Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att profilera samspelet mellan värd och patogen under infektion genom masspektrometribaserad proteomik. Detta protokoll använder etikettfri kvantifiering för att mäta förändringar i proteinförekomsten hos både värd (t.ex. makrofager) och patogen (t.ex. Cryptococcus neoformans) i ett enda experiment.
Abstract
De tekniska resultaten av masspektrometri (MS)-baserade kvantitativa proteomik öppnar många oupptäckta vägar för att analysera en organisms globala proteom under olika förhållanden. Denna kraftfulla strategi tillämpas på interaktioner av mikrobiella patogener med den önskade värden karakteriserar omfattande båda perspektiven mot infektion. Häri beskriver arbetsflödet etikettfri kvantifiering (LFQ) av infektomet cryptococcus neoformans, en svamp facultative intracellulär patogen som är orsaksmedlet för den dödliga sjukdomen cryptococcosis, i närvaro av odödliga makrofagceller. Protokollet beskriver de korrekta proteinberedningsteknikerna för både patogena och däggdjursceller inom ett enda experiment, vilket resulterar i lämplig peptidinlämning för vätskekromatografi (LC)-MS/MS-analys. LFQ: s höga genomströmning generiska natur möjliggör ett brett dynamiskt utbud av proteinidentifiering och kvantifiering, samt överförbarhet till alla värdpatogena infektionsinställningar, vilket upprätthåller extrem känslighet. Metoden är optimerad för att katalogisera omfattande, opartiska protein överflöd profiler av en patogen inom infektion-härma villkor. Specifikt ger den metod som demonstreras här viktig information om C. neoformans patogenes, såsom proteinproduktion som är nödvändig för virulens och identifierar kritiska värdproteiner som svarar på mikrobiell invasion.
Introduction
Prevalensen av invasiva svampinfektioner ökar kraftigt och är korrelerad med oacceptabelt hög dödlighet, oftast rapporterad hos individer med immunodeficient predispositioner1. Cryptococcus neoformans är en ökänd opportunistisk svamp patogen som kan intracellulära överlevnad inom värd makrofag celler. Otillräcklig svampdödande ingripande resulterar i svamp spridning och livshotande manifestationer av cryptococcal hjärnhinneinflammation och meningoencephalitis2,3. Den globala ökningen av immunkomprometterad status har krävt en parallell ökning av användningen av svampdödande medel, där många svamparter, inklusive C. neoformaner, alltmer har utvecklat resistensmot 4,5,6. Därför är det absolut nödvändigt att införa robust och effektiv teknik för att besvara viktiga biologiska frågor om värdförsvarsrespons och mikrobiell patogenes.
Den nya tidsåldern av tekniska framsteg inom masspektrometri (MS), inklusive generering av kraftfulla beräknings- och bioinformatiska rörledningar, utgör grunden för en integrativ vision för storskalig analys av värdpatogen forskning7,8. Konventionell patogenes-driven proteomisk analys profilerar ofta synen på infektion från antingen värd- eller patogenperspektivet, inklusive omfattande metoder som proteinkorrelationsprofilering, affinitetskromatografi i kombination med proteomik och interactomik9. Undersökningar av virulensen hos farliga patogener i ett värdsystem är av enorm klinisk betydelse; Tillämpningen av en analys med dubbla perspektiv i ett enda experiment ansågs dock tidigare ouppnåelig. Till exempel överväldigas patogenens perspektiv mot infektion ofta av mycket rikliga värdproteiner vilket resulterar i minskad känslighet för påvisande av låg rikliga svampproteiner7. Dessutom inbjuder den höga provkomplexiteten många mål att undersöka i ett enda experimentellt system och visar sig vara utmanande att klargöra verkningsmekanismer för ett specifikt patogenprotein.
Bottom-up proteomik är en populär MS-teknik som möjliggör hanterbar provberedning, där peptider genereras av sekvensspecifik enzymatisk matsmältning följt av vätskekromatografiseparation, identifiering och kvantifiering av MS10,11. Här presenterar vi en metod som visar en databeroende förvärvsstrategi som syftar till att uppnå en opartisk täckning av en infektionsbaserad proteom eller "infectome". Specifikt sprider etikettfri kvantifiering (LFQ) beroendet av kemiska eller metaboliska etiketter för robust och korrekt identifiering av proteinnivåförändringar över flera proteomer, vilket minskar provhanteringen och bearbetningsstegen12,13. Denna universella tillämpning förhör producerade proteiner vid en given tidpunkt inom en cell oberoende av förväntad proteinproduktion. Således kan nya insikter upptäckas som är kritiska för infektion.
Arbetsflödet som beskrivs häri är optimerat för att utforska proteinnivåförändringar av C. neoformaner under infektions-härmande tillstånd med värd immunceller (Figur 1). I stället för att förlita sig på isolering och separation av celltyper extraherar detta tillvägagångssätt värden och patogenproteomen tillsammans och använder bioinformatisk separation med hjälp av två organismspecifika databaser för att skilja artspecifik proteinproduktion. Denna metod ger fördelar för ett obegränsat antal prover som ska bearbetas utan de extra kostsamma beredningssteg som krävs i isotopbaserade märkningsstudier eller fraktionering. Dessutom stöder detta arbetsflöde optimerade proteinutvinningsprotokoll som kan överföras till ett brett spektrum av svamp- och bakteriella patogener som kan rikta in sig på och infektera värd immunceller. Sammantaget beskriver detta protokoll stegen för att slutföra en opartisk proteinutvinning och provbehandling för högupplöst MS, följt av data och statistisk analys, som kan ge en mängd kunskap om svampproteiner som är viktiga för infektion i kombination med omfattande profilering av värdförsvarssvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En odödlig linje av makrofager som härrör från BALB/c möss användes för följande protokoll som godkänts av University of Guelph Animal Utilization Protocol 4193. I synnerhet kan andra stammar av möss eller andra källor till odödliga celler appliceras på det skisserade protokollet med tillräcklig testning för att optimera de detaljerade parametrarna. Följande protokoll navigerar i stegen som börjar med en frusen flaska makrofatceller. Cellerna lagras i 10% FBS (fetalt bovint serum), 1% L-glutamin och 5% Pen/Strep (Penicillin-Streptomycin) blandning till DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) och 20% DMSO (dimetylsulfoxid).
1. Odling av C. neoformaner
- Med hjälp av en glycerolbuljong, streak wildtype C. neoformans stam (H99) på jäst-extrakt peptone dextros (YPD) agar platta för att isolera enskilda kolonier.
- Inkubera över natten i 16 timmar vid 37 °C i en statisk inkubator.
- Välj en enda koloni av wildtype C. neoformans stam och kultur i 5 ml YPD buljong i ett löst täckt 10 mL provrör. Utför i fyrdubbelt.
- Inkubera över natten i 16 timmar vid 37 °C i en skakande inkubator vid 200 varv/min.
- Följande dag subkultur varje natt kultur i en 1:100 utspädning i 3 mL YPD buljong.
- Mät värdena optisk densitet (OD600nm)för svampkultur för att bestämma mitt i stockfasen. Beroende på spektrofotometern når C. neoformans wildtype stam mitt i stockfasen som vanligtvis följer 6 till 8 h inkubation i YPD med allmänna OD600nm värden som sträcker sig 1,0 till 1,5.
- När cellerna når mitten av stockfasen, ta en 10 μL alikvot svampcellsupphängning i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör och späd 1:100 i steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer.
2. Odling av makrofagceller
OBS: Se till att arbetsmiljön är steriliserad före cellkulturarbetet.
- Beredning av cellkulturmedium
- Antibiotika-kompletterat medium: Tillsätt 10% FBS (fetala nötkreatur serum), 1% L-glutamin och 5% Penna/Strep (Penicillin-Streptomycin) blandning till DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filtrera medium genom ett komplett filtersystem på 0,2 μm och förvara vid 4 °C.
- Antibiotikafritt medium: Följ identiskt protokoll men utelämna Pen/Strep-blandningen.
- Sådd av makrofagceller
OBS: Antibiotika-kompletterat medium (2.1.1.) bör värmas upp till 37°C före cellkulturarbete.- Tina injektionsflaskan med makrofagceller snabbt i 37 °C pärlbad.
- Tvätta celler av fryslösning genom att återanvända cellerna i 1 ml antibiotika-kompletterat medium.
OBS: Extra försiktighet krävs för att säkerställa att cellerna inte lyser på grund av hård pipetting. - Överför återanvändda celler till ett sterilt 15 ml-rör.
- Pelletsceller genom centrifugering vid 400 × g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en serologisk pipett eller vakuumaspirator.
- Försiktigt återanvänd pellet i 10 ml antibiotika kompletterat medium.
- Försiktigt pipett återanvända celler i en 60 x 15 mm cellkulturbehandlad maträtt.
- Inkubera skålen vid 37 °C med 5 % CO2 över natten.
- Inledande passage av makrofatceller
OBS: Frysta celllager innehåller vanligtvis mellan 5 och 10 miljoner celler per flaska (ca 1 ml). På den följande dagen kommer makrofatceller som har överlevt såddprotokollet att hålla sig till botten av cellkulturrätten och kommer att vara redo för passaging.- Varmt antibiotika-kompletterat medium (steg 2.1.1) till 37 °C före cellkulturarbete. Se till att arbetsmiljön steriliseras inför cellkulturarbetet. Visualisera celler med hjälp av ett ljusmikroskop för att säkerställa att cellerna följs och är friska.
- Ta bort cellkulturmediet från skålen antingen med en serologisk pipett eller en vakuumaspirator.
- Tillsätt försiktigt 5-7 ml steril PBS vid rumstemperatur (fosfatbuffrad saltlösning) i skålen på 60 x 15 mm.
- Luta försiktigt skålen för att tvätta vidhäftade celler.
- Ta bort PBS med en serologisk pipett eller vakuumaspirator.
- Tillsätt 1 ml kall PBS (lagrad vid 4 °C) i cellerna, luta skålen för att fördela PBS över alla celler och låt sitta vid rumstemperatur i 1 min.
- Släpp cellerna genom att försiktigt knacka på skålen, pipetting cold PBS mot cellerna eller genom att använda en cellskrapa.
- Tillsätt 9 ml antibiotika-kompletterat medium till skålen.
- I en ny 60 x 15 mm skål, tillsätt 9 ml färskt antibiotika-kompletterat medium och 1 ml återsuspenderade celler från originalrätten.
- När antalet önskade passagingplattor har fyllts kan återanvända celler från originalrätten kasseras.
- Inkubera den nya skålen vid de inställningar som nämns ovan (steg 2.2.8).
- Utför efterföljande passaging när cellerna har nått 70-80% sammanflöde (ungefär varannan dag beroende på cellinje och medium som används).
OBS: Makrofagceller bör passeras minst fem gånger före infektionsexperiment. Beroende på cellinjen bör infektionsexperiment utföras med 25 till 30 passager. Efter 25 till 30 passager ska cellerna frysas eller kasseras. Avsnitt 2.4 eller 2.5 kan väljas på grundval av försöksplanerna. Avsnitt 2.4 kommer att användas för följande avsnitt.
- Sådd av makrofagceller före infektion
- Utför steg 2.3.1 till 2.3.7.
- Med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare bestämmer celltätheten (celler/ml).
- Överför 0,3 x 106 makrofagceller till en enda brunn på en 6-brunns cellkulturplatta.
- Justera den totala volymen brunn till 1 ml med antibiotika-kompletterat medium (steg 2.1.1).
- Upprepa steg 2.4.3 och 2.4.4 tills 8 brunnar har fyllts (4 brunnar fyllda i två separata plattor).
- Fyll eventuellt de återstående två brunnarna med 1 ml PBS vid rumstemperatur för att bibehålla fuktnivåerna vid inkubation.
- Låt cellerna växa under inkubationsförhållanden som nämns i steg 2. 2.8 för 2 d före infektion.
- Sådd av makrofagceller på infektionsdagen
- Utför steg 2.3.1 till 2.3.7.
- Med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare bestämmer celltätheten (celler/ml).
- Frö 1,2 x 106 makrofagceller i en enda brunn på en 6-brunns cellkulturplatta.
- Justera den totala volymen av brunn till 1 ml med antibiotika-kompletterat medium (2.1.1).
- Upprepa 2.4.3 och 2.4.4 tills 8 brunnar har fyllts (4 brunnar fyllda i två separata plattor).
- Fyll eventuellt de återstående två brunnarna med 1 ml PBS vid rumstemperatur för att bibehålla fuktnivåerna vid inkubation.
- Inkubera celler under förhållanden som nämns i steg 2.2.8 i 3 h så att cellerna kan fästa vid brunnar.
3. Infektion av makrofagceller med C. neoformaner
OBS: När du når 70-80% sammanflöde kommer det att finnas ca 1,2 x 106 makrofagceller per brunn. För att uppnå önskad multiplicitet av infektion (MOI) på 100:1 krävs 1,2 x10 8 svampceller för varje reaktion. Kulturer måste sättas i enlighet därmed i biologisk fyrdubbelt.
ANSVARSFRISKRIVNING: En MOI på 100:1 har uppnått önskvärda resultat i vår forskargrupp och är tänkt som ett förslag till läsarna. En lägre MOI kan krävas för mer infektiösa C. neoformans stammar eller för mindre motståndskraftiga makrofag cellinjer. Verifiering av infektion (avsnitt 3.5) kan användas för att bestämma den idealiska MOI för vissa C. neoformans - makrofagkombinationer.
- Beredning av svampceller
- Följ steg 1 för tillväxt av C. neoformans till mitten av stockfasen.
- Samla och centrifugera celler vid 1 500 x g i 10 min, tvätta försiktigt pellets med sterilt PBS vid rumstemperatur och upprepa för totalt tre tvättar.
- Återanvända celler i antibiotikafritt cellkulturmedium (steg 2.1.2) för att uppnå en koncentration på 1, 2 x 108 celler/ml.
- Förberedelse av makrofatceller
- Visualisera varje brunn i 6-brunnsplattan för att säkerställa att cellerna har nått 70-80% sammanflöde. Alternativt kan celler mätas för att uppnå ca 1,2 x 106 makrofagceller per brunn.
- Följ steg 2.3.1 till 2.3.4.
- Samkultur av C. neoformaner och makrofagceller
- Tillsätt 1 ml av de återanvända C. neoformanscellerna (steg 3.1.3) till 4 brunnar som innehåller makrofagceller som framställs i avsnitt 3.2.
OBS: Antalet plattor som krävs måste beräknas innan experimentet påbörjas. Tillsätt 1 ml antibiotikafritt medium (steg 2.1.2) för att tömma brunnar. - Låt cellerna inkubera under de förhållanden som anges (steg 2.2.8) i 3 timmar.
- Ta bort cellkulturmediet från plattan antingen med en serologisk pipett eller en vakuumaspirator.
- Tillsätt försiktigt 1 ml steril PBS vid rumstemperatur.
- Luta försiktigt plattan för att tvätta icke-fästa eller icke-faagocytosed extracellulära C. neoformans celler.
- Ta bort PBS med en serologisk pipett eller vakuumaspirator, upprepa för totalt tre tvättar. Upprepa 3.3.4 till 3.3.5 två gånger till.
- Tillsätt 1 ml av de återanvända C. neoformanscellerna (steg 3.1.3) till 4 brunnar som innehåller makrofagceller som framställs i avsnitt 3.2.
- Oinfekterade makrofager
- På samma sätt, använd 4 brunnar av en 6 brunnsplatta för att fungera som makrofagprover. Tillsätt 1 ml antibiotikafritt medium (steg 2.1.2) till dessa brunnar.
- Upprepa steg 3.3.2 till 3.3.6.
- Kontroll av infektion
OBS: Med hjälp av cytotoxicitetsanalys kan infektionskunskaper mätas. Följande protokoll kommer att belysa tillämpningen av en cytotoxicitetsprodukt för att mäta LDH (laktatdehydrogenas) frisättning. Andra cytotoxicitetsprodukter kan också användas.- Beredning av C. neoformans infektion av makrofagceller
- Upprepar steg 1, 2 och 3 (upp till 3,5). LDH-analysen kan utföras i tre exemplar, om så önskas.
- Efter steg 3.3.6, tillsätt 1 ml antibiotikafritt medium (2.1.2) till varje brunn i 6-brunnsplattan.
- Upprepa steg 2.4.3 och 2.4.4 tills 3 brunnar plus 3n brunnar har fyllts (där n är antalet uppmätta tidspunkter).
- Inkubera celler under förhållanden som anges i steg 2.2.8.
- Vid utvalda tidpunkter (t.ex. 1, 3, 6, 12 och 24 timmar) samla supernatant för mätning av LDH-frisättning enligt tillverkarens instruktioner
- Samtidigt kommer oinfekterade makrofagceller att lysas till bestämt värde för maximal cytotoxicitet.
- Beräkna cytotoxicitet enligt följande:
- Beredning av C. neoformans infektion av makrofagceller
4. Provtagning
- Samkultur och oinfekterad makrofagsamling
- Tillsätt 1 ml kall PBS till cellerna (från 3.3.6 och 3.4.2) och låt sitta i rumstemperatur i 1 min.
- Släpp ut celler från plattan genom skonsam gängning av plattan eller skonsam pipetting kall PBS mot cellerna.
OBS: Cellskrapa bör undvikas eftersom detta kan orsaka lys av celler. - Pipett återanvände celler i ett 15 ml-rör.
- Centrifugceller vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur och ta bort supernaten.
- Processceller (enligt steg 5) omedelbart eller blixtfrysta i flytande kväve och lagrade vid -80 °C för senare bearbetning.
5. Cellulär proteome
OBS: Tillräcklig lys måste optimeras för den analyserade celltypen (dvs. mängden cykler och amplituder beror på cellpelletstorlek och effektprocenten för sondljudsmodellen).
- Infekterad makrofatcellslys
- Återanvända pelleterade celler (steg 4. 1.5) i 300 μL 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) bestående av en nyupplöst proteashämmarcocktailtablett.
OBS: En proteashämmarcocktailtablett tillsätts till 10 ml iskyla 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) innan experimentet påbörjas. - Sond soniska celler i ett isbad i 15 cykler av 30 s på och 30 s av, för att lysa cellerna.
- Centrifugera celler kort för 30 s vid 400 x g , varförsiktig så att du inte bildar en pellet, bara för att ta bort vätska på sidorna av rör följt av överföring av prov till ett 2 mL Lo-bindande mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1:10 volym på 20% SDS till en slutlig koncentration på 2%.
- Tillsätt 1:100 volym 1 M dithiothreitol (DTT) till en slutlig koncentration på 10 mM och blanda provet noggrant genom pipetting, följt av inkubation på ett värmevärmeblock vid 95 °C i 10 min vid 800 varv/min agitation. Därefter svalnar du till rumstemperatur (kylning kan göras på is).
- Tillsätt 1:10 volym på 0,55 M jodacetamid (IAA) för att erhålla en slutlig koncentration på 55 mM och blanda provet noggrant genom pipetting. Inkubera i rumstemperatur i mörkret i 20 min.
- Tillsätt 100% aceton för att få en slutlig koncentration på 80% aceton och lagra prov över natten vid -20 °C för att fälla ut proteiner.
- Återanvända pelleterade celler (steg 4. 1.5) i 300 μL 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) bestående av en nyupplöst proteashämmarcocktailtablett.
- Protein matsmältning
- Nästa dag, samla fällning pellet genom centrifugering i 10 min vid 10,000 x g och 4 °C. Kassera supernatant och tvätta pellets med 500 μL 80% aceton. Upprepa för totalt två tvättar. Lufttorr pellet vid rumstemperatur efter tvätt.
- Resolubilisera proteinpellet i 100 μL 8 M urea/40 mM HEPES för att säkerställa fullständig löslighet, virvel eller sonicat i ett isvattenbad i 15 cykler på 30 s och 30 s av.
OBS: Justering av volymen karbamid/HEPES bestäms på storleken på utfälld cellpellet, om förändringar sker måste alla nedströmsvolymer justeras på lämpligt sätt. - Kvantifiera proteinkoncentrationen med hjälp av en proteinanalys (t.ex. BCA-proteinanalys) enligt tillverkarens instruktioner och justera för bakgrundsmätning genom blank normalisering med 8 M urea/40 mM HEPES.
- Tillsätt 300 μL 50 mM ammoniumbikarbonat för att få en slutlig koncentration på 2 M urea.
OBS: Möjlighet att normalisera proteinkoncentrationen för nedströmsmätningar, föreslås att smälta 100 μg protein och lagra det återstående osmälta provet genom blixtfrysning i flytande kväve och sedan lagra vid -20 °C på kort sikt eller vid -80 °C på längre sikt. - Tillsätt 2:50 (v/w) enzym-till-protein-förhållande mellan trypsin/Lys-C proteasblandning på is och knacka försiktigt på röret för att blanda, inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Efter inkubation, stoppa matsmältningen genom att tillsätta 1:10 volymstopplösning (20% acetonitril, 6% trifluoracetisk syra) och centrifugeringsprover vid 10 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Samla supernatant (består av smälta peptider) och kassera eventuellt pelleterat skräp eller fällning.
- Peptiddesaltning
- Aktivera en C18 Stop And Go Extraction (STAGE) spets (bestående av 3 lager C18 harts i en 200 μL pipettspets) genom att tillsätta 100 μL 100% acetonitril och centrifugera vid 1 000 x g i 2 min.
- Balansera C18 STAGE-spetsen genom att tillsätta 50 μL buffert B (80 % (v/v) acetonitril, 0,5 % (v/v) ättiksyra) och centrifugera vid 1 000 x g i 2 minuter.
- Jämvikta C18 STAGE-spetsen genom att tillsätta 200 μL buffert A (2% (v/v) acetonitril, 0,1% (v/v) trifluoracetisk syra, 0,5% (v/v) ättiksyra) och centrifugera vid 1 000 x g i 3-5 min.
- Tillsätt ~50 μg smält prov på C18 STAGE spets och centrifugera vid 1 000 x g i 3-5 min, eller tills provet har passerat genom spinnkolonnen. Flash frys det återstående smälta provet i flytande kväve och lagra vid -20 °C tills det behövs.
- Tvätta C18 STAGE-spetsen med 200 μL buffert A och centrifugera vid 1 000 x g i 3-5 min.
- Tillsätt 50 μL buffert B till C18 STAGE-spetsen och centrifugen vid 500 x g i 2 minuter. Samla eluterade peptider i 0,2 ml PCR-rör.
- Torka de eluterade peptiderna i en vakuumcentrifug i 30-40 min vid maximal hastighet. Helt torkade prover får förvaras i rumstemperatur eller vid -20 °C tills de bearbetas.
OBS: Torkade och avsaltade peptider är lämpliga provinlämningar till masspektrometrianläggningar för bearbetning och kan transporteras vid rumstemperatur.
6. Masspektrometri
- Rekonstituera peptider i 10 μL buffert A och mät koncentrationen som är nödvändig för att injicera ~1,5 till 3 μg peptider på MS-kolonnen. Mängden prov beror på instrumenteringen.
- Använd en förutbestämd gradient av acetonitril (ca 5-60%) i 0,5% ättiksyra under önskad tid (t.ex. 2 h) för att separera peptider med högpresterande vätskekromatografi, följt av elektrosprayjonisering i masspektrometern.
- Skaffa MS-skanningar med hjälp av en högupplöst masspektrometer i databeroende förvärvsläge (m/z 300 till 1650).
Obs: Övertoningsprocent och längd bestäms av experimentet och användaren. Exakta inställningar för masspektrometer beror på instrumentering, experiment och användarpreferenser.
7. Dataanalys
MS-data kan bearbetas med många bioinformatikpipeliner. I det här protokollet beskriver vi bearbetning med hjälp av de offentligt tillgängliga MaxQuant- och Perseus-plattformarna men rekommenderar enskilda användare att utvärdera bioinformatiska verktyg som är lämpliga för analys, preferens och användning.
- Läs in obearbetade datafiler (direkt från MS-instrumentet) med Hjälp av MaxQuant-programvara. Identifiera proteiner under de modifierade MaxQuant-sökparametrarna; minst två unika peptider som är nödvändiga för proteinidentifiering med hjälp av en måldecoy-metod för en falsk upptäcktsfrekvens på 1%, genomföra etikettfri kvantifiering med matchning mellan körningar, införliva organismerna FASTA-filen som erhållits från UniProt-databasen (dvs. Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus)för att identifiera och kvantifiera nuvarande peptider med Andromeda sökmotor. Se offentliga MaxQuant onlineverktyg för detaljerade självstudier (se Materialförteckning).
- Ladda upp MaxQuant-utdatafilen ("proteingrupper.txt") till Perseus.
- Filtrera rader som innehåller potentiella falska positiva identifieringar och föroreningar, samt endast modifierade av platspeptider med "Filterrader baserade på kategorisk kolumn".
- Omvandla datavärden i logg2-skalan.
- Skapa datauppsättningsgrupper genom att tillhandahålla kategorisk anteckning till raderna.
- Filtrera datauppsättning efter giltiga värden för att definiera en brytpunkter för proteindetektering.
OBS: För en strikt och robust analys föreslås en >50% identifieringsgrad. Om till exempel fyra replikat bearbetades skulle minst tre giltiga värden väljas. - Om så önskas kan du imputera data genom att ersätta saknade värden från den normala fördelningen.
OBS: Imputerade värden optimeras baserat på normal fördelning och ger en slumpmässig LFQ-intensitet för att ersätta "NaN" platshållare för att simulera typiska förekomstmätningar. Denna imputation utgör en plattform för statistisk analys i senare led som kräver kvantifierbara data. - Lägg till anteckningar till proteinraderna (t.ex. proteinnamn, Gene Ontology-termer).
Obs: Detta Perseus-arbetsflöde som genereras är nu ett robust ramverk för ytterligare bioinformatisk bearbetning, statistisk analys och datavisualisering, se offentliga Perseus onlineverktyg för detaljerade självstudier (se Tabell över material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs ovan möjliggör identifiering och kvantifiering av proteiner som härrör från både svamppatogenen C. neoformans, och värden, makrofagceller, i ett enda experiment. Efter samkultur samlas celler in och bearbetas tillsammans och separeras bioinformatiskt baserat på peptidprofiler som är specifika för varje art. Detta är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att definiera samspelet mellan värdpatogenförhållandet under infektion. Antalet proteiner som identifieras från experimentet beror på startmaterial, provberedning, gradientlängd, MS-instrumentering och bioinformatiskt arbetsflöde. Med hjälp av protokollet som beskrivs häri identifierar vi vanligtvis cirka 8 000 proteiner från experimentet med 1 500 C. neoformansproteiner och 6 500 värdproteiner. Efter bearbetning av datamängderna genererar vi ett PCA-diagram (Principal Component Analysis) för att observera kritiska faktorer som driver vår analys (Figur 2A). Här observerar vi den största komponenten i separationen bland data är infekterade kontra icke-infekterade prover, som vi skulle förutse från den experimentella designen (komponent 1, 79,8%), och en andra särskiljande egenskap hos proverna är biologisk variabilitet (komponent 2, 5,7%). Därefter grupperar en Pearson-korrelation i kombination med hierarkisk klustring av euklidiska avstånd proverna och möjliggör kvantifiering av variabiliteten mellan replikationerna (figur 2B). I vår analys observerade vi distinkt kluster av infekterade kontra icke-infekterade prover och replikera reproducerbarhet som sträcker sig från 95-96%, vilket representerar god reproducerbarhet bland replikat. Slutligen utför vi en Students t-test korrigeratför flera hypotestester med hjälp av en Benjamini-Hochberg falsk upptäcktsfrekvens (FDR) (p-värde ≤ 0,05; FDR = 0,01; s0 = 1) för att identifiera proteiner med signifikanta skillnader i överflöd under infektion jämfört med icke-infekterade kontroller(figur 2C). Här identifierar vi 760 proteiner med betydande förändringar i överflöd, inklusive 117 värdproteiner med 86 som visar en betydande minskning och 31 visar en betydande ökning vid infektion. Noterbart är att vi också observerar betydande ökningar av överflöd av svampproteiner, som förväntat under infektion. Med dessa data utförs efterföljande analyser, inklusive nätverksmappning, i silico-karakterisering och uppföljningsexperiment för att validera data och utforska de molekylära mekanismer som ligger till grund för värdens svar på virulens.
Figur 1: Masspektrometribaserat proteomiskt arbetsflöde för analys av makrofager infekterade med C. neoformaner. Arbetsflödet börjar med insamling av makrofager som antingen är infekterade med C. neoformans eller icke-infekterade kontroller. Proteiner extraheras genom mekaniska och kemiska störningar, följt av minskning och alkylering, acetonutfällning och enzymatisk matsmältning. Peptider renas på C18 STAGE-spetsar, separerade av högpresterande vätskekromatografi, utsätts för elektrosprayjonisering och mäts på en högupplöst masspektrometer. Data bearbetas, analyseras och visualiseras i de offentligt tillgängliga bioinformatikplattformarna, MaxQuant (med Andromeda) och Perseus14,15,16. Experiment som utförs i biologisk fyrdubbelt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa uppgifter för C. neoformans infektion i makrofagceller. (A) Huvudkomponentanalys visar skillnaden mellan infekterad kontra icke-infekterad makrofag (komponent 1, 79,8%) och klustring av biologiska replikat (komponent 2, 5, 7%). (B) Värmekarta över Pearson-korrelation ritad av hierarkisk klustring på euklidiskt avstånd för att visa klustring av prover (infekterade kontra icke-infekterade) och replikat reproducerbarhet (>95%). C)Vulkantomt av identifierade proteiner. Blå = svampproteiner med betydande förändring i överflöd; svart = makrofagproteiner med betydande förändring i överflöd. Studentens t-test(p-värde ≤ 0,05), FDR = 0,01; s0 = 1. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet inkluderar beredning av makrofagceller och insamling av samkulturprover för proteinbearbetning med minimal störning i cellerna. Det är viktigt att utföra steg för tvättning, inokulera och ta bort vidhäftande makrofagceller försiktigt och noggrant för att förhindra onödig lys av celler före insamling. Att fastställa rätt MOI för experimentet är också avgörande eftersom inokulera med en alltför hög MOI kan orsaka snabb makrofagcelldöd och svårigheter att samla in och bearbeta prover för MS. Omvänt kommer låga MOI-nummer att leda till färre faagocytosed svampceller och begränsad upptäckt av svampproteiner i det biologiska systemet. För att övervinna sådana begränsningar rekommenderar vi att du utför testexperiment med olika mois, som stöds av celldödsanalyser (t.ex. LDH-kvantifiering) för att definiera antalet svampceller som initierar ett värdsvar men inte dödar värdcellerna före insamlingen. För experimenten strävar vi efter att identifiera infektionsrelaterade svampproteiner, vilket kräver en hög MOI (100:1) för att på ett adekvat sätt upptäcka svampproteiner bland mycket rikliga värdproteiner. Vi utför rutinmässigt makrofag cytotoxicitet analyser för att bedöma MOI inverkan på värd cell död innan utför hela experimentet. Tidpunkten för inkubation av C. neoformans celler med makrofager är också avgörande eftersom svampcellerna kan ha stora polysackarider kapslar och därför kräver makrofag mer tid för uppslukning. Vi väljer att använda en co-culture inkubationstid på 3 h för det skisserade experimentet, eftersom vi fann god täckning av svampproteome vid denna tidpunkt och att ge en "snap-shot" av värdrespons; Forskare kanske dock vill utforska tidigare och senare tidpunkter och observera hur timing påverkar svamp- och värdproteinproduktionen. Alternativt har priming makrofagen för opsonisering utförts för att hjälpa den fagocytiska processen17,18.
För provtagning, om prover inte bearbetas omedelbart blinkar frysning i flytande kväve, hjälper till att förhindra oönskad nedbrytning av proteiner genom proteaser som finns i proverna. För MS-baserade proteomiska analyser bör dessutom risken för kontaminering från damm eller keratin (t.ex. hud- och hårceller) begränsas genom användning av nitrilhandskar, laboratorieskikt och tvättning av alla ytor med 70 % etanol innan experimenten påbörjas. Dessutom är de protokoll som beskrivs ovan specifika för den samkulturerade provuppsättningen som beskrivs men kan ändras för arbetsflödesoptimering avproteinextraktion, efter behov 19,20. Möjligheter att ändra arbetsflödet och optimera för specifika celltyper inkluderar valda mekaniska och kemiska störningstekniker, varaktighet och temperatur för enzymatisk matsmältning och separation av proverna. Till exempel utförs lys av C. neoformans celler vanligtvis genom mekanisk pärlslagning; Vi har dock observerat ökad proteome täckning efter sond ultraljudsbehandling och därför rekommendera det för mekanisk störning av de infekteradecellerna 19,21,22. Till exempel kan fraktionering av peptidprover i alikvoter genom hög pH-fraktionering eller storleksuteslutning kromatografi minska provkomplexiteten och förbättra täckningsdjupet på masspektrometern9. För att uppnå täckningsdjupet för att identifiera cirka 8 000 värd- och svampproteiner krävs dessutom ett högupplöst masspektrometrisystem (t.ex. QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).
Användningen av LFQ för kvantifiering av förändringar i proteinnivåer under infektion är ett tillförlitligt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för MS-baserade proteomik12. Det möjliggör kvantifiering av proteiner genom relativt överflöd utan behov av ytterligare provbearbetningssteg. Dessutom utförs analysen efter slutförandet av experimentet och lånar ut sig till universella applikationer och en flexibel studiedesign. Begränsningar av LFQ inkluderar dock ökad instrumenteringstid eftersom proverna måste köras sekventiellt och inte kan kombineras, jämförbarheten mellan proverna kan vara utmanande och behovet av imputering för att ersätta saknade värden kan vara högt23. Alternativa metoder för kvantifiering av proteinförekomst inkluderar metaboliska (t.ex. stabil isotopmärkning av aminosyror i cellkulturen) och kemiska (t.ex. tandemmassetiketter), som gör det möjligt att kombinera prover för att minska instrumenttiden, ge tillförlitlig jämförbarhet mellan proverna och vanligtvis leda till mindre saknade värden24,25. Sådana metoder kräver dock ytterligare prov hanterings-och bearbetnings steg, ökad komplexitet och tid för våta labb experiment och tid, samt kräver en fast experimentell design. För att välja en kvantifieringsmetod som är optimal för föreslagna experiment bör användarna överväga studiedesign och jämförbarhet av prover, våt labbkomplexitet och dataanalys samt tillgänglighet och kostnad för instrumenteringstid.
Nyheten i det protokoll som presenteras är förmågan att definiera förändringar i proteomen från både värd- och patogenperspektiv i ett enda experiment. Djupet av täckningen av båda proteomes möjliggör ny insikt i hur patogenen initierar infektion och hur värden svarar i försvar. Särskilt fokuserar tillvägagångssättet på infektion i hela cellen; Det finns dock möjligheter att definiera subproteomer eller kupéiserade svar på infektion genom kombination med rumsliga lokaliseringstekniker (t.ex. centrifugering, berikning, märkning)26,27. Här beskriver vi interaktionen mellan makrofager och svamppatogenen, C. neoformans; Tillvägagångssättet är dock universellt och kan tillämpas på interaktioner mellan en mängd olika biologiska system. Till exempel använde vi nyligen ett liknande arbetsflöde för att avslöja allmänna och platsspecifika svar av neutrofiler som härrör från en murinmodell av okulär keratit28,29,30. Dessutom kan de infectome datasets som genereras från detta protokoll integreras med in vitro proteome och secretome profilering av en patogen för att upptäcka proteiner med förändrat överflöd i närvaro av värdceller. Sådana proteiner, som kallas infektionsrelaterade proteiner, ger en mängd kända och nya virulensfaktorer för ytterligare karakterisering, inklusive temporal reglering, lokalisering och direkta proteinproteininteraktioner med värden. Sammantaget ger det skisserade MS-baserade proteomics-arbetsflödet en ny möjlighet att undersöka det invecklade förhållandet mellan värd och patogen i ett enda experiment med universalitet och förståelse som inte är allmänt tillgängligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Jonathan Krieger från Bioinformatics Solutions Inc. för att ha skött masspektrometern för representativa experiment, liksom medlemmar i Geddes-McAlister-gruppen för deras hjälp med experimentell uppsättning och manuskriptfeedback. Författarna erkänner delvis finansieringsstöd från Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425) och Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) för J.G.M., samt NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., och Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
