Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.
Abstract
As realizações tecnológicas da proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massa (MS) abrem muitas vias desconhecidas para analisar o proteome global de um organismo em condições variadas. Esta poderosa estratégia aplicada às interações de patógenos microbianos com o hospedeiro desejado caracteriza de forma abrangente ambas as perspectivas para a infecção. Aqui, o fluxo de trabalho descreve a quantificação sem rótulos (LFQ) do infectome de Cryptococcus neoformans, um patógeno intracelular facultativo fúngico que é o agente causador da doença mortal criptococcose, na presença de células macrófagos imortalizadas. O protocolo detalha as técnicas adequadas de preparação de proteínas para células patógenas e mamíferos dentro de um único experimento, resultando em submissão adequada de peptídeos para análise de cromatografia líquida (LC)-MS/MS. A natureza genérica de alto rendimento do LFQ permite uma ampla gama dinâmica de identificação e quantificação de proteínas, bem como transferência para qualquer configuração de infecção por hospedeiro-patógeno, mantendo extrema sensibilidade. O método é otimizado para catalogar perfis extensos e imparcial de abundância de proteínas de um patógeno em condições de imitação de infecções. Especificamente, o método aqui demonstrado fornece informações essenciais sobre a patogênese C. neoformans, como a produção de proteínas necessárias para a virulência e identifica proteínas críticas de hospedeiro que respondem à invasão microbiana.
Introduction
A prevalência de infecções fúngicas invasivas está aumentando muito e está correlacionada com taxas inaceitáveis de mortalidade elevadas, mais comumente relatadas em indivíduos com predisposições imunodeficientes1. Cryptococcus neoformans é um notória patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivência intracelular dentro de células macrófagos hospedeiras. Intervenção antifúngica inadequada resulta em disseminação fúngica e manifestações de risco de vida de meningite criptocócica e meningoencefalite2,3. O aumento global do status imunocomprometido exigiu um aumento paralelo no uso de agentes antifúngicos, nos quais muitas espécies fúngicas, incluindo C. neoformans, têm evoluído cada vez mais resistência para4,5,6. Portanto, é imprescindível implementar tecnologias robustas e eficientes para responder a questões biológicas vitais sobre resposta à defesa do hospedeiro e patogênese microbiana.
A nova era do avanço tecnológico na espectrometria de massa (MS), incluindo a geração de poderosos gasodutos computacionais e bioinforáticos, fornece a base para uma visão integrativa para análise em larga escala da pesquisa hospedeira-patógeno7,8. A análise proteômica convencional orientada pela patogênese geralmente perfila a visão da infecção da perspectiva hospedeira ou patógena, incluindo metodologias abrangentes como perfil de correlação de proteínas, cromatografia de afinidade combinada com proteômica e interactomics9. As investigações sobre a virulência de patógenos perigosos em um sistema hospedeiro são de imensa importância clínica; no entanto, a aplicação de uma análise de dupla perspectiva em um único experimento foi anteriormente considerada inatingível. Por exemplo, a perspectiva do patógeno em relação à infecção é frequentemente sobrecarregada por proteínas hospedeiras altamente abundantes, resultando em sensibilidade reduzida para a detecção de proteínas fúngicas de baixa abundantes7. Além disso, a alta complexidade amostral convida muitos alvos a investigar em um único sistema experimental e se mostra desafiador para elucidar mecanismos de ação para uma proteína patógena específica.
A proteômica de baixo para cima é uma técnica popular de MS que permite a preparação de amostras gerenciáveis, na qual os peptídeos são gerados pela digestão enzimática específica da sequência seguida pela separação, identificação e quantificação da cromatografia líquida pela MS10,11. Aqui, apresentamos um método demonstrando uma estratégia de aquisição dependente de dados com o objetivo de alcançar uma cobertura imparcial de um proteome baseado em infecção ou "infectome". Especificamente, a quantificação sem rótulos (LFQ) libera a dependência de rótulos químicos ou metabólicos para identificação robusta e precisa de alterações no nível de proteínas em múltiplos proteomes, reduzindo as etapas de manuseio e processamento de amostras12,13. Esta aplicação universal interroga proteínas produzidas em um dado momento dentro de uma célula independente de qualquer produção de proteína esperada; assim, novos insights podem ser descobertos que são críticos para a infecção.
O fluxo de trabalho descrito aqui é otimizado para explorar mudanças no nível de proteína de C. neoformans durante condições de imitação de infecções com células imunes hospedeiras(Figura 1). Em vez de depender do isolamento e separação dos tipos celulares, essa abordagem extrai o hospedeiro e o proteome patógeno juntos, e utiliza a separação bioinformática usando dois bancos de dados específicos do organismo para distinguir a produção de proteínas específicas das espécies. Este método oferece vantagens para um número ilimitado de amostras a serem processadas sem as etapas de preparação extra dispendias necessárias em estudos de rotulagem ou fracionamento baseados em isótopos. Além disso, este fluxo de trabalho suporta protocolos otimizados de extração de proteínas transferíveis para uma ampla gama de patógenos fúngicos e bacterianos capazes de atingir e infectar células imunes hospedeiras. No geral, este protocolo descreve as etapas para concluir uma extração de proteína imparcial e processamento de amostras para MS de alta resolução, seguida de dados e análise estatística, capaz de fornecer uma riqueza de conhecimento de proteínas fúngicas significativas para infecção combinada com o perfil abrangente da resposta à defesa do hospedeiro.
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Protocol
Uma linha imortalizada de macrófagos derivados de camundongos BALB/c foram usados para o seguinte protocolo aprovado pelo Protocolo de Utilização animal da Universidade de Guelph 4193. Notavelmente, outras cepas de camundongos ou outras fontes de células imortalizadas podem ser aplicadas ao protocolo delineado com testes suficientes para otimizar os parâmetros detalhados. O protocolo a seguir navegará pelas etapas que começam com um frasco congelado de células macrófagos. As células são armazenadas em 10% FBS (soro bovino fetal), 1% L-glutamina e 5% pen/estreptomicina (penicilina-estreptomicina) à mistura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) e 20% DMSO (sulfóxido de dimetil).
1. Cultivo de C. neoformans
- Usando um estoque de glicerol, raia wildtype C. neoformans strain (H99) em levedura-extrato peptone dextrose (YPD) placa de ágar para isolar colônias únicas.
- Incubar durante a noite por 16 h a 37 °C em uma incubadora estática.
- Selecione uma única colônia de neoformans selvagens e variedade e cultura em 5 mL de caldo YPD em um tubo de ensaio de 10 mL com tampa solta. Atuar em quadruplicação.
- Incubar durante a noite por 16 h a 37 °C em uma incubadora de agitação a 200 rpm.
- No dia seguinte, a subcultura de cada cultura durante a noite em uma diluição de 1:100 em caldo YPD de 3 mL.
- Medir a densidade óptica (OD600nm) valores da cultura fúngica para determinar a fase de registro médio. Dependendo do espectrofotômetro, a cepa selvagem C. neoformans atinge a fase de registro médio comumente após a incubação de 6 a 8 h em YPD com valores gerais deOD 600nm variando de 1,0 a 1,5.
- Uma vez que as células atinjam a fase de tronco médio, pegue uma alíquota de 10 μL de suspensão de células fúngicas em um tubo de microcentrifuge limpo de 1,5 mL e dilua 1:100 em salina tamponada de fosfato estéril de 1x (PBS). Conte o número de células usando um hemótmetro.
2. Cultivo de células macrófagos
NOTA: Certifique-se de que o ambiente de trabalho seja esterilizado antes do trabalho de cultura celular.
- Preparação do meio de cultura celular
- Meio assoleiumado por antibióticos: Adicione 10% FBS (soro bovino fetal), 1% L-glutamina e 5% Pen/Strep (Penicilina-Estreptomicina) à mistura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filtrar o meio através de um sistema de filtro completo de 0,2 μm e armazenar a 4 °C.
- Meio sem antibióticos: Siga o protocolo idêntico, mas omita a mistura Pen/Strep.
- Células macrófagos semeadas
NOTA: O meio assoleado com antibióticos (2.1.1.) deve ser aquecido a 37°C antes do trabalho de cultura celular.- Descongelar o frasco de células macrófagos rapidamente em banho de contas de 37 °C.
- Lave as células da solução de congelamento reutilizando as células em meio suplementado por antibióticos de 1 mL.
NOTA: É necessária precaução extra para garantir que as células não se desemontem devido à tubulação severa. - Transfira células resuspended para um tubo estéril de 15 mL.
- Células de pelotas por centrifugação a 400 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Remova cuidadosamente o supernante com uma pipeta sorológica ou aspirador de vácuo.
- Levemente resuspend pelotas em 10 mL de antibiótico suplementado médio.
- Células suavemente pipetas resuspended em um prato tratado de cultura celular de 60 x 15 mm.
- Incubar prato a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite.
- Passagem inicial de células macrófagos
NOTA: Os estoques de células congeladas normalmente contêm entre 5 a 10 milhões de células por frasco (aproximadamente 1 mL). No dia seguinte, as células macrófagos que sobreviveram ao protocolo de semeadura irão aderir ao fundo do prato de cultura celular e estarão prontas para a passagem.- Meio aquecido com antibióticos (passo 2.1.1) a 37 °C antes do trabalho de cultura celular. Certifique-se de que o ambiente de trabalho seja esterilizado antes do trabalho de cultura celular. Visualize as células usando um microscópio leve para garantir que as células sejam aderidas e saudáveis.
- Remova o meio de cultura celular do prato com uma pipeta sorológica ou um aspirador de vácuo.
- Adicione suavemente 5-7 mL de PBS de temperatura ambiente estéril (salina tamponada com fosfato) ao prato de 60 x 15 mm.
- Incline suavemente o prato para lavar as células aderidas.
- Remova o PBS usando uma pipeta sorológica ou aspirador de vácuo.
- Adicione 1 mL de PBS frio (armazenado a 4 °C) às células, incline o prato para distribuir PBS sobre todas as células e deixe descansar em temperatura ambiente por 1 min.
- Solte as células por toques suaves do prato, pipetting PBS frio contra as células, ou usando um raspador de células.
- Adicione 9 mL de meio suplementado a antibióticos ao prato.
- Em um novo prato de 60 x 15 mm, adicione 9 mL de meio fresco suplementado por antibióticos e 1 mL de células resuspended do prato original.
- Uma vez preenchido o número de placas de passagem desejadas, as células resuspended do prato original podem ser descartadas.
- Incubar o novo prato nas configurações mencionadas acima (passo 2.2.8).
- Realize a passagem subsequente quando as células atingirem 70-80% de confluência (aproximadamente a cada 2 dias, dependendo da linha celular e média utilizada).
NOTA: As células macrófagos devem ser aprovadas no mínimo cinco vezes antes dos experimentos de infecção. Dependendo da linha celular, os experimentos de infecção devem ser realizados por 25 a 30 passagens. Após 25 a 30 passagens, as células devem ser congeladas ou descartadas. A seção 2.4 ou 2.5 pode ser escolhida com base nos planos experimentais. A seção 2.4 será usada para as seguintes seções.
- Semeadura de células macrófagos antes da infecção
- Execute as etapas do protocolo de passagem 2.3.1 a 2.3.7.
- O uso de um hemótmetro ou contador automatizado de células determina a densidade celular (células/mL).
- Transfira 0,3 x 106 células macrófagos em um único poço de uma placa de cultura celular de 6 poços.
- Ajuste o volume total de poço para 1 mL usando meio suplementado por antibióticos (etapa 2.1.1).
- Repetimos as etapas 2.4.3 e 2.4.4 até que 8 poços tenham sido preenchidos (4 poços preenchidos em duas placas separadas).
- Opcionalmente, encha os dois poços restantes com 1 mL de PBS de temperatura ambiente para manter os níveis de umidade durante a incubação.
- Permitir que as células cresçam em condições de incubação mencionadas na etapa 2.2.8 por 2 d antes da infecção.
- Semeando células macrófagos no dia da infecção
- Execute as etapas do protocolo de passagem 2.3.1 a 2.3.7.
- O uso de um hemótmetro ou contador automatizado de células determina a densidade celular (células/mL).
- Sementes 1,2 x 106 células macrófagos em um único poço de uma placa de cultura celular de 6 poços.
- Ajuste o volume total de poço para 1 mL usando meio suplementado por antibióticos (2.1.1).
- Repita 2.4.3 e 2.4.4 até que 8 poços tenham sido preenchidos (4 poços preenchidos em duas placas separadas).
- Opcionalmente, encha os dois poços restantes com 1 mL de PBS de temperatura ambiente para manter os níveis de umidade durante a incubação.
- Incubar células em condições mencionadas na etapa 2.2.8 por 3 h para permitir que as células aderam aos poços.
3. Infecção de células macrófagos com C. neoformans
NOTA: Ao atingir 70-80% de confluência, haverá aproximadamente 1,2 x 106 células macrófagos por poço. Para alcançar a multiplicidade desejada de infecção (MOI) de 100:1, são necessárias 1,2 x 108 células fúngicas para cada reação. As culturas devem ser definidas de acordo em quadruplicato biológico.
AVISO: Um MOI de 100:1 alcançou resultados desejáveis em nosso grupo de pesquisa e é feito como uma sugestão aos leitores. Um MOI mais baixo pode ser necessário para cepas c. neoformans mais infecciosas ou para linhas de células macrófagos menos resistentes. A verificação da infecção (seção 3.5) pode ser usada para determinar o MOI ideal para neoformans C. particulares – combinações de macrófagos.
- Preparação de células fúngicas
- Siga o passo 1 para o crescimento de C. neoformans para a fase de registro médio.
- Coletar e centrífugas a 1.500 x g por 10 minutos, lavar suavemente a pelota com PBS de temperatura ambiente estéril e repetir para um total de três lavagens.
- Células resuspendas em meio de cultura celular livre de antibióticos (passo 2.1.2) para alcançar uma concentração de 1,2 x 108 células/mL.
- Preparação de células macrófagos
- Visualize cada poço na placa de 6 poços para garantir que as células tenham atingido 70-80% de confluência. Alternativamente, as células podem ser medidas para alcançar aproximadamente 1,2 x 106 células macrófagos por poço.
- Siga os passos 2.3.1 a 2.3.4.
- Co-cultura de C. neoformans e células macrófagos
- Adicione 1 mL das células neoformans de C. resuspended (passo 3.1.3) a 4 poços contendo células macrófagos preparados na seção 3.2.
NOTA: O número de placas necessárias precisará ser calculado antes do início do experimento. Adicione 1 mL de meio livre de antibióticos (passo 2.1.2) a poços vazios. - Permitir que as células incubam em condições listadas (etapa 2.2.8) por 3 h.
- Remova o meio de cultura celular da placa com uma pipeta sorológica ou um aspirador de vácuo.
- Adicione suavemente 1 mL de PBS de temperatura ambiente estéril.
- Incline suavemente a placa para lavar células extracelulares não ligadas ou não-fagocólicas C. neoformans.
- Remova o PBS usando uma pipeta sorológica ou aspirador de vácuo, repita para um total de três lavagens. Repita 3.3.4 a 3.3.5 mais duas vezes.
- Adicione 1 mL das células neoformans de C. resuspended (passo 3.1.3) a 4 poços contendo células macrófagos preparados na seção 3.2.
- Macrófagos não infectados
- Da mesma forma, use 4 poços de uma placa de 6 poços para servir atuar como amostras somente de macrófago. Adicione 1 mL de meio livre de antibióticos (passo 2.1.2) a esses poços.
- Repetir passos 3.3.2 a 3.3.6.
- Verificação da infecção
NOTA: Utilizando um ensaio de citotoxicidade, a proficiência em infecções pode ser medida. O protocolo a seguir destacará a aplicação de um produto de citotoxicidade para medir a versão LDH (lactato desidrogenase). Outros produtos de citotoxicidade também podem ser usados.- Preparação da infecção por C. neoformans de células macrófagos
- Repete as etapas 1, 2 e 3 (até 3,5). O ensaio LDH pode ser realizado em triplicado, se preferir.
- Seguindo o passo 3.3.6, adicione 1 mL de meio livre de antibióticos (2.1.2) a cada poço na placa de 6 poços.
- Repetimos os passos 2.4.3 e 2.4.4 até 3 poços mais 3n poços foram preenchidos (onde n é o número de pontos de tempo medidos).
- Incubar células em condições listadas na etapa 2.2.8.
- Nos pontos de tempo selecionados (por exemplo, 1, 3, 6, 12 e 24 horas) coletam supernascentes para medição da versão LDH de acordo com as instruções do fabricante
- Ao mesmo tempo, as células macrófagos não infectadas serão lícitas para o valor determinado para a citotoxicidade máxima.
- Calcular a citotoxicidade da seguinte forma:
- Preparação da infecção por C. neoformans de células macrófagos
4. Coleta de amostras
- Coleção de macrófagos não infectados e co-cultura
- Adicione 1 mL de PBS frio às células (de 3,3,6 e 3,4,2) e deixe descansar à temperatura ambiente por 1 min.
- Solte as células da placa por toques suaves da placa ou suave pipetação de PBS frio contra as células.
NOTA: O raspador de células deve ser evitado, pois isso pode causar lise das células. - Células resuspensadas de pipeta em um tubo de 15 mL.
- Centrífugas células a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente, e remova o sobrenante.
- Células de processo (conforme detalhado na etapa 5) imediatamente ou flash congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C para processamento posterior.
5. Proteome celular
NOTA: A lise suficiente deve ser otimizada para o tipo de célula analisada (ou seja, a quantidade de ciclos e amplitudes depende do tamanho da pelota celular e da porcentagem de potência do modelo sonicator da sonda).
- Lise celular macrófago infectada
- Células de pelotização resuspend (passo 4.1.5) em 300 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) consistindo de uma tábua de coquetel inibidor de protease recém-dissolvida.
NOTA: Um comprimido de coquetel inibidor de protease é adicionado a 10 mL de gelo frio de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) antes de iniciar o experimento. - Sonda sonicate células em um banho de gelo para 15 ciclos de 30 s on e 30 s off, para lise as células.
- Centrífugas células brevemente para 30 s a 400 x g, cuidado para não formar uma pelota, apenas para remover líquido nas laterais dos tubos seguido de transferência de amostra para um tubo de microcentrifuge lo-bind de 2 mL.
- Adicionar 1:10 volume de 20% SDS a uma concentração final de 2%.
- Adicione 1:100 volume de 1 M dithiothreitol (DTT) a uma concentração final de 10 mM e misture a amostra completamente por pipetação, seguida de incubação em um bloco de aquecimento térmico a 95 °C por 10 min a 800 rpm agitação. Em seguida, frio à temperatura ambiente (o resfriamento pode ser feito no gelo).
- Adicione 1:10 volume de 0,55 M iodoacetamida (IAA) para obter uma concentração final de 55 mM e misture a amostra completamente por pipetação. Incubar à temperatura ambiente no escuro por 20 minutos.
- Adicione 100% de acetona para obter uma concentração final de 80% de acetona e armazene a amostra durante a noite a -20°C para precipitar proteínas.
- Células de pelotização resuspend (passo 4.1.5) em 300 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) consistindo de uma tábua de coquetel inibidor de protease recém-dissolvida.
- Digestão proteica
- No dia seguinte, colete a pelota precipitada por centrifugação por 10 min a 10.000 x g e 4 °C. Descarte a supernasce e lave a pelota com 500 μL de acetona de 80%. Repita para um total de duas lavagens. Pelota seca de ar à temperatura ambiente após as lavagens.
- Resolubilize a pelota proteica em 100 μL de 8 M de ureia/40 mM HEPES, para garantir a solubilização completa, vórtice ou sonicato em um banho de água gelada para 15 ciclos de 30 s on e 30 s off.
NOTA: O ajuste do volume de ureia/HEPES é determinado no tamanho da pelota celular precipitada, se ocorrerem alterações todos os volumes a jusante devem ser ajustados adequadamente. - Quantifique a concentração de proteínas usando um ensaio proteico (por exemplo, ensaio de proteína BCA) de acordo com as instruções do fabricante e ajuste para medição de fundo por normalização em branco com 8 M de ureia/40 mM HEPES.
- Adicione 300 μL de 50 mM de bicarbonato de amônio para obter uma concentração final de 2 M de ureia.
NOTA: Oportunidade de normalizar a concentração de proteínas para medições a jusante, sugerida para digerir 100 μg de proteína e armazenar a amostra não digerida restante por congelamento de flash em nitrogênio líquido e depois armazenar a -20 °C para curto prazo, ou a -80 °C para longo prazo. - Adicione 2:50 (v/w) relação enzima/proteína da mistura de protease trypsin/Lys-C no gelo e bata suavemente no tubo para misturar, incubar durante a noite à temperatura ambiente.
- Após a incubação, pare a digestão adicionando solução de parada de volume 1:10 (20% acetonitrilo, 6% ácido trifluoroacético) e amostras de centrífuga a 10.000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Recolher supernacidos (consiste em peptídeos digeridos) e descartar quaisquer detritos pelleted ou precipitado.
- Desalting de peptídeo
- Ative uma dica de extração C18 Stop And Go (STAGE) (consistindo em 3 camadas de resina C18 em uma ponta de pipeta de 200 μL) adicionando 100 μL de acetonitrila e centrífuga a 1.000 x g por 2 min.
- Equilibre a ponta C18 STAGE adicionando 50 μL de tampão B (80% (v/v) acetonitrilo, 0,5% (v/v) ácido acético) e centrífuga a 1.000 x g por 2 min.
- Equilibre a ponta C18 STAGE adicionando 200 μL de tampão A (2% (v/v) acetonitrilo, 0,1% (v/v) ácido trifluoroacético, 0,5% (v/v) ácido acético) e centrífuga a 1.000 x g por 3-5 min.
- Adicione ~50 μg de amostra digerida na ponta C18 STAGE e centrífuga a 1.000 x g por 3-5 min, ou até que a amostra passe através da coluna de spin. O flash congele a amostra digerida restante em nitrogênio líquido e armazene a -20°C, até que seja necessário.
- Lave a ponta C18 STAGE com 200 μL de Buffer A e centrífuga a 1.000 x g por 3-5 min.
- Adicione 50 μL tampão B à ponta C18 STAGE e centrífuga a 500 x g por 2 min. Colete peptídeos elucidos em tubos PCR de 0,2 mL.
- Seque os peptídeos elucidos em uma centrífuga a vácuo por 30-40 min em velocidade máxima. Amostras completamente secas podem ser armazenadas à temperatura ambiente ou a -20 °C até serem processadas.
NOTA: Os peptídeos secos e desácidos são submissões de amostras apropriadas para instalações de espectrometria de massa para processamento e podem ser enviados à temperatura ambiente.
6. Espectrometria de massa
- Reconstituir peptídeos em 10 μL Buffer A e medir a concentração necessária para injetar ~1,5 a 3 μg de peptídeos na coluna MS. A quantidade de amostra dependerá da instrumentação.
- Use um gradiente pré-determinado de acetonitrilo (aproximadamente 5-60%) em ácido acético de 0,5% sobre um tempo desejado (por exemplo, 2 h) para separar peptídeos por cromatografia líquida de alto desempenho, seguido de ionização eletrospray no espectrômetro de massa.
- Adquira varreduras de MS usando um espectrômetro de massa de alta resolução no modo de aquisição dependente de dados(m/z 300 a 1650).
NOTA: A porcentagem e o comprimento do gradiente são determinados pelo experimento e pelo usuário. As configurações precisas do espectrômetro de massa dependem da instrumentação, do experimento e da preferência do usuário.
7. Análise de dados
NOTA: Os dados de MS podem ser processados com inúmeros pipelines de bioinformática. Neste protocolo, descrevemos o processamento usando as plataformas MaxQuant e Perseus disponíveis publicamente, mas recomendamos que usuários individuais avaliem ferramentas bioinformáticas apropriadas para a análise, preferência e uso.
- Carregue arquivos de dados não processados (diretamente do instrumento MS) usando o software MaxQuant. Identificar proteínas sob os parâmetros de pesquisa MaxQuant modificados; mínimo de dois peptídeos únicos necessários para identificação de proteínas usando uma abordagem chamariz alvo para uma taxa de descoberta falsa de 1%, implementar quantificação livre de rótulos com correspondência entre corridas, incorporar os organismos ARQUIVO FASTA obtido do banco de dados UniProt (ou seja, Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) para identificar e quantificar peptídeos presentes com o motor de busca Andromeda. Consulte as ferramentas online do Público MaxQuant para tutoriais detalhados (ver Tabela de Materiais).
- Carregue o arquivo de saída MaxQuant ('proteingroups.txt') em Perseus.
- Linhas de filtro contendo potenciais falsos positivos e contaminantes, bem como apenas modificadas por peptídeos do local com as 'linhas de filtro baseadas em coluna categórica'.
- Transforme os valores dos dados na escala log2.
- Crie grupos de conjuntos de dados fornecendo anotações categóricas às linhas.
- Filtrar o conjunto de dados por valores válidos para definir um corte para detecção de proteínas.
NOTA: Para uma análise rigorosa e robusta é sugerida uma taxa de identificação de >50%. Por exemplo, se quatro réplicas fossem processadas, um número mínimo de três valores válidos seria selecionado. - Se preferir, imputar dados substituindo valores ausentes da distribuição normal.
NOTA: Os valores imputados são otimizados com base na distribuição normal e fornecem uma intensidade lfq aleatória para substituir os espaços reservados 'NaN' para simular medições típicas de abundância. Essa imputação fornece uma plataforma para análise estatística a jusante que requer dados quantificáveis. - Adicione anotações às linhas proteicas (por exemplo, nomes de proteínas, termos de Gene Ontology).
NOTA: Este fluxo de trabalho gerado pela Perseus é agora uma estrutura robusta para mais processamento bioinforático, análise estatística e visualização de dados, consulte ferramentas on-line públicas da Perseus para tutoriais detalhados (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
O protocolo descrito acima permite a identificação e quantificação de proteínas derivadas tanto do patógeno fúngico, C. neoformans, quanto do hospedeiro, células macrófagos, em um único experimento. Seguindo a cocultura, as células são coletadas e processadas juntas e bioinformáticas separadas com base em perfis de peptídeos específicos para cada espécie. Esta é uma abordagem poderosa para definir a interação da relação hospedeiro-patógeno durante a infecção. O número de proteínas identificadas a partir do experimento depende do material inicial, preparação da amostra, comprimento de gradiente, instrumentação em MS e fluxo de trabalho bioinforático. Usando o protocolo aqui descrito, normalmente identificamos aproximadamente 8.000 proteínas do experimento com 1.500 proteínas neoformans C. e 6.500 proteínas hospedeiras. Após o processamento dos conjuntos de dados, geramos um gráfico de Análise de Componentes Principais (PCA) para observar fatores críticos que conduzem nossa análise(Figura 2A). Aqui, observamos que o maior componente de separação entre os dados está infectado versus amostras não infectadas, como se anteciparia a partir do desenho experimental (componente 1, 79,8%), e uma segunda característica distintiva das amostras é a variabilidade biológica (componente 2, 5,7%). Em seguida, uma correlação de Pearson combinada com o agrupamento hierárquico por grupos de distância euclidianos as amostras e permite quantificação da variabilidade entre as réplicas(Figura 2B). Em nossa análise, observamos agrupamento distinto de amostras infectadas vs. não infectadas e replicamos reprodutibilidade variando de 95 a 96%, representando boa reprodutibilidade entre as réplicas. Por fim, realizamos um teste tde um aluno corrigido para testes de hipóteses múltiplas usando uma taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg (FDR)(p-valor ≤ 0,05; FDR = 0,01; s0 = 1) identificar proteínas com diferenças significativas na abundância durante a infecção em comparação com controles não infectados(Figura 2C). Aqui, identificamos 760 proteínas com mudanças significativas em abundância, incluindo 117 proteínas hospedeiras, com 86 mostrando uma diminuição significativa e 31 mostrando um aumento significativo sobre a infecção. Notavelmente, também observamos aumentos significativos na abundância de proteínas fúngicas, como esperado durante a infecção. Com esses dados, análises subsequentes, incluindo mapeamento de rede, na caracterização do silico e experimentos de acompanhamento são realizadas para validar os dados e explorar os mecanismos moleculares que sustentam a resposta do hospedeiro à virulência.
Figura 1: Fluxo de trabalho de proteômica à base de espectrometria de massa para análise de macrófagos infectados com C. neoformans. O fluxo de trabalho começa com a coleta de macrófagos infectados com C. neoformans ou controles não infectados. As proteínas são extraídas por perturbação mecânica e química, seguidas de redução e alquilação, precipitação de acetona e digestão enzimática. Os peptídeos são purificados em pontas C18 STAGE, separados por cromatografia líquida de alto desempenho, submetidos à ionização de eletropraia, e medidos em um espectrômetro de massa de alta resolução. Os dados são processados, analisados e visualizados nas plataformas de bioinformática disponíveis publicamente, MaxQuant (com Andrômeda) e Perseu14,15,16. Experimentos realizados em quadruplicato biológico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dados representativos para a infecção por C. neoformans de células macrófagos. (A) A análise dos componentes principais demonstra distinção entre macrófago infectado versus não infectado (componente 1, 79,8%) e agrupamento de réplicas biológicas (componente 2, 5,7%). (B) Mapa de calor da correlação de Pearson traçado por agrupamento hierárquico pela distância euclidiana para mostrar agrupamento de amostras (infectados vs. não infectados) e replicar a reprodutibilidade (>95%). (C) Enredo vulcânico de proteínas identificadas. Azul = proteínas fúngicas com mudança significativa em abundância; preto = proteínas macrófagos com mudança significativa em abundância. Teste tdo aluno(p-valor ≤ 0,05), FDR = 0,01; s0 = 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As etapas críticas do protocolo incluem a preparação de células macrófagos e a coleta de amostras de co-cultura para processamento de proteínas com interrupção mínima das células. É importante realizar etapas de lavagem, inoculação e remoção de células macrófagos aderentes suavemente e cuidadosamente para evitar a lise desnecessária das células antes da coleta. Estabelecer o MOI correto para o experimento também é fundamental, pois a inoculação com um MOI excessivamente alto pode causar morte rápida de células macrófagos e dificuldade na coleta e processamento de amostras para MS. Por outro lado, os baixos números de MOI levarão a menos células fúngicas fagocitadas e à detecção limitada de proteínas fúngicas no sistema biológico. Para superar tais limitações, recomendamos a realização de experimentos de teste com MOIs variados, suportados por ensaios de morte celular (por exemplo, quantificação LDH) para definir o número de células fúngicas que iniciam uma resposta hospedeira, mas não matam as células hospedeiras antes da coleta. Para os experimentos, pretendemos identificar proteínas fúngicas associadas à infecção, exigindo um alto MOI (100:1) para detectar adequadamente proteínas fúngicas entre proteínas hospedeiras altamente abundantes. Realizamos rotineiramente ensaios de citotoxicidade macrófago para avaliar o impacto do MOI na morte celular hospedeira antes de realizar todo o experimento. O tempo de incubação de células de C. neoformans com macrófagos também é crucial, pois as células fúngicas podem possuir grandes cápsulas de polissacarídeos e, portanto, o macrófago requer mais tempo para o engolfamento. Selecionamos usar um tempo de incubação de co-cultura de 3h para o experimento delineado, pois encontramos uma boa cobertura do proteome fúngico neste momento e para fornecer um "snap-shot" de resposta do hospedeiro; no entanto, os pesquisadores podem querer explorar pontos de tempo mais cedo e mais tarde e observar como o tempo impacta a produção de proteínas fúngicas e hospedeiras. Alternativamente, a preparação do macrófago para opsonização tem sido realizada para auxiliar o processo fagocítico17,18.
Para a coleta de amostras, se as amostras não estiverem sendo processadas imediatamente, o congelamento de nitrogênio líquido ajudará a evitar a degradação indesejada de proteínas por proteases presentes nas amostras. Além disso, para análises proteômicas baseadas em MS, o potencial de contaminação por poeira ou queratina (por exemplo, células da pele e do cabelo) deve ser limitado através do uso de luvas de nitrilho, casacos de laboratório e lavagem de todas as superfícies com 70% de etanol antes do início dos experimentos. Além disso, os protocolos descritos acima são específicos do conjunto amostral de cocultura descrito, mas podem ser modificados para otimização do fluxo de trabalho de extração de proteínas, conforme necessário19,20. As oportunidades de modificação do fluxo de trabalho e otimização para tipos celulares específicos incluem as técnicas selecionadas de disrupção mecânica e química, duração e temperatura de digestão enzimática e separação das amostras. Por exemplo, a lise das células C. neoformans é tipicamente realizada por batidas mecânicas de contas; no entanto, observamos aumento da cobertura proteome após a sônica da sonda e, portanto, recomendamos-na para interrupção mecânica das células infectadas19,21,22. Por exemplo, amostras de peptídeos fracionados em alíquotas por fracionamento de alto pH ou cromatografia de exclusão de tamanho podem reduzir a complexidade da amostra e melhorar a profundidade de cobertura no espectrômetro de massa9. Além disso, para alcançar a profundidade de cobertura para identificar cerca de 8.000 proteínas hospedeiras e fúngicas, é necessário um sistema de espectrometria de massa de alta resolução (por exemplo, QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).
O uso de LFQ para quantificar mudanças nos níveis de proteína durante a infecção é uma abordagem confiável e econômica para a proteômica baseada em MS12. Permite quantificação de proteínas por abundância relativa sem a necessidade de etapas adicionais de processamento de amostras. Além disso, a análise é realizada após a conclusão do experimento, emprestando-se a aplicações universais e um desenho de estudo flexível. No entanto, as limitações do LFQ incluem o aumento do tempo de instrumentação, pois as amostras devem ser executadas sequencialmente e não podem ser combinadas, a comparabilidade entre as amostras pode ser desafiadora, e a necessidade de imputação para substituir os valores ausentes pode ser alta23. Abordagens alternativas para quantificar a abundância de proteínas incluem técnicas de rotulagem metabólica (por exemplo, isótopos estáveis de aminoácidos na cultura celular) e técnicas químicas (por exemplo, marcas de massa tandem), que permitem combinar amostras para reduzir o tempo do instrumento, fornecem comparabilidade confiável entre as amostras e geralmente levam a valores menos ausentes24,25. No entanto, tais abordagens requerem etapas adicionais de manuseio e processamento de amostras, aumento da complexidade e do tempo de experimentos em laboratório molhado, além de exigir um design experimental fixo. Para escolher um método de quantificação ideal para experimentos propostos, os usuários devem considerar o desenho do estudo e a comparabilidade das amostras, a complexidade do laboratório molhado e a análise de dados, bem como a disponibilidade e o custo do tempo de instrumentação.
A novidade do protocolo apresentado é a capacidade de definir mudanças no proteome tanto do hospedeiro quanto do patógeno em um único experimento. A profundidade da cobertura de ambos os proteomes permite uma nova visão de como o patógeno inicia a infecção e como o hospedeiro responde em defesa. Notavelmente, a abordagem se concentra na infecção de toda a célula; no entanto, existem oportunidades para definir sub-proteomes ou respostas compartimentalizadas à infecção por meio de combinação com técnicas de localização espacial (por exemplo, centrifugação, enriquecimento, rotulagem)26,27. Aqui, detalhamos a interação entre macrófagos e o patógeno fúngico, C. neoformans; no entanto, a abordagem é universal, e pode ser aplicada a interações entre uma variedade diversificada de sistemas biológicos. Por exemplo, recentemente usamos um fluxo de trabalho semelhante para descobrir respostas gerais e específicas do local de neutrófilos derivados de um modelo murino de ceratite ocular28,29,30. Além disso, os conjuntos de dados infectome gerados a partir deste Protocolo podem ser integrados com proteome in vitro e perfil secreto de um patógeno para detectar proteínas com abundância alterada na presença de células hospedeiras. Tais proteínas, conhecidas como proteínas associadas à infecção, fornecem uma infinidade de fatores conhecidos e novos de virulência para caracterização posterior, incluindo regulação temporal, localização e interações diretas proteína-proteína com o hospedeiro. No geral, o fluxo de trabalho de proteômica baseado em MS delineado fornece uma nova oportunidade para investigar a intrincada relação entre hospedeiro e patógeno em um único experimento com universalidade e compreensão não comumente disponível.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Jonathan Krieger da Bioinformatics Solutions Inc. por operar o espectrômetro de massa para experimentos representativos, bem como membros do grupo Geddes-McAlister por sua assistência com configuração experimental e feedback de manuscritos. Os autores reconhecem o apoio ao financiamento, em parte, da Fundação de Pesquisa Banting – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), e da Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) para J.G.M., bem como bolsa de pós-graduação da NSERC Canada – Mestrado e Bolsa de Pós-Graduação de Ontário para B.B., e Bolsa de Pós-Graduação Rainha Elizabeth II em Ciência e Tecnologia para A.S..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
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