Summary

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

Published: October 20, 2020
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Summary

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

파이어 브라트 Thermobia 국내는 지구상에서 성공적인 진화 방사선을 주도 곤충의 발달 메커니즘을 연구에 적합한 병형, 날개없는 종입니다. 게놈 편집과 같은 유전 공구의 응용은 Evo-Devo 접근에 있는 진화적인 전환에 책임 있는 유전 변경을 이해하는 열쇠입니다. 이 문서에서는 T. 국산균의 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위한 현재 프로토콜을 설명합니다. 우리는 우리가 주입된 태아에서 안정적으로 높은 생존율을 얻을 수 있도록 보고된 습식 주입 방법에 대한 대안으로, 건식 주입 방법을 보고합니다. 또한 성인을 짝짓기하고 고효율로 후속 세대를 얻기 위해 최적화된 환경 설정을 보고합니다. 우리의 방법은 비 전통적인 모형 유기체에 게놈 편집 방법의 성공적인 적용을 고려하여 각 종의 독특한 생물학을 취하는 의 중요성을 강조합니다. 우리는 이러한 게놈 편집 프로토콜이 실험실 모델로 T. 국내를 구현하고이 종에서 유용한 유전 도구의 개발 및 적용을 더욱 가속화하는 데 도움이 될 것으로 예측합니다.

Introduction

Thermobia 국내는 가장 기저 곤충 주문 중 하나에 속한다, Zygentoma, 이는 조상 과 날개없는 수명 주기를 유지. 이러한 기저 계통유전학적 위치와 조상특성은 이 종을 지구상의 곤충의 성공기막이되는 메커니즘을 연구하기 위한 매력적인 모델로 설정하여 기술된 동물종1의70% 이상을 커버한다. T. 국내는 상대적으로 짧은 수명 주기 (태아에서 생식 성인에 2.5-3.0 개월)와 같은 실험실 모델로적합한 기능 때문에 곤충 생리학의 조상 특성을 연구하기 위해 주로 사용되어 왔습니다. 그림 1A) 그리고 쉽게 번식. 지난 3년 동안 신체 계획, 신경 분화 및 circadian 리듬2,3,4와같은 다양한 특성의 조상 특성을 조사하기 위해 그 사용이 확장되었습니다.

T. 국내에서 고급 유전 도구의 응용 프로그램은 더 넓은 연구 분야에서 이러한 기여를 가속화 할 수 있습니다. 성공적인 RNA 간섭(RNAi)-매개 유전자 녹다운 배아, 님프, 및 성인은 T. 국도4,5,6에서보고되었다. 전신 RNAi의 효율은 여전히 매우 종 의존성-예를 들어, 그것은 일반적으로 epidoptera 순서7에서낮은 반면 콜옵테라에서 높다. T. 국내에서 RNAi 노크다운의 효율성과 기간은 아직 평가되지 않았습니다. RNAi 이외에, 우리는 이전에 T.국내8에서성공적인 CRISPR / Cas9 중재 유전자 녹아웃을보고했다. CRISPR/Cas 시스템은 특히 표적 유전자 녹아웃을 위해 곤충의 게놈 편집을 위해 널리 적용되었습니다. 그 사용은 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 핵9로전달하기 위한 프로토콜의 확립 후 외인성 구조를 노크함으로써 유전자 리포터 분석, 세포 계보 추적 및 전사 활동의 조작과 같은 다른 응용 분야에 대해 확장될 수 있다. 발표된 게놈어셈블리(10)와 결합하여, T. 국내에서 CRISPR/Cas 기반 게놈 편집의 폭넓은 사용 및 추가 개발은 곤충의 뛰어난 적응적 성공 뒤에 있는 진화 메커니즘에 초점을 맞춘 연구를 용이하게 할 것이다. 여기서, 우리는 CRISPR/Cas9를 사용하여 돌연변이 균주를 생성하기 위하여 배아 미세 주입및 짝짓기 성인 T. 국내를 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 새로운 방법을 고려하여, 우리는 이러한 기술의 성공적인 응용 프로그램에 대한 비 전통적인 모델 종의 독특한 생물학을 고려하는 중요성에 대해 논의.

Protocol

1. 실험실 식민지의 유지 보수 야생형 및 돌연변이 집단의 유지를 위해 일반 인공 어류 식품이 있는 대형 플라스틱 용기(460mm x 360mm x 170mm)를 사용하고, 상단에 환기 구멍이 있는 플라스틱 컵의 물, 곤충을 숨기기 위한 접힌 종이, 계란을 낳을 수 있는 겹겹이 있는면(그림 2A)을사용한다. 모든 T. 국산 배양을 37°C 인큐베이터 내부에 보관하고 각 용기 내부에 상대 ?…

Representative Results

우리 손에는, 약 100개의 계란이 적당한 팁(도 3C)이있을 때 단 하나 주입 모세관으로 잘 주입될 수 있습니다. gRNA/Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체를 주사하여 계란 을 낳은 후 첫 8시간 내에 배아에 있는 gRNA 표적 부위에 인델이 생성된다. 이것은 주입된 생성 (G0)의 몇몇 세포에 있는 쌍경변 돌연변이를 일으키는 원인이 되고 이렇게 돌연변이 모자이크 표현형은 일반적으로 G0에…

Discussion

CRISPR/Cas9를 사용하여 원하는 T. 국산 돌연변이의 성공적인 생성을 위해, 주사를 위해 충분한 수의 단계적 배아를 수집하는 것이 우선이다. T. 국산 계란의 충분한 수의 일정한 컬렉션의 경우, 핵심은 모든 성인 몰트(13)후에 반복되는 일련의 복잡한 짝짓기 동작의 성공적인 완료에 도움이 될 것이기 때문에 낮은 인구 밀도를 가지도록 용기의 적절한 크기를 선택하는 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

TO와 TD는 JSPS KAKENHI 교부금 번호 19H02970 및 20H02999에 의해 각각 지원되었다.

Materials

24-well plate Corning 83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg Integrated DNA Technologies 1081060
Anti-static cleaner Hozan Z-292 for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L AS ONE 4-5606-01 Large container
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000013 Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary Eppendorf 5242957000 Glass injection capillary
High Pack 2440mL AS ONE 5-068-25 Middle-sized container
Incubator Panasonic MIR-554-PJ for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo Toyobo KFX-101 PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand Narishige GJ-8 for holding the micromanipulator
Microloader Eppendorf 5242956003
Micromanipulator Narishige MM-3
Microscope Olympus SZX12 for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA Shimadzu MCE-202 Microchip electrophoresis system
NiceTac Nichiban NW-5 Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair) Pentel ZBS1-0
Plant culture dish SPL Life Sciences 310100 Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris Roche 3115836001
SZX 12 microscope Olympus SZX 12 More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder Maruishi 877113
Tetra Goldfish Gold Growth Spectrum Brands Artificial regular fish food

References

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Cite This Article
Ohde, T., Minemura, T., Hirose, E., Daimon, T. Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica. J. Vis. Exp. (164), e61885, doi:10.3791/61885 (2020).

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