서 자세히 설명됨)는 액체 질소에서 즉시 또는 플래시가 동결되어 나중에 처리를 위해 -80°C에 저장됩니다.
5. 셀룰러 프로테오메
참고: 충분한 용액은 분석된 세포 유형에 최적화되어야 합니다(즉, 사이클 및 진폭의 양은 세포 펠릿 크기 및 프로브 초음파 검사기 모델의 전력 비율에 따라 달라집니다).
- 감염된 대식세포 리시스
- 100m Tris-HCl(pH 8.5)의 300 μL에서 펠레드 세포(Step 4.1.5)를 재연하여 새로 용존된 프로테아제 억제제 칵테일 정제로 구성된다.
참고: 프로테아제 억제제 칵테일 정제 1개를 실험 시작 전 10mMM 의 얼음 냉간 100m Tris-HCl(pH 8.5)에 첨가한다. - 프로브는 세포를 lyse하기 위해 30 s의 15 사이클과 30 s off동안 얼음 욕조에서 세포를 초음파 처리합니다.
- 원심분리기 세포는 400 x g에서30 초 간 간략하게, 펠릿을 형성하지 않도록주의하고, 튜브의 측면에 액체를 제거하고 2mL Lo-bind 마이크로 센심 분리기 튜브로 샘플을 전송합니다.
- 20%의 SDS의 1:10 부피를 최종 농도2%에 추가합니다.
- 1m 디티오트리톨(DTT)의 1:100 부피를 10mMM의 최종 농도에 추가하고 파이프팅을 통해 샘플을 철저히 혼합한 다음, 800rpm 교반에서 10분 동안 95°C의 열 가열 블록에 인큐베이션을 넣습니다. 다음으로, 실온으로 냉각 (냉각은 얼음에 수행 될 수있다).
- 0.55M 의 1:10 부피를 추가하여 55mMM의 최종 농도를 얻고 피펫팅으로 샘플을 철저히 혼합합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 100% 아세톤을 추가하여 최종 농도80%의 아세톤을 얻고 단백질을 침전시키기 위해 -20°C에서 밤새 샘플을 저장합니다.
- 100m Tris-HCl(pH 8.5)의 300 μL에서 펠레드 세포(Step 4.1.5)를 재연하여 새로 용존된 프로테아제 억제제 칵테일 정제로 구성된다.
- 단백질 소화
- 다음 날, 10,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리로 침전펠릿을 수집한다. 80% 아세톤의 500 μL로 수퍼네티드를 버리고 펠릿을 씻으십시오. 총 2개의 세시즈를 반복합니다. 차체 다음 실온에서 공기 건조 펠릿.
- 8M 우레아/40mM HEPES의 100μL에서 단백질 펠릿을 재활성화하여 30초 15사이클, 30초 끄기 동안 얼음 수조에서 완전한 용용성, 소용돌이 또는 초음파 작용을 보장합니다.
참고: 우레아/HEPES의 부피의 조정은 침전된 세포 펠릿의 크기에 따라 결정되며, 변경이 발생하면 모든 다운스트림 볼륨을 적절히 조정해야 합니다. - 제조업체의 지침에 따라 단백질 분석법(예를 들어 BCA 단백질 분석)을 사용하여 단백질 농도를 정량화하고 8M 우레아/40mM HEPES로 빈 정상화를 통해 배경 측정을 조정합니다.
- 50mM 암모늄 중탄산염의 300 μL을 추가하여 최종 농도2M 우레아를 얻습니다.
참고: 다운스트림 측정을 위한 단백질 농도를 정상화할 수 있는 기회는, 단백질의 100 μg를 소화하고 액체 질소에 있는 플래시 동결에 의해 나머지 소화되지 않은 견본을 저장한 다음 -20°C에 저장한 다음, 또는 -80°C에서 장기적으로 저장하도록 제안하였다. - 2:50 (v/w) 효소-단백질 비율의 트립신/Lys-C 프로테아제 혼합물을 얼음에 넣고 튜브를 부드럽게 탭하여 혼합하고 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 인큐베이션에 이어 실온에서 5분 동안 10,000xg의 10,000xg의 1:10 부피 정지 용액(아세토닐릴 20%, 트리플루오로아세트산) 및 원심분리기 샘플을 추가하여 소화를 중지합니다.
- 상류체(소화된 펩티드로 구성)를수집하고 펠릿 이물질 이나 침전물을 폐기하십시오.
- 펩타이드 탈염
- C18 스톱 앤 고 추출(STAGE) 팁(200 μL 파이펫 팁의 3층 C18 수지)을 활성화하여 100% 아세토닐릴과 원심분리기 100μL을 1,000xg에 2분 동안 첨가한다.
- 완충 B의 50 μL(80% (v/v) 아세토나이트, 0.5% (v/v) 아세트산) 및 원심분리기를 1,000 x g에서 2분 동안 첨가하여 C18 STAGE 팁을 상화한다.
- 완충A 200 μL(2% (v/v) 아세토나이트, 0.1% (v/v) 트리플루오로아세틱산, 0.5% (v/v) 아세트산, 원심분리산 1,000xg3-5분1,000xg의 원심분리제를 첨가하여 C18 STAGE 팁을 상형화한다.
- 소화된 시료의 ~50 μg를 C18 STAGE 팁과 원심분리기에 3-5분 동안 1,000 x g로 추가하거나 샘플이 스핀 컬럼을 통과할 때까지 추가하십시오. 플래시는 나머지 소화된 샘플을 액체 질소에 동결하고 필요할 때까지 -20°C에 보관합니다.
- 완충 A의 200 μL과 원심분리기의 200 μL로 C18 STAGE 팁을 1,000 x g에서 3-5분 동안 세척합니다.
- C18 STAGE 팁에 50 μL 버퍼 B를 추가하고 원심분리기를 500 x g에서 2분 동안 추가합니다. 0.2 mL PCR 튜브에서 용출 된 펩티드를 수집합니다.
- 최대 속도로 30-40 분 동안 진공 원심 분리기에서 용출 된 펩티드를 건조시킵니다. 완전히 건조된 시료는 처리될 때까지 실온 또는 -20°C에서 보관될 수 있다.
참고: 건조 및 탈염 펩타이드는 처리를 위한 대량 분광시설에게 적절한 시료 제출물이며 주변 온도에서 출하될 수 있다.
6. 질량 분석
- 펩타이드를 10μL 버퍼 A로 재구성하고 MS 컬럼에 ~1.5 내지 3 μg 펩티드를 주입하는 데 필요한 농도를 측정한다. 샘플의 양은 계측에 따라 달라집니다.
- 아세토나이트의 미리 결정된 그라데이션사용(약 5-60%) 원하는 시간(예를 들어, 2h)에 걸쳐 0.5% 아세트산으로 펩티드를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분리하고, 이어서 질량 분광계로 전기스프레이 이온화가 이어진다.
- 데이터 종속 획득모드(m/z 300 ~ 1650)에서 고해상도 질량 분광계를 사용하여 MS 스캔을 획득합니다.
참고: 그라데이션 백분율과 길이는 실험과 사용자에 의해 결정됩니다. 정확한 질량 분광계 설정은 계측, 실험 및 사용자 기본 설정에 따라 달라집니다.
7. 데이터 분석
참고: MS 데이터는 수많은 생물정보학 파이프라인으로 처리될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 공개적으로 사용 가능한 MaxQuant 및 Perseus 플랫폼을 사용하여 처리를 설명하지만 개별 사용자가 분석, 기본 설정 및 사용에 적합한 생물 정보 도구를 평가할 것을 권장합니다.
- MaxQuant 소프트웨어를 사용하여 처리되지 않은 데이터 파일(MS 계측기에서 직접) 로드합니다. 수정된 MaxQuant 검색 매개 변수하에서 단백질을 식별합니다. 1의 거짓 발견율에 대한 표적 미끼 접근법을 사용하여 단백질 식별에 필요한 최소 2개의 고유한 펩타이드, 실행 간의 매칭과 라벨 없는 정량화를 구현하고, UniProt 데이터베이스(즉, 크립토코커스 네오포만 H99, Mus musmusculus)에서얻은 유기체 FASTA 파일을 통합하여 현재의 펩티드를 식별하고 정량화합니다. 자세한 자습서에 대한 공개 MaxQuant 온라인 도구를 참조하십시오 (재료의 표참조).
- 최대콴트 출력 파일('단백질그룹.txt'을 Perseus에 업로드합니다.
- 잠재적 인 거짓 긍정 및 오염 물질을 포함하는 필터 행뿐만 아니라 '범주형 열을 기반으로 필터 행'사이트 펩티드에 의해 수정됩니다.
- 로그2 스케일에서 데이터 값을 변환합니다.
- 행에 범주별 별표 어음을 제공하여 데이터 집합 그룹을 만듭니다.
- 유효한 값으로 데이터 집합을 필터링하여 단백질 검출을 위한 컷오프를 정의합니다.
참고: 엄격하고 견고한 분석을 위해 >50% 식별 비율이 제안됩니다. 예를 들어 4개의 복제본이 처리된 경우 유효한 값 3개 중 최소 수가 선택됩니다. - 원하는 경우 누락된 값을 일반 분포에서 대체하여 데이터를 결정합니다.
참고: 평판이 좋은 값은 일반 분포를 기반으로 최적화되며 일반적인 풍부 측정을 시뮬레이션하기 위해 'NaN' 자리 표시자를 대체할 임의LFQ 강도를 제공합니다. 이 어퍼레이션은 정량화 가능한 데이터가 필요한 다운스트림 통계 분석을 위한 플랫폼을 제공합니다. - 단백질 행에 주석을 추가합니다(예: 단백질 이름, 유전자 종양학 용어).
참고: 생성된 이 Perseus 워크플로우는 이제 추가 적인 생물 정보 처리, 통계 분석 및 데이터 시각화를 위한 강력한 프레임워크이며 자세한 자습서를 보려면 공용 Perseus 온라인 도구를 참조하십시오(자료 표 참조).
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜은 단일 실험에서 곰팡이 병원균, C. neoformans및 숙주, 대식세포 세포 모두에서 파생된 단백질의 식별 및 정량화를 가능하게 합니다. 공동 배양에 이어, 세포는 수집 및 처리되며 각 종에 특정한 펩타이드 프로파일을 기반으로 생체정보학적으로 분리된다. 이것은 감염 도중 호스트 병원체 관계의 상호 작용을 정의하기 위한 강력한 접근입니다. 실험에서 확인된 단백질의 수는 시작 재료, 샘플 준비, 그라데이션 길이, MS 계측 및 생물 정보 학적 워크플로우에 따라 달라집니다. 본 명세서에 기재된 프로토콜을 사용하여, 우리는 전형적으로, 1,500C neoformans 단백질 및 6,500개의 숙주 단백질을 가진 실험에서 대략 8,000개의 단백질을 확인합니다. 데이터 집합의 처리에 따라, 우리는 우리의 분석을 구동 하는 중요 한 요인을 관찰 하는 주 성분 분석 (PCA) 플롯을 생성(그림 2A). 여기서, 우리는 실험 설계(성분 1, 79.8%)에서 예상되는 바와 같이, 비감염된 샘플에 비해 감염되는 데이터 간의 분리의 가장 큰 성분을 관찰하고, 샘플의 두 번째 구별특징은 생물학적 가변성(성분 2, 5.7%)이다. 다음으로, Euclidean 거리에 의한 계층 적 클러스터링과 결합된 Pearson 상관관계는 샘플을 그룹화하고복제(그림 2B)들간의 가변성을 정량화할 수 있게 한다. 우리의 분석에서, 우리는 감염된 대 비감염된 견본의 별개의 군집을 관찰하고 복제 중 좋은 재현성을 나타내는 95-96%에서 구역 수색하는 재현성을 복제합니다. 마지막으로, 우리는 Benjamini-Hochberg 거짓 발견 율 (FDR)(p-값 ≤ 0.05를 사용하여다중 가설 시험을 위해 수정된 학생의 t-테스트를수행합니다. FDR = 0.01; s0 = 1) 감염되지 않은 대조군(도2C)에비해 감염 시 풍부하게 큰 차이를 가진 단백질을 식별한다. 여기서, 우리는 감염시 유의한 증가를 보여주는 86와 117 호스트 단백질을 포함하여 풍부에 있는 중요한 변경을 가진 760단백질을 확인합니다. 특히, 우리는 또한 감염 도중 예상한 대로 곰팡이 단백질의 풍부에 있는 중요한 증가를 관찰합니다. 이러한 데이터를 통해 네트워크 매핑, 실리코 특성화 및 후속 실험을 포함한 후속 분석이 수행되어 데이터를 검증하고 독성에 대한 호스트 응답을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 탐색합니다.
그림 1: C. neoformans에감염된 대식세포 분석을 위한 질량 분광계 기반 프로테오믹스 워크플로우. 워크플로는 C. neoformans 또는 감염되지 않은 컨트롤에 감염된 대식세포 컬렉션으로 시작됩니다. 단백질은 기계적 및 화학적 중단에 의해 추출되고, 그 다음으로 감소와 용해, 아세톤 침전 및 효소 소화가 뒤따릅니다. 펩타이드는 고성능 액체 크로마토그래피로 구분되고, 전기분무이성 이온화를 실시하고, 고해상도 질량 분광계에서 측정되는 C18 STAGE 팁에서 정제됩니다. 데이터는 공개적으로 이용 가능한 생물정보학 플랫폼, MaxQuant(안드로메다) 및 페르세우스14,15,16에서처리, 분석 및 시각화된다. 생물학적 네 배에서 수행 된 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대식세포 세포의 C. 네오포만 감염에 대한 대표적인 데이터. (A)주성분 분석은 감염대 비감염대세포(성분 1, 79.8%) 및 생물학적 복제(성분 2, 5.7%)의 군집을 구분하는 것을 나타낸다. (B)Euclidean 거리에 의해 계층적 클러스터링에 의해 플롯된 Pearson 상관 관계의 열지도는 샘플의 클러스터링(감염 대 비감염)을 표시하고 재현성(>95%)을 복제합니다. (C)확인된 단백질의 화산 플롯. 블루 = 풍부에 상당한 변화를 가진 곰팡이 단백질; 블랙 = 풍부한 에 상당한 변화와 대식 세포 단백질. 학생의 t-테스트(p-값 ≤ 0.05), FDR = 0.01; s0 = 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요한 단계는 세포에 최소한의 중단을 가진 단백질 처리를 위한 대식세포 의 준비 그리고 공동 배양 견본의 집합을 포함합니다. 수집하기 전에 세포의 불필요한 용해를 방지하기 위해 씻고, 접종하고, 부착 된 대식세포 세포를 부드럽고 신중하게 제거하는 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 실험에 대한 올바른 MOI를 확립하는 것은 지나치게 높은 MOI로 접종하면 급속한 대식세포 사망과 MS에 대한 샘플 수집 및 처리의 어려움을 야기할 수 있으므로, 반대로, 낮은 MOI 숫자는 더 적은 phagocytosed 곰팡이 세포와 생물학적 시스템에서 곰팡이 단백질의 제한된 검출으로 이어질 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 다양한 MOI를 가진 시험 실험을 수행하는 것이 좋습니다, 세포 사멸 분석 (예를 들어, LDH 정량화)에 의해 지원 호스트 응답을 시작하지만 수집하기 전에 숙주 세포를 죽이지 않는 곰팡이 세포의 수를 정의합니다. 실험을 위해, 우리는 고도로 풍부한 숙주 단백질 중 곰팡이 단백질을 적절하게 검출하기 위해 높은 MOI (100:1)를 요구하는 감염 관련 곰팡이 단백질을 식별하는 것을 목표로합니다. 우리는 정기적으로 전체 실험을 수행하기 전에 호스트 세포 죽음에 대한 MOI 영향을 평가하기 위해 대식 세포 독성 검사를 수행합니다. 대식세포가 있는 C. neoformans 세포의 잠복시의 타이밍은 또한 중요합니다 곰팡이 세포는 큰 다당류 캡슐을 소유할 수 있기 때문에, 대식세포는 침몰을 위한 더 많은 시간이 필요합니다. 우리는 설명 된 실험에 대한 3 h의 공동 배양 배양 시간을 사용하기로 선택, 우리는이 시점에서 곰팡이 proteome의 좋은 범위를 발견하고 호스트 응답의 '스냅 샷'을 제공하기 위해; 그러나, 연구원은 이전 과 나중에 시간 포인트를 탐구하고 타이밍이 곰팡이와 호스트 단백질 생산에 미치는 영향을 관찰할 수 있습니다. 대안적으로, 편협을 위한 대식파지를 프라이밍하여 식세포 과정을 지원하기 위해수행되었다(17,18).
샘플 수집의 경우, 샘플이 즉시 처리되지 않으면 액체 질소에서 즉시 플래시 동결이 발생하면 샘플에 존재하는 프로테아제에 의한 단백질의 원치 않는 분해를 방지하는 데 도움이됩니다. 또한, MS 기반 프로테오믹 분석의 경우, 먼지 나 케라틴(예: 피부 및 모발 세포)의 오염 가능성은 니트리글 장갑, 실험실 코트 및 실험을 시작되기 전에 70%의 에탄올로 모든 표면의 세척을 통해 제한되어야 합니다. 더욱이, 상술한 프로토콜은 설명된 공동배양 샘플 세트에 특이적이지만 필요에 따라 단백질 추출 워크플로우 최적화를 위해 수정될 수 있다19,20. 특정 세포 유형에 대한 워크플로우를 수정하고 최적화할 수 있는 기회에는 선택된 기계적 및 화학적 중단 기술, 효소 소화의 지속 시간 및 온도, 시료 분리 등이 있습니다. 예를 들어, C. neoformans 세포의 용해는 전형적으로 기계적 비드 박동에 의해 수행됩니다. 그러나, 우리는 프로브 초음파 처리 에 따라 증가 된 프로테오메 커버리지를 관찰하고, 따라서, 감염된 세포의 기계적 중단을권장19,21,22. 예를 들어, 고pH 분획 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 펩티드 샘플을 알리쿼트로 분수하면 시료 복잡성을 줄이고 질량 분광계9에대한 커버리지 깊이를 향상시킬 수 있다. 또한 약 8,000개의 숙주 및 곰팡이 단백질을 식별하기 위한 보장 범위의 깊이를 달성하기 위해서는 고해상도 질량 분석 시스템(예: QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro)이 필요합니다.
감염 시 단백질 수치의 변화를 정량화하기 위한 LFQ의 사용은 MS 기반프로테오믹스(12)에대한 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 접근법이다. 추가 시료 처리 단계 없이도 상대적인 풍부하게 단백질을 정량화할 수 있습니다. 또한, 실험완료 후, 범용 응용 분야및 유연한 스터디 설계에 대한 자체 대출을 통해 분석이 수행됩니다. 그러나, LFQ의 제한은 샘플이 순차적으로 실행되어야 하고 결합될 수 없기 때문에 증가된 계측 시간을 포함하며, 샘플 간의 비교는 어려울 수 있으며 누락된 값을 대체할 대금의 필요성은23일수 있다. 단백질 풍부를 정량화하기 위한 대체 접근법으로는 대사(예를 들어, 세포 배양에서 아미노산의 안정적인 동위원소 라벨링) 및 화학(예를 들어, 탠덤 질량 태그) 라벨링 기법을 포함하며, 이는 시료를 결합하여 계측기 시간을 줄이고, 시료 중 신뢰할 수 있는 비교성을 제공하며, 일반적으로 누락된 값24,25로이어질 수 있다. 그러나 이러한 접근 방식에는 추가 적인 샘플 처리 및 처리 단계, 습식 실험실 실험 복잡성 및 시간이 증가하고 고정 된 실험 설계가 필요합니다. 제안된 실험에 최적 정량화 방법을 선택하려면 샘플의 설계 및 비교가능성, 습식 실험실 복잡성 및 데이터 분석, 계측 시간 가용성 및 비용을 고려해야 합니다.
제시된 프로토콜의 참신은 단일 실험에서 숙주 및 병원체 관점 모두에서 프로테아메의 변화를 정의하는 기능입니다. 두 프로테옴의 적용 범위의 깊이는 병원체가 감염을 시작하는 방법과 호스트가 방어에서 어떻게 반응하는지에 대한 새로운 통찰력을 가능하게 합니다. 특히, 접근은 전체 세포의 감염에 집중합니다; 그러나, 감염에 대한 하위 프로템 또는 구획화된 반응을 정의할 기회는 공간 국소화 기술(예를 들어, 원심분리, 농축, 라벨링)과 결합하여 존재한다( 예를 들어, 원심분리, 농축, 라벨링)26,27. 여기서, 우리는 대식세포와 곰팡이 병원체, C. neoformans사이의 상호 작용을 자세히 설명합니다. 그러나, 접근은 보편적이고, 생물학 시스템의 다양한 배열 사이 상호 작용에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 최근에는 안구 각막염28,29,30의뮤린 모델에서 파생된 호중구의 일반 및 현장 별 반응을 밝히기 위해 유사한 워크플로우를 사용했다. 더욱이, 본 의정서로부터 생성된 감염성 데이터 세트는 숙주 세포의 존재에서 변경된 풍부하게 단백질을 검출하기 위하여 병원체의 체외 프로테아메 및 분비 프로파일링과 통합될 수 있다. 감염 관련 단백질이라고 하는 이러한 단백질은 일시적 조절, 국소화 및 호스트와의 직접적인 단백질 단백질 상호 작용을 포함하여 추가 특성화를 위한 알려진 및 새로운 독성 인자의 과다를 제공합니다. 전반적으로 설명된 MS 기반 프로테오믹스 워크플로우는 일반적으로 사용할 수 없는 보편성과 이해력을 가진 단일 실험에서 호스트와 병원균 간의 복잡한 관계를 조사할 새로운 기회를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 생물 정보학 솔루션 Inc.의 조나단 크리거 박사에게 대표적인 실험을 위한 질량 분광계를 운영한 것에 대해 감사하고, 실험적인 설정 및 원고 피드백에 대한 지원을 Geddes-McAlister 그룹의 구성원에게 감사드립니다. 저자는 밴팅 연구 재단에서 자금 지원을 인정, 부분적으로, - Jarislowsky 펠로우십 디스커버리 상, 뉴 프론티어 연구 기금 - 탐사 (NFRFE-2019-00425), J.G.M에 대한 캐나다 혁신 재단 (JELF 38798), 뿐만 아니라 NSERC 캐나다 대학원 장학금 – 석사 및 온타리오 대학원.B 장학금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
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