Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/61881

Summary

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Abstract

Kütle spektrometresinin (MS) teknolojik başarıları, bir organizmanın küresel proteomunu değişen koşullar altında analiz etmek için keşfedilmemiş birçok yol açar. Mikrobiyal patojenlerin istenen konak ile etkileşimlerine uygulanan bu güçlü strateji, her iki bakış açısını da enfeksiyona karşı kapsamlı bir şekilde karakterize eder. Burada, iş akışı, ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücrelerinin varlığında ölümcül hastalık kriptokokokozun etken maddesi olan mantar öğretim üyesi hücre içi patojen Cryptococcus neoformans'ın enfektomunun etiketsiz nicelemesini (LFQ) açıklar. Protokol, tek bir deneyde hem patojen hem de memeli hücreleri için uygun protein hazırlama tekniklerini detaylandırıyor ve bu da sıvı kromatografisi (LC)-MS/MS analizi için uygun peptit gönderimi ile sonuç veriyor. LFQ'nun yüksek verimli jenerik doğası, çok çeşitli protein tanımlama ve nicelemenin yanı sıra herhangi bir konak-patojen enfeksiyon ayarına aktarılabilmesini sağlar ve aşırı hassasiyeti korur. Yöntem, enfeksiyon taklit eden koşullarda bir patojenin kapsamlı, tarafsız protein bolluk profillerini kataloglamak için optimize edilmiştir. Özellikle, burada gösterilen yöntem, virülans için gerekli protein üretimi gibi C. neoformans patogenez hakkında temel bilgiler sağlar ve mikrobiyal istilaya yanıt veren kritik konak proteinleri tanımlar.

Introduction

İnvaziv mantar enfeksiyonlarının prevalansı büyük ölçüde artmaktadır ve en sık immün yetmezlik yatkınlığı olan bireylerde bildirilen kabul edilemez yüksek ölüm oranları ile ilişkilidir1. Cryptococcus neoformans, konak makrofaj hücrelerinde hücre içi sağkalım yapabilen ünlü bir fırsatçı mantar patojenidir. Yetersiz antifungal müdahale, kriptokoksal menenjit ve meningoensefalit2,3mantar yayılması ve hayatı tehdit eden belirtilerle sonuçlanır. İmmün sistemi baskılanmış statüdeki küresel artış, C. neoformanlar da dahil olmak üzere birçok mantar türünün4,5,6'yadoğru giderek daha fazla direnç geliştirdiği antifungal ajanların kullanımında paralel bir artış talep etti. Bu nedenle, konak savunma yanıtı ve mikrobiyal patogenez ile ilgili hayati biyolojik soruları yanıtlamak için sağlam ve verimli teknolojilerin uygulanması zorunludur.

Güçlü hesaplamalı ve biyoinformatik boru hatlarının üretimi de dahil olmak üzere kütle spektrometresinde (MS) teknolojik ilerlemenin yeni çağı, konak-patojen araştırmalarının büyük ölçekli analizi için bütünleştirici bir vizyon için temel sağlar7,8. Konvansiyonel patogenez odaklı proteomik analiz, protein korelasyon profilleme, proteomik ile birlikte benzeşim kromatografisi ve interactomik9gibi kapsamlı metodolojiler de dahil olmak üzere, enfeksiyonun ana bilgisayar veya patojen perspektifinden görünümünü yaygın olarak profiller. Konak bir sistemde tehlikeli patojenlerin virülansına yönelik araştırmalar çok büyük klinik öneme sahiptir; ancak, tek bir deneyde çift perspektif analizinin uygulanması daha önce ulaşılamaz olarak kabul edildi. Örneğin, patojenin enfeksiyona bakış açısı genellikle çok bol konak proteinleri tarafından boğulmuştur ve bu da düşük bol mantar proteinlerinin tespiti için daha az hassasiyetle sonuçlanır7. Ayrıca, yüksek örnek karmaşıklığı birçok hedefi tek bir deneysel sistemde araştırmaya davet eder ve belirli bir patojen proteini için etki mekanizmalarını aydınlatmaya zor olduğunu kanıtlamaktadır.

Aşağıdan yukarıya proteomik, peptitlerin diziye özgü enzmatik sindirim ve ardından MS10 , 11ile sıvı kromatografi ayırma, tanımlama ve niceleme ile üretildiği yönetilebilir numune hazırlamayı sağlayan popüler bir MS tekniğidir. Burada, enfeksiyon bazlı bir proteom veya 'infectome'nin tarafsız bir kapsamını elde etmeyi amaçlayan veriye bağımlı bir satın alma stratejisini gösteren bir yöntem sunuyoruz. Özellikle, etiketsiz niceleme (LFQ), birden fazla proteomdaki protein seviyesi değişikliklerinin sağlam ve doğru tanımlanması için kimyasal veya metabolik etiketlere bağımlılığı azaltır, numune işleme ve işlemeadımlarını azaltır 12,13. Bu evrensel uygulama, beklenen herhangi bir protein üretiminden bağımsız bir hücre içinde belirli bir anda üretilen proteinleri sorgular; bu nedenle, enfeksiyon için kritik olan yeni içgörüler keşfedilebilir.

Burada açıklanan iş akışı, konak bağışıklık hücreleri ile enfeksiyon taklit etme koşulları sırasında C. neoformanların protein seviyesi değişikliklerini araştırmak için optimize edilmiştir (Şekil 1). Hücre tiplerinin izolasyonu ve ayrılmasına güvenmek yerine, bu yaklaşım konak ve patojen proteomlarını birlikte çıkarır ve türe özgü protein üretimini ayırt etmek için organizmaya özgü iki veritabanı kullanarak biyoinformatik ayırmayı kullanır. Bu yöntem, izotop bazlı etiketleme çalışmalarında veya fraksiyonasyonda gerekli olan ekstra maliyetli hazırlık adımları olmadan sınırsız sayıda numunenin işlenmesi için avantajlar sunar. Ayrıca, bu iş akışı, konak bağışıklık hücrelerini hedefleyebilen ve enfekte edebilen çok çeşitli mantar ve bakteriyel patojenlere aktarılabilen optimize edilmiş protein ekstraksiyon protokollerini desteklemektedir. Genel olarak, bu protokol, yüksek çözünürlüklü MS için tarafsız bir protein ekstraksiyonu ve numune işlemeyi tamamlama adımlarını ve ardından, konak savunma yanıtının kapsamlı profillemesiyle birlikte enfeksiyon için önemli mantar proteinleri hakkında zengin bir bilgi sağlayabilen veri ve istatistiksel analizi özetlemektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Guelph Üniversitesi Hayvan Kullanım Protokolü 4193 tarafından onaylanan aşağıdaki protokol için BALB/c farelerinden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir makrofaj hattı kullanılmıştır. Özellikle, diğer fare suşları veya diğer ölümsüzleştirilmiş hücre kaynakları, ayrıntılı parametreleri optimize etmek için yeterli test ile özetlenen protokole uygulanabilir. Aşağıdaki protokol, donmuş bir makrofaj hücresi şişesiyle başlayan adımlarda gezinecektir. Hücreler% 10 FBS (fetal sığır serumu), % 1 L-glutamin ve% 5 Pen / Strep (Penisilin-Streptomisin) karışımında DMEM 'e (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) ve% 20 DMSO'da (dimetil sülfit) depolanır.

1. C. neoformanların kült örültme

  1. Gliserol stoğu kullanarak, tek kolonileri izole etmek için Maya özü pepton dekstroz (YPD) agar plakası üzerine seri wildtype C. neoformans suşu (H99).
  2. Statik bir inkübatörde 37 °C'de 16 saat boyunca gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Gevşek bir şekilde kaplanmış 10 mL test tüpünde 5 mL YPD suyunda tek bir wildtype C. neoformans suşu ve kültürü kolonisi seçin. Dört katına çıkar.
  4. 200 rpm'de sallanan bir inkübatörde 37 °C'de 16 saat boyunca bir gecede kuluçkaya yatırın.
  5. Ertesi gün alt kültür her bir gecelik kültür 1:100 seyreltme içine 3 mL YPD et suyu.
  6. Orta kütük fazını belirlemek için mantar kültürünün optik yoğunluk (OD600nm)değerlerini ölçün. Spektrofotometreye bağlı olarak, C. neoformans wildtype suşu, 1.0 ila 1.5 arasında değişen genel OD600nm değerleri ile YPD'de 6 ila 8 h inkübasyonu takiben genellikle orta kütük aşamasına ulaşır.
  7. Hücreler orta kütük fazına ulaştığında, temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 10 μL'lik bir mantar hücresi süspansiyonu alın ve steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:100 seyreltin. Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.

2. Makrofaj hücrelerinin kültülesi

NOT: Hücre kültürü çalışmalarından önce çalışma ortamının sterilize olduğundan emin olun.

  1. Hücre kültürü ortamının hazırlanması
    1. Antibiyotik takviyeli ortam: DMEM'e (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) %10 FBS (fetal sığır serumu), %1 L-glutamin ve %5 Pen/Strep (Penisilin-Streptomisin) karışımı ekleyin. Orta filtreyi 0,2 μm komple filtre sistemi üzerinden filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
    2. Antibiyotik içermeyen ortam: Aynı protokolü izleyin, ancak Pen/Strep karışımını atlayın.
  2. Makrofaj hücrelerinin tohumlama
    NOT: Antibiyotik takviyeli ortam (2.1.1.) hücre kültürü çalışmalarından önce 37°C'ye ısıtılmalıdır.
    1. Makrofaj hücrelerinin şişelerini 37 °C boncuk banyosunda hızlı bir şekilde çözün.
    2. Hücreleri 1 mL antibiyotik takviyeli ortamda yeniden yağlayarak donma çözeltisi hücrelerini yıkayın.
      NOT: Sert pipetleme nedeniyle hücrelerin sızmamasını sağlamak için ekstra önlem gereklidir.
    3. Yeniden biriktirilen hücreleri steril 15 mL tüpe aktarın.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri.
    5. Serolojik pipet veya vakum aspiratörü ile süpernatant dikkatlice çıkarın.
    6. Peleti 10 mL antibiyotik takviyeli ortamda hafifçe yeniden sunun.
    7. Yavaşça pipet, hücreleri 60 x 15 mm hücre kültürüyle işlenmiş bir yemeğe yeniden biriktirdi.
    8. Bir gecede %5 CO2 ile 37 °C'de kuluçka kabı.
  3. Makrofaj hücrelerinin ilk geçişi
    NOT: Dondurulmuş hücre stokları genellikle şişe başına 5 ila 10 milyon hücre içerir (yaklaşık 1 mL). Sonraki gün, tohumlama protokolünden kurtulan makrofaj hücreleri hücre kültürü çanağının dibine yapışacak ve geçmeye hazır olacaktır.
    1. Hücre kültürü çalışmalarından önce sıcak antibiyotik takviyeli orta (adım 2.1.1) ila 37 °C. Hücre kültürü çalışmalarından önce çalışma ortamının sterilize olduğundan emin olun. Hücrelerin yapışmasını ve sağlıklı olmasını sağlamak için hücreleri hafif bir mikroskop kullanarak görselleştirin.
    2. Hücre kültürü ortamını serolojik pipet veya vakum aspiratörü ile tabaktan çıkarın.
    3. 60 x 15 mm'lik çanağa 5-7 mL steril oda sıcaklığında PBS (fosfat tamponlu salin) ekleyin.
    4. Yapışan hücreleri yıkamak için kabı hafifçe eğin.
    5. Serolojik pipet veya vakum aspiratörü kullanarak PBS'yi çıkarın.
    6. Hücrelere 1 mL soğuk PBS (4 °C'de saklanır) ekleyin, PBS'yi tüm hücrelere dağıtmak için kabı eğin ve oda sıcaklığında 1 dakika oturmaya izin verin.
    7. Çanağa hafifçe dokunarak, soğuk PBS'yi hücrelere borulayarak veya bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri serbest bırakın.
    8. Yemeğe 9 mL antibiyotik takviyeli ortam ekleyin.
    9. Yeni bir 60 x 15 mm'lik tabakta, orijinal yemekten 9 mL taze antibiyotik takviyeli orta ve 1 mL resüspended hücre ekleyin.
    10. İstenen geçiş plakalarının sayısı doldurulduktan sonra, orijinal tabaktan yeniden doldurulmuş hücreler atılabilir.
    11. Yeni yemeği yukarıda belirtilen ayarlarda kuluçkaya yatırın (adım 2.2.8).
    12. Hücreler % 70-80 izdihama ulaştığında (kullanılan hücre hattına ve ortama bağlı olarak yaklaşık 2 günde bir) sonraki geçişi gerçekleştirin.
      NOT: Makrofaj hücreleri enfeksiyon deneylerinden önce en az beş kez geçilmelidir. Hücre hattına bağlı olarak enfeksiyon deneyleri 25 ila 30 pasajla yapılmalıdır. 25 ila 30 pasajdan sonra, hücreler dondurulmalı veya atılmalıdır. Bölüm 2.4 veya 2.5 deneysel planlara göre seçilebilir. Bölüm 2.4 aşağıdaki bölümler için kullanılacaktır.
  4. Enfeksiyondan önce makrofaj hücrelerinin tohumlama
    1. Geçiş protokolü adımları 2.3.1 ile 2.3.7 arasında gerçekleştirin.
    2. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu (hücreler/mL) belirleyin.
    3. 0,3 x 106 makrofaj hücrelerini 6 kuyulu hücre kültür plakasının tek bir kuyusuna aktarın.
    4. Antibiyotik takviyeli ortam kullanarak toplam kuyu hacmini 1 mL'ye ayarlayın (adım 2.1.1).
    5. 8 kuyu doldurulana kadar (iki ayrı plakaya doldurulmuş 4 kuyu) 2.4.3 ve 2.4.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. İsteğe bağlı olarak, kuluçka sırasında nem seviyelerini korumak için kalan iki kuyuyu 1 mL oda sıcaklığı pbs ile doldurun.
    7. Enfeksiyondan önce 2 d için 2.2.8 adımında belirtilen kuluçka koşullarında hücrelerin büyümesine izin verin.
  5. Enfeksiyon gününde makrofaj hücrelerinin tohumlama
    1. Geçiş protokolü adımları 2.3.1 ile 2.3.7 arasında gerçekleştirin.
    2. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu (hücreler/mL) belirleyin.
    3. Tohum 1.2 x 106 makrofaj hücresi, 6 kuyulu bir hücre kültür plakasının tek bir kuyusuna.
    4. Antibiyotik takviyeli ortam (2.1.1) kullanarak toplam kuyu hacmini 1 mL'ye ayarlayın.
    5. 8 kuyu doldurulana kadar 2.4.3 ve 2.4.4'i tekrarlayın (iki ayrı plakaya doldurulmuş 4 kuyu).
    6. İsteğe bağlı olarak, kuluçka sırasında nem seviyelerini korumak için kalan iki kuyuyu 1 mL oda sıcaklığı pbs ile doldurun.
    7. Hücrelerin kuyulara yapışmasını sağlamak için 3 saat boyunca 2.2.8 adımda belirtilen koşullar altında hücreleri kuluçkaya yatırın.

3. Makrofaj hücrelerinin C. neoformans ile enfeksiyonu

NOT: %70-80 izdihama ulaştıktan sonra kuyu başına yaklaşık 1,2 x10 6 makrofaj hücresi olacaktır. 100:1 enfeksiyon (MOI) istenen çokluğu elde etmek için, her reaksiyon için 1.2 x10 8 mantar hücresi gereklidir. Kültürler biyolojik dörtgen olarak buna göre ayarlanmalıdır.

YASAL UYARI: 100:1 moi araştırma grubumuzda arzu edilen sonuçlar elde etti ve okuyuculara bir öneri olarak tasarlanmıştır. Daha bulaşıcı C. neoformans suşları veya daha az dirençli makrofaj hücre hatları için daha düşük bir MOI gerekebilir. Enfeksiyonun doğrulanması (bölüm 3.5), belirli C. neoformanlar için ideal MOI'yi belirlemek için kullanılabilir - makrofaj kombinasyonları.

  1. Mantar hücrelerinin hazırlanması
    1. C. neoformanların orta günlük aşamasına büyümesi için 1.
    2. Hücreleri 10 dakika boyunca 1.500 x g'da toplayın ve santrifüjleyin, peleti steril oda sıcaklığında PBS ile hafifçe yıkayın ve toplam üç yıkama için tekrarlayın.
    3. 1.2 x 108 hücre/mL konsantrasyon elde etmek için antibiyotiksiz hücre kültürü ortamında (adım 2.1.2) hücreleri yeniden biriktirin.
  2. Makrofaj hücrelerinin hazırlanması
    1. Hücrelerin% 70-80 birleşmeye ulaştığından emin olmak için her bir kuyuyu 6 kuyu plakasında görselleştirin. Alternatif olarak, hücreler kuyu başına yaklaşık 1,2 x 106 makrofaj hücresi elde etmek için ölçülebilir.
    2. 2.3.1 ile 2.3.4 arasında olan adımları izleyin.
  3. C. neoformans ve makrofaj hücrelerinin ortak kültürü
    1. Bölüm 3.2'de hazırlanan makrofaj hücrelerini içeren 4 kuyuya resüspended C. neoformans hücrelerinin 1 mL'lik kısmını (adım 3.1.3) ekleyin.
      NOT: Deneye başlamadan önce gerekli plaka sayısının hesaplanmaları gerekecektir. Boş kuyulara 1 mL antibiyotiksiz ortam (adım 2.1.2) ekleyin.
    2. Hücrelerin listelenen koşullar altında (adım 2.2.8) 3 saat boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
    3. Hücre kültürü ortamını serolojik pipet veya vakum aspiratörü ile plakadan çıkarın.
    4. Yavaşça 1 mL steril oda sıcaklığında PBS ekleyin.
    5. Bağlı olmayan veya fagositoz dışı C. neoformans hücrelerini yıkamak için plakayı hafifçe eğin.
    6. Serolojik pipet veya vakum aspiratör kullanarak PBS'yi çıkarın, toplam üç yıkama için tekrarlayın. 3.3.4 ile 3.3.5'i iki kez daha tekrarlayın.
  4. Bulaşmamış makrofajlar
    1. Aynı şekilde, sadece makrofaj örnekleri olarak hizmet etmek için 6 kuyu plakasının 4 kuyusunu kullanın. Bu kuyulara 1 mL antibiyotiksiz ortam (adım 2.1.2) ekleyin.
    2. 3.3.2 ile 3.3.6 arasında olan adımları yineleyin.
  5. Enfeksiyonun doğrulanması
    NOT: Sitotoksiklik testi kullanılarak enfeksiyon yeterliliği ölçülebilir. Aşağıdaki protokol, LDH (laktat dehidrogenaz) salınımını ölçmek için bir sitotoksisite ürününün uygulanmasını vurgulayacaktır. Diğer sitotoksiklik ürünleri de kullanılabilir.
    1. Makrofaj hücrelerinin C. neoformans enfeksiyonunun hazırlanması
      1. 1, 2 ve 3'ü (3,5'e kadar) yineler. LDH tahlili, tercih edilirse üç taraflı olarak yapılabilir.
      2. 3.3.6 adımını takiben, 6 kuyu plakasındaki her kuyuya 1 mL antibiyotiksiz ortam (2.1.2) ekleyin.
      3. 3 kuyu artı 3n kuyu doldurulana kadar 2.4.3 ve 2.4.4 adımlarını tekrarlayın (burada n ölçülen zaman puanı sayısıdır).
      4. 2.2.8. adımda listelenen koşullar altında hücreleri kuluçkaya yatır.
      5. Seçilen zaman noktalarında (örneğin, 1, 3, 6, 12 ve 24 saat) üreticinin talimatlarına göre LDH sürümünün ölçümü için süpernatant toplayın
      6. Aynı zamanda, enfekte olmayan makrofaj hücreleri maksimum sitotoksiklik için belirlenen değere göre lysed edilecektir.
      7. Sitotoksisiteyi aşağıdaki gibi hesaplayın:
        Equation 1

4. Örnek toplama

  1. Ortak kültür ve bozulmamış makrofaj toplama
    1. Hücrelere 1 mL soğuk PBS ekleyin (3.3.6 ve 3.4.2'den itibaren) ve oda sıcaklığında 1 dakika oturmaya izin verin.
    2. Plakaya hafifçe dokunarak veya hücrelere karşı soğuk PBS'yi hafifçe pipetleyarak hücreleri plakadan serbest bırakın.
      NOT: Hücrelerin lizizine neden olabileceği için hücre kazıyıcıdan kaçınılmalıdır.
    3. Pipet hücreleri 15 mL'lik bir tüpe yeniden biriktirdi.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj hücreleri santrifüj ve süpernatantı çıkarın.
    5. Proses hücreleri (adım 5'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi) hemen veya sıvı nitrojende dondurulmuş ve daha sonra işlenmek üzere -80 °C'de saklanır.

5. Hücresel proteom

NOT: Analiz edilen hücre tipi için yeterli liziz optimize edilmelidir (yani, döngülerin ve genliklerin miktarı hücre pelet boyutuna ve prob sonicator modelinin güç yüzdesi bağlıdır).

  1. Enfekte makrofaj hücresi lizisi
    1. Taze çözünmüş proteaz inhibitörü kokteyl tabletten oluşan 100 mM Tris-HCl'nin (pH 8.5) 300 μL'sinde peletlenmiş hücreleri (adım 4.1.5) yeniden biriktirin.
      NOT: Deneye başlamadan önce 10 mL buz soğuğu 100 mM Tris-HCl'ye (pH 8.5) bir proteaz inhibitörü kokteyl tableti eklenir.
    2. Sonda, hücreleri yoklamak için 30 s açık ve 30 s kapalı 15 döngü boyunca bir buz banyosundaki hücreleri sonale eder.
    3. Santrifüj hücreleri 400 x g'da30 s için kısa bir süre , bir pelet oluşturmamaya dikkat edin, sadece tüplerin yanlarındaki sıvıyı çıkarmak ve ardından numunenin 2 mL Lo-bind mikrosantrifüj tüpüne aktarılması.
    4. %2'lik son konsantrasyona %20 SDS'nin 1:10 hacmini ekleyin.
    5. 10 mM'lik son konsantrasyona 1:100 hacimli 1 M dithiothreitol (DTT) ekleyin ve numuneyi pipetleme ile iyice karıştırın, ardından 800 rpm ajitasyonda 10 dakika boyunca 95 °C'de bir termal ısıtma bloğunda inkübasyon. Daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğutun (soğutma buz üzerinde yapılabilir).
    6. 55 mM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için 1:10 hacimli 0,55 M iodoasetamid (IAA) ekleyin ve pipetleme ile numuneyi iyice karıştırın. 20 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    7. %80 asetonluk son konsantrasyon elde etmek için %100 aseton ekleyin ve proteinleri çökeltmek için numuneyi gece boyunca -20°C'de saklayın.
  2. Protein sindirimi
    1. Ertesi gün, 10.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile çökeltme peletini toplayın. Süpernatant atın ve peleti% 80 aseton 500 μL ile yıkayın. Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Yıkamaları takiben oda sıcaklığında hava kuru pelet.
    2. Protein peletini 100 μL 8 M üre/40 mM HEPES'te yeniden çözün, bir buzlu su banyosunda 30 sn ve 30 s kapalı 15 döngü boyunca tam çözünürlük, girdap veya sonicate sağlamak için.
      NOT: Üre/HEPES hacminin ayarlanması çökmekte olan hücre peletinin boyutuna göre belirlenir, değişiklikler meydana gelirse tüm aşağı akış hacimleri uygun şekilde ayarlanmalıdır.
    3. Üreticinin talimatlarına göre protein testini (örneğin BCA protein tahlilini) kullanarak protein konsantrasyonu ölçün ve 8 M üre/40 mM HEPES ile boş normalleşme ile arka plan ölçümü için ayarlayın.
    4. Son 2 M üre konsantrasyonu elde etmek için 300 μL 50 mM amonyum bikarbonat ekleyin.
      NOT: Aşağı akış ölçümleri için protein konsantrasyonunun normalleştirilmesi fırsatı, 100 μg proteinin sindirilmesi ve kalan sindirilmemiş numunenin sıvı nitrojende flaş dondurma ile saklanması önerilir, daha sonra kısa süreli olarak -20 °C'de veya daha uzun süreli olarak -80 °C'de depolayın.
    5. Buz üzerine trypsin/Lys-C proteaz karışımının 2:50 (v/w) enzim-protein oranını ekleyin ve karıştırmak için tüpe hafifçe dokunun, oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10.000 x g'da 1:10 hacim durdurma çözeltisi (%20 asetonitril, %6 trifluoroasetik asit) ve santrifüj örnekleri ekleyerek sindirimi durdurun.
    7. Süpernatant toplayın(sindirilmiş peptitlerden oluşur)ve herhangi bir peletlenmiş döküntüğü veya çökeltiyi atın.
  3. Peptit tuzdan arındırma
    1. 2 dakika boyunca 100 μL%100 asetonitril ve santrifüj ekleyerek bir C18 Stop And Go Ekstraksiyonu (STAGE) ucunu (200 μL pipet ucunda 3 katman C18 reçineden oluşur) etkinleştirin.
    2. C18 STAGE ucunu 50 μL Tampon B (%80 (v/v) asetonitril, %0,5 (v/v) asetik asit) ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj ekleyerek dengelayın.
    3. C18 STAGE ucunu 200 μL Tampon A (%2 (v/v) asetonitril, %0,1 (v/v) trifluoroasetik asit, %0,5 (v/v) asetik asit) ve 3-5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj ekleyerek dengelayın.
    4. C18 STAGE ucuna ~50 μg sindirilmiş numune ekleyin ve 3-5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj veya numune spin sütunundan geçene kadar santrifüj ekleyin. Geri kalan sindirilmiş numuneyi sıvı nitrojende flaşla dondurun ve ihtiyaç duyulana kadar -20°C'de saklayın.
    5. C18 STAGE ucunu 200 μL Tampon A ve santrifüj ile 1.000 x g'da 3-5 dakika yıkayın.
    6. C18 STAGE ucuna 50 μL Tampon B ve 2 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ekleyin. 0,2 mL PCR tüplerinde eluted peptitleri toplayın.
    7. Eluted peptidleri vakumlu santrifüjde maksimum hızda 30-40 dakika kurutun. Tamamen kurutulmuş numuneler işlenene kadar oda sıcaklığında veya -20 °C'de saklanabilir.
      NOT: Kurutulmuş ve tuzdan arındırılmış peptitler, işlenmek üzere kütle spektrometresi tesislerine uygun numune gönderimleridir ve ortam sıcaklığında sevk edilebilir.

6. Kütle spektrometresi

  1. 10 μL Tampon A'da peptitleri yeniden inşa edin ve MS sütununa ~1,5 ila 3 μg peptit enjekte etmek için gerekli konsantrasyonu ölçün. Numune miktarı enstrümantasyona bağlı olacaktır.
  2. Önceden belirlenmiş bir asetonitrile gradyani kullanın (yaklaşık% 5-60) peptitleri yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayırmak için istenen bir süre boyunca (örneğin, 2 saat) % 0,5 asetik asitte, ardından kütle spektrometresine elektrospray iyonizasyonu.
  3. Veriye bağımlı toplama modunda(m/z 300 ila 1650) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanarak MS taramaları alın.
    NOT: Degrade yüzdesi ve uzunluğu deneme ve kullanıcı tarafından belirlenir. Hassas kütle spektrometresi ayarları enstrümantasyona, denemeye ve kullanıcı tercihine bağlıdır.

7. Veri analizi

NOT: MS verileri çok sayıda biyoinformatik işlem hattı ile işlenebilir. Bu protokolde, herkese açık MaxQuant ve Perseus platformlarını kullanarak işlemeyi açıklıyoruz, ancak bireysel kullanıcılara analiz, tercih ve kullanıma uygun biyoinformatik araçları değerlendirmelerini öneririz.

  1. MaxQuant yazılımını kullanarak işlenmemiş veri dosyalarını (doğrudan MS cihazından) yükleyin. Modifiye MaxQuant arama parametreleri altındaki proteinleri tanımlayın; %1'lik sahte bir keşif oranı için hedef yem yaklaşımı kullanarak protein tanımlaması için gerekli iki benzersiz peptit minimumu, çalıştırmalar arasında eşleştirme ile etiketsiz nicelik uygulayın, Andromeda arama motoru ile mevcut peptitleri tanımlamak ve ölçmek için UniProt veritabanından elde edilen FASTA dosyasını (örneğin, Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus)içeren organizmaları dahil edin. Ayrıntılı öğreticiler için herkese açık MaxQuant çevrimiçi araçlarına bakın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. MaxQuant çıktı dosyasını ('proteingroups.txt') Perseus'a yükleyin.
  3. Olası yanlış pozitifler ve kirleticiler içeren satırları filtreleyin ve yalnızca 'Kategorik sütuna dayalı satırları filtrele' ile site peptitleri tarafından değiştirilir.
  4. Veri değerlerini günlük2 ölçeğinde dönüştürün.
  5. Satırlara kategorik ek açıklama sağlayarak veri kümesi grupları oluşturun.
  6. Protein algılama için bir kesme tanımlamak için veri kümesini geçerli değerlere göre filtreleyin.
    NOT: Sıkı ve sağlam bir analiz için %50 tanımlama oranı önerilir. Örneğin, dört çoğaltma işlenmişse, en az üç geçerli değer sayısı seçilir.
  7. Tercih edilirse, normal dağılımdaki eksik değerleri değiştirerek verileri impute.
    NOT: Imputed değerleri normal dağılım temel alınarak optimize edilmiştir ve tipik bolluk ölçümlerini simüle etmek için 'NaN' yer tutucularının yerini almak için rastgele bir LFQ yoğunluğu sağlar. Bu imputation, ölçülebilir veriler gerektiren aşağı akış istatistiksel analizi için bir platform sağlar.
  8. Protein satırlarına ek açıklamalar ekleyin (örneğin protein adları, Gen Ontoloji terimleri).
    NOT: Oluşturulan bu Perseus iş akışı artık daha fazla biyoinformatik işleme, istatistiksel analiz ve veri görselleştirme için sağlam bir çerçevedir, ayrıntılı öğreticiler için herkese açık Perseus çevrimiçi araçlarına bakın (bkz. Malzeme Tablosu).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda özetlenen protokol, hem mantar patojeninden, hem C. neoformanlardanhem de konak makrofaj hücrelerinden elde edilen proteinlerin tek bir deneyde tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar. Ortak kültürü takiben, hücreler toplanır ve birlikte işlenir ve her türe özgü peptit profillerine göre biyoinformatik olarak ayrılır. Bu, enfeksiyon sırasında konak-patojen ilişkisinin etkileşimini tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Deneyden tanımlanan proteinlerin sayısı başlangıç malzemesine, numune hazırlamaya, gradyan uzunluğuna, MS enstrümantasyonuna ve biyoinformatik iş akışına bağlıdır. Burada açıklanan protokolü kullanarak, tipik olarak, 1.500 C. neoformans proteini ve 6.500 konak protein ile deneyden yaklaşık 8.000 protein tanımlarız. Veri kümelerinin işlenmesinden sonra, analizimizi yönlendiren kritik faktörleri gözlemlemek için bir Ana Bileşen Analizi (PCA) grafiği oluştururuz (Şekil 2A). Burada, deneysel tasarımdan (bileşen 1, %79,8) tahmin ettiğimiz gibi, veriler arasındaki en büyük ayırma bileşeninin enfekte olmayan örneklere karşı enfekte olduğunu ve örneklerin ikinci ayırt edici özelliğinin biyolojik değişkenlik (bileşen 2, %5,7) olduğunu gözlemliyoruz. Daha sonra, Öklid uzaklığı tarafından hiyerarşik kümeleme ile birleştirilmiş bir Pearson korelasyonu örnekleri gruplar ve çoğaltmalar arasındaki değişkenliğin ölçülmesini sağlar (Şekil 2B). Analizimizde, enfekte olmayan örneklere karşı farklı kümelenme ve çoğalmalar arasında iyi tekrarlanabilirliği temsil eden% 95-96 arasında değişen tekrarlanabilirlik gözlemledik. Son olarak, Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (FDR)(p-değer ≤ 0,05) kullanarak birden fazla hipotez testi için düzeltilmiş bir Öğrenci t-testi gerçekleştiriyoruz; FDR = 0,01; s0 = 1) enfekte olmayan kontrollere kıyasla enfeksiyon sırasında bol miktarda önemli farklılıklar olan proteinleri tanımlamak (Şekil 2C). Burada, 86'sında önemli bir azalma gösteren ve 31'i enfeksiyonda önemli bir artış gösteren 117 konak proteini de dahil olmak üzere bol miktarda önemli değişiklikler gösteren 760 proteini tanımlıyoruz. Özellikle, enfeksiyon sırasında beklendiği gibi mantar proteinlerinin bolluğunda da önemli artışlar gözlemliyoruz. Bu verilerle, verileri doğrulamak ve virülansa konak tepkisini destekleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için siliko karakterizasyonunda ağ haritalaması da dahil olmak üzere sonraki analizler ve takip deneyleri gerçekleştirilir.

Figure 1
Şekil 1: C. neoformansile enfekte makrofajların analizi için kütle spektrometresi tabanlı proteomik iş akışı . İş akışı, C. neoformans veya enfekte olmayan kontrollerle enfekte olmuş makrofajların toplanmasıyla başlar. Proteinler mekanik ve kimyasal bozulma ile çıkarılır, ardından azalma ve alkilasyon, aseton çökeltme ve enzymatic sindirim. Peptitler C18 STAGE uçlarında saflaştırılarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılır, elektrospray iyonizasyonuna tabi tutulur ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde ölçülür. Veriler, herkese açık biyoinformatik platformlarında, MaxQuant'ta (Andromeda ile) ve Perseus14 , 15,16'daişlenir,analiz edilir ve görselleştirilir. Biyolojik dörtlü olarak yapılan deneyler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Makrofaj hücrelerinin C. neoformans enfeksiyonu için temsili veriler. (A) Ana bileşen analizi, enfekte olmayan makrofaj (bileşen 1, %79,8) ve biyolojik çoğaltmaların kümelenmesi (bileşen 2, %5,7) arasındaki ayrımı gösterir. (B) Örneklerin kümelenmesi (enfekte olmayanlara karşı enfekte olmayan) ve tekrarlanabilirliği (%>95) göstermek için Öklid uzaklığına göre hiyerarşik kümeleme ile çizilen Pearson korelasyonunun ısı haritası. (C) Tanımlanan proteinlerin volkan arsası. Mavi = bol miktarda önemli bir değişime sahip mantar proteinleri; siyah = bol miktarda önemli bir değişime sahip makrofaj proteinleri. Öğrencinin t-testi (p-değer ≤ 0.05), FDR = 0.01; s0 = 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokoldeki kritik adımlar arasında makrofaj hücrelerinin hazırlanması ve hücrelerde minimum bozulma ile protein işleme için ortak kültür örneklerinin toplanması yer almaktadır. Toplamadan önce hücrelerin gereksiz lizizini önlemek için yapışkan makrofaj hücrelerini hafifçe ve dikkatlice yıkama, aşılama ve çıkarma adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Deney için doğru MOI'nin oluşturulması da kritik öneme sahiptir, çünkü aşırı yüksek bir MOI ile aşılamak hızlı makrofaj hücre ölümüne ve MS için numunelerin toplanmasında ve işlenmesinde zorluğuna neden olabilir. Bu tür sınırlamaların üstesinden gelmek için, konak yanıtı başlatan ancak toplamadan önce konak hücreleri öldürmeyen mantar hücrelerinin sayısını tanımlamak için hücre ölüm testleri (örneğin, LDH niceliği) tarafından desteklenen çeşitli MMI'lerle test deneyleri yapmanızı öneririz. Deneyler için, yüksek miktarda konak proteinleri arasında mantar proteinlerini yeterince tespit etmek için yüksek moi (100:1) gerektiren enfeksiyonla ilişkili mantar proteinlerini tanımlamayı hedefliyoruz. Tüm deneyi gerçekleştirmeden önce konak hücre ölümü üzerindeki MOI etkisini değerlendirmek için rutin olarak makrofaj sitotoksiklik tahlilleri gerçekleştiriyoruz. Mantar hücreleri büyük polisakkarit kapsüllerine sahip olabileceğinden ve bu nedenle makrofaj yutma için daha fazla zaman gerektirebileceğinden, C. neoformans hücrelerinin makrofajlarla inkübasyon zamanlaması da çok önemlidir. Bu zaman noktasında mantar proteomunun iyi bir kapsamını bulduğumuzdan ve konakçı yanıtının bir 'snap-shot'ını sağladığımız için, özetlenen deney için 3 saatlik bir ortak kültür inkübasyon süresi kullanmayı seçiyoruz; bununla birlikte, araştırmacılar daha önceki ve sonraki zaman noktalarını keşfetmek ve zamanlamanın mantar ve ev sahibi protein üretimini nasıl etkilediğini gözlemlemek isteyebilirler. Alternatif olarak, fagositik işleme yardımcı olmak için opsonizasyon için makrofaj astarlama17,18.

Numune toplanması için, numuneler hemen işlenmezse sıvı nitrojende flaş dondurma, numunelerde bulunan proteazlar tarafından proteinlerin istenmeyen bozulmasını önlemeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, MS tabanlı proteomik analizler için, deneylere başlamadan önce nitril eldivenler, laboratuvar önlükleri ve tüm yüzeylerin% 70 etanol ile yıkanması yoluyla toz veya keratin (örneğin cilt ve saç hücreleri) kontaminasyon potansiyeli sınırlanmalıdır. Ayrıca, yukarıda özetlenen protokoller açıklanan ortak kültür örnek kümesine özgüdür, ancak gerektiğinde protein ekstraksiyonu iş akışı optimizasyonu için değiştirilebilir19,20. İş akışını değiştirme ve belirli hücre tiplerini optimize etme fırsatları arasında seçilen mekanik ve kimyasal bozulma teknikleri, enzimamatik sindirim süresi ve sıcaklığı ve numunelerin ayrılması yer almaktadır. Örneğin, C. neoformans hücrelerinin lizisi tipik olarak mekanik boncuk çırpılması ile gerçekleştirilir; bununla birlikte, prob sonikasyonunu takiben proteom kapsamının arttığını gözlemledik ve bu nedenle, enfekte hücrelerin mekanik bozulması için önerin19,21,22. Örneğin, peptit örneklerinin yüksek pH fraksiyonasyonu veya boyut dışlama kromatografisi ile aliquots içine fraksiyone edilmesi, numune karmaşıklığını azaltabilir ve kütle spektrometresi9'dakikapsama derinliğini artırabilir. Ayrıca, yaklaşık 8.000 konak ve mantar proteinini tanımlamak için kapsama derinliğini elde etmek için yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi sistemi gereklidir (örneğin, QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).

Enfeksiyon sırasında protein seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için LFQ kullanımı MS tabanlı proteomik12için güvenilir ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır. Ek numune işleme adımlarına gerek kalmadan proteinlerin göreceli bollukla ölçülmesini sağlar. Buna ek olarak, analiz, deneyin tamamlanmasından sonra, evrensel uygulamalara ve esnek bir çalışma tasarımına ödünç vererek gerçekleştirilir. Bununla birlikte, LFQ sınırlamaları, numunelerin ardışık olarak çalıştırılması ve birleştirilememesi gerektiğinden, örnekler arasındaki karşılaştırılabilirlik zor olabileceğinden ve eksik değerleri değiştirmek için imputation ihtiyacı yüksek olabileceğinden artan enstrümantasyon süresini içerir23. Protein bolluğunu ölçmek için alternatif yaklaşımlar metabolik (örneğin, hücre kültüründe amino asitlerin kararlı izotop etiketlemesi) ve aletlerin cihaz süresini azaltmak için birleştirilmesine izin veren, numuneler arasında güvenilir karşılaştırılma sağlayan ve genellikle daha az eksik değerlere yol açan kimyasal (örneğin, tandem kütle etiketleri) etiketlemeteknikleridir 24,25. Bununla birlikte, bu tür yaklaşımlar ek numune işleme ve işleme adımları, artan ıslak laboratuvar deneyi karmaşıklığı ve zamanının yanı sıra sabit bir deneysel tasarım gerektirir. Önerilen deneyler için en uygun nicelik yöntemini seçmek için, kullanıcılar çalışma tasarımını ve örneklerin karşılaştırılmasını, ıslak laboratuvar karmaşıklığını ve veri analizini, ayrıca enstrümantasyon süresi kullanılabilirliğini ve maliyetini göz önünde bulundurmalıdır.

Sunulan protokolün yeniliği, proteomdaki değişiklikleri tek bir deneyde hem konak hem de patojen perspektiflerinden tanımlama yeteneğidir. Her iki proteomların kapsama derinliği, patojenin enfeksiyonu nasıl başlattığı ve konağın savunmada nasıl yanıt vereceği hakkında yeni bir fikir sağlar. Özellikle, yaklaşım tüm hücrenin enfeksiyonuna odaklanır; bununla birlikte, alt proteomları veya enfeksiyona bölümlere ayrılmış yanıtları tanımlama fırsatları, mekansal lokalizasyon teknikleri (örneğin, santrifüjleme, zenginleştirme, etiketleme)26,27ile kombinasyon yoluyla mevcuttur. Burada, makrofajlar ve mantar patojeni, C. neoformanlararasındaki etkileşimi detaylandırıyoruz; bununla birlikte, yaklaşım evrenseldir ve çeşitli biyolojik sistemler arasındaki etkileşimlere uygulanabilir. Örneğin, son zamanlarda benzer bir iş akışını, oküler keratit28 , 29,30'unbir murine modelinden türetilen nötrofillerin genel vesineözgü yanıtlarını ortaya çıkarmak için kullandık. Ayrıca, bu Protokolden oluşturulan enfektom veri kümeleri, konak hücrelerin varlığında değişmiş bolluğa sahip proteinleri tespit etmek için bir patojenin in vitro proteom ve secretome profillemi ile entegre edilebilir. Enfeksiyonla ilişkili proteinler olarak adlandırılan bu tür proteinler, zamansal düzenleme, lokalizasyon ve konakla doğrudan protein-protein etkileşimleri de dahil olmak üzere daha fazla karakterizasyon için bilinen ve yeni virülans faktörlerinin bolluğunu sağlar. Genel olarak, özetlenen MS tabanlı proteomik iş akışı, yaygın olarak bulunmayan evrensellik ve anlama ile tek bir deneyde konak ve patojen arasındaki karmaşık ilişkiyi araştırmak için yeni bir fırsat sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

Yazarlar, temsili deneyler için kütle spektrometresini çalıştırdıkları için Bioinformatics Solutions Inc.'den Dr. Jonathan Krieger'e ve deneysel kurulum ve el yazması geri bildirimlerine yardımcı olan Geddes-McAlister grubunun üyelerine teşekkür ediyor. Yazarlar, kısmen Banting Araştırma Vakfı'ndan - Jarislowsky Burs Keşif Ödülü' nden fon desteğini kabul ediyorlar, New Frontiers Araştırma Fonu – Keşif (NFRFE-2019-00425) ve J.G..M için Kanada İnovasyon Vakfı (JELF 38798) yanı sıra NSERC Kanada Lisansüstü Bursu – Yüksek Lisans ve Ontario Yüksek Lisans Bursu B.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
  2. Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
  4. Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
  5. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
  6. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
  7. Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
  8. Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
  9. Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
  10. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  11. Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
  12. Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  13. Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
  14. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  15. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  16. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
  17. Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
  18. Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
  19. Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
  20. Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
  21. Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
  22. Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
  23. Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
  24. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  25. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  26. Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
  27. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
  28. Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
  29. Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
  30. Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 164 Kütle spektrometresi bazlı proteomik etiketsiz niceleme konak-patojen etkileşimleri memeli hücre kültürü mantar patojeni Cryptococcus neoformans
Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ball, B., Sukumaran, A.,More

Ball, B., Sukumaran, A., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (164), e61881, doi:10.3791/61881 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter