Summary
시아노균 꽃과 관련 시아노톡신의 조기 발견을 위한 빠른 종합 전략은 여기에서 기술된다. 그것은 24 시간에서 물 샘플 및 바이밸브 샘플과 같은 유기 매트릭스에서 시아노박테리아 및 관련 시아노톡신의 검출을 허용합니다.
Abstract
청색균과 시아노톡신의 빠른 검출은 빠른 검출 전략(FDS)을 사용하여 달성된다. 물 샘플및 바이밸브 추출물과 같은 유기 매트릭스에서 시아노박테리아 및 관련 시아노톡신의 존재를 해명하기 위해서는 24시간만 필요합니다. FDS는 원격/근위 감지 기술과 분석/생물정보학 분석을 결합합니다. 샘플링 스팟은 원격 감지를 포함한 3차원 물리적 공간에서 다분야, 다중 규모 및 다중 파라메트릭 모니터링을 통해 선택됩니다. 시료의 현미경 관찰 및 분류학 분석은 시아노균 종의 식별을 허용하는 실험실 환경에서 수행됩니다. 샘플은 유기 용매로 추출하고 MS/MS에 의해 얻어진 LC-MS/MS. 데이터로 가공되어 온라인 플랫폼 글로벌 천연제품 사회(GNPS)를 사용하여 분자 네트워크를 생성하여 생물정보학적 접근법을 사용하여 분석된다. 이러한 네트워크는 질량 분석법에서 얻은 단편화 스펙트럼의 데이터를 GNPS 라이브러리와 비교하여 독소를 감지하고 식별하도록 분석됩니다. 이를 통해 동일한 분자 네트워크에서 나타나는 알려진 독소 및 알려지지 않은 유사체를 검출할 수 있습니다.
Introduction
시아노균 꽃은 지난 15년 동안 전 세계적으로 환경문제로 떠올랐다1,2. 시아노균 꽃은 시아노박테리아라는 미생물의 자라난 때문입니다. 그들은 열대 지역과 매우 차가운 물을 포함한 다양한 환경에서 살기 위해 적응한 광합성 미생물의 눈에 띄는 그룹입니다. 그들은 특히 영양분의 대규모 농축에 대응하여 수면을 덮고 큰 꽃을 생산하는 것으로 알려져 있습니다, 소위 부영양화 과정3.
따라서, 시아노박테리아는 수질오염4,5,6의우수한 생체지표이다. 그들은 또한 흥미로운 약리학적 특성7,8천연 화합물의 넓은 배열을 생성 할 수있습니다. 시아노박테리아와 관련된 환경 문제는 꽃 자체입니다. 꽃은 수중 잔디에 햇빛을 차단 물고기 사살로 이어지는 물에 산소를 소비, 표면 쓰레기와 냄새를 생성하고, 유기체의 필터 먹이를 방해 할 수있습니다 9.
또한, 더욱 심각하게, 온도, 영양소(인 및 질소), 햇빛(광합성용), 및 물의 pH와 같은 요인의 특정 조합에서, 시아노균 꽃은 독소 생산을 유발한다; 따라서, 그들은 인간과 동물에 해로운된다. 시아노톡신의 가장 연구된 클래스는 제네라 마이크로사이클시스에 의해 생성됩니다. 이들은 미세 세포신 (MC)의 일반적인 이름으로 알려진 순환 펩티드입니다 : 미세 세포신 -LR은 가장 심한 간독성을 생성 할 수있는 것으로 연구되고10. 동물과 인간은 오염된 식수 또는 음식을 섭취하여 MC에 노출될 수 있습니다. 세계보건기구(WHO)는 가이드라인11로총 미세포-LR 값 0.001 mg/L을 제안했다. 그러나, 이것은 지금까지 고립된 100개 이상의 미세 세포에서 하나의 변이체(즉, MC-LR)와만 관련이 있다.
MALDI-TOF MS 분석12,13,14,15와원격 감지와 같은 이전에 보고된 결합 방법은 MC의 농도 검출에 초점을 맞추고 있다. 가장 최근의 방법은 넓은 개화 창공만 감지하는 데 효과적인 저해상도 센서를 사용합니다. 또한 표준을 사용할 수 있는 독소만 공개할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 절차의 대부분은 시간이 많이 소요되며, 시간 방지 하거나 안전 문제를 최소화 하는 꽃의 조기 감지에 대 한 극적인 요인. 여기에서 제안된 다학제 전략은 단지 24 h16후에, 시아노박테리아 꽃및 시아노톡신의 급속한 검출을 제공합니다.
MuM3라는 프로그램의 프레임에서, "3차원 (3D) 물리적 공간에서 다분야, 다중 규모 및 다중 파라메트릭 모니터링"17,18,고속 검출 전략 (FDS)은 여러 기술의 장점을 결합 : 1) 원격 감지꽃; 2) 시아노박테리아 종을 검출하는 현미경 관찰; 및 3) 분석/생물정보학 분석, 즉 LC-HRMS 기반 분자 네트워킹을 분석하여 시아노톡신을 검출합니다. 결과는 24 시간 이내에 얻어진다.
새로운 접근 방식은 짧은 시간에 넓은 해안 지역을 모니터링하고 수많은 샘플링 및 분석을 피하고 탐지 시간과 비용을 줄이는 데 유용합니다. 이 전략은 시아노박테리아와 독소의 모니터링에 대한 다양한 접근법의 연구 및 적용의 결과이며 각 의 장점을 결합합니다. 구체적으로, 상이한 플랫폼(위성, 항공기, 드론) 및 센서(MODIS, 열적외선)의 사용으로부터 오는 결과의 분석은, 시아노균 종(현미경, UV-Vis 분광법, 16S 분석) 및 독소(LC-MS 분석, 분자 네트워크)의 식별을 위한 다양한 방법론적 접근법과 같은 원격 감지 분석을 위한 다양한 방법론적 접근법과 같은, 대부분의 용도에 대한 선택과 적절한 용도의 선택을 허용하였다. 새로운 방법론은 캄파니아 환경 보호 기관 모니터링 프로그램의 프레임에서 캄파니아 해안 (이탈리아)에 대한 후속 모니터링 캠페인에서 실험및 검증되었습니다.
그림 1: FDS 전략. 시아노박테리아및 시아노톡신을 위한 빠른 검출 전략의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
1. 원격 및 근위 감지: 데이터 수집 및 분석
참고: 이 경우 원격/근위 감지 데이터는 첫 번째 매크로 영역 조사에 사용되며 샘플링할 해안 지역의 특정 지점을 선택하는 데 사용됩니다. MuM3프레임워크(17) 체계에서 논리 흐름은 정보 계층이라는 여러 수준을 포함하는 계층 적 모니터링 모델을 기반으로 합니다. 각 레벨의 정보는 서로 다른 고도에 위치한 온보드 플랫폼을 수행하나 이상의 센서를 사용하여 획득한 데이터를 기반으로 합니다. 각 레벨은측정(19)의고도에 따라 공간 축척을 정의한다. 각 레벨에 여러 센서가 발생할 가능성이 있습니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다 : 위성, 항공기, 헬리콥터, UAV21 및 표면에 가시 근적외선 (VNIR) 및 열 적외선 (TIR) 이미징20; 물리적, 화학적, 생물학적 분석 등22. 표면과 이동식 실험실을 이용한 빠른 반응. 각 센서가 획득한 데이터는 다중 스펙트럼 지수(예: 정규화된 차이 식물 지수(NDVI), 정규화된 차이 수지수지수(NDWI), 엽록소색지수 등)을 계산하기 위해 처리및 결합되므로 원시 데이터는 보다 유용한 파라미터 및 형식(예: 주제 맵)으로 변환됩니다.
그림 2: 샘플링을 위한 원격/근위 감지 분석(1-2단계). 시아노균 꽃의 검출을 위한 다단계 및 다중 센서 접근법. 데이터 수집은위성(A),항공기(B),및/또는드론(C)에의해 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 원격 및 근근 감지 데이터 검색
- 콘텐츠 기반 검색 및 장면 분류를 위해 특별히 생성된 다양한 공용 및 비공개 원격 감지 데이터 집합에서 데이터를 검색합니다. 이 단계에서 사용되는 일반적인 데이터 세트 소스는 다음과 같습니다 : 미국 지질 조사23에서제공하는 Landsat 제품, NASA24에서제공하는 센티넬 -2,3 제품, 코페르니쿠스 오픈 액세스 허브25,MODIS-Aqua26.
- 특정 영역, 날짜 범위에 사용할 수 있는 제품을 식별하고 클라우드 커버에서 파생된 제한을 고려합니다. 정의: A) 그래픽 사용자 인터페이스 및 다각형 선택을 사용하여 관심 영역; B) 텍스트 쿼리 필터 필드를 사용하여 날짜 범위 및 클라우드 범위입니다.
참고: 많은 과학적 보고서에서 허용 가능한 클라우드 커버 값이 <20%라고 지적하더라도 이러한 유형의 연구에서는 수면에만 실제 구름 덮개에주의를 기울이는 것이 중요하므로 이 지역의 효과 가치는 <5%입니다. - 미션의 특정 요구에 가장 적합한 플랫폼에서 파생된 제품을 선택합니다. 위성 및 탑재하중 기술 사양의 각 조합에서, 제품의 여러 컬렉션을 얻을 수있다. 예를 들어 NASA EOSDIS24 데이터 제품은 레벨 0에서 레벨 4까지 다양한 수준에서 처리됩니다: 레벨 0 제품은 전체 계측기 해상도의 원시 데이터이며, 더 높은 수준에서 데이터는 더 유용한 매개 변수및 형식으로 변환됩니다. 일반적으로 레벨 0-1을 사용할 수 있으며, 레벨 2-4의 제품은 특정 연구 목표와 관련된 특정 처리가 필요하므로 가용성은 시간 제한이며 적용된 영역입니다.
- 위성 관측의 선택한 데이터 집합을 다운로드합니다. 자세한 내용은 이전 작업의 결과 목록 중 하나를 선택하거나 전체 데이터 집합 제품(예: 지오 티프 파일 그룹, 각 밴드에 대한 파일, 정보 및 기타 메타데이터) 또는 특정 단일 밴드만 다운로드합니다.
참고: 1단계 절차에 포함된 각 기본 작업에 대한 구체적인 설명은 2020년27일휴안천 등도 참조하시기 바랍니다.
- 분석 및 변환을 위한 데이터 사전 처리 및 처리가 보다 유용한 매개 변수 및 형식으로 전환되어 매크로 영역의 첫 번째 검사를 허용합니다.
참고: 다음 작업(1.2단계)은 낮은 수준에서 정보로 변환한 다음 유용한 정보(상위 수준)로 변환하기 위해 최종 된 데이터 처리에 전념합니다. 이 단계는 각 센서(예: 제품 레벨 0-1)의 원시 데이터를 처리하고 상위 수준 제품(예: 레벨 2-4)으로 변환하고, 그 후 정보 계층에서 보다 유용한 매개 변수 및 형식(예: 주제 맵)을 생성하는 것으로 구성됩니다.- 기하학적 및 방사선 보정을 포함하는 원시 데이터를 사전 처리합니다. 이 작업은 자동 또는 반자동 방식(감독되지 않거나 감독되지 않음)에서 래스터 처리를 위한 연결된 도구 세트를 제공하여 올바른 워크플로우를 존중하는 쉬운 분류를 수행하는 특정 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
참고 : 이 연구에서는 두 개의 무료 오픈 소스 도구가 사용됩니다 : Q-GIS 3.1428 반자동 분류 플러그인 (SCP)과 결합. SCP플러그인(29)은 원격 감지 이미지의 반자동 분류를 허용하여 무료 이미지 다운로드, 사전 처리, 후처리 및 래스터 계산을 위한 완벽한 도구 세트를 제공합니다. - 다중 스펙트럼 인덱스를 계산하는 보정된 데이터를 처리합니다. 일반적으로 이 작업은 래스터 계산기 도구를 사용하여 수행됩니다. 다중 스펙트럼 인덱스를 계산하면 GIS 플랫폼에서 관리할 수 있는 새 레이어가 생성되는 서로 다른 대역/레이어 간의 상관 관계를 정의합니다. 예를 들어, 센티넬 및 Landsat 운영 토지 이미저 센서(OLI)에서 시작하여 정규화된 차이 식물 지수(NDVI)와 같은 다중 스펙트럼 인덱스를 계산할 수 있습니다. 식물 지수는 엽록소 함량을 추정하는 데사용됩니다 30,31.
- 거짓 색상 주제맵에서 와 같이 표현되는 엽록소 함량 지수의 추정에서 얻은 결과를 분석하고 엽록소 농도가 높은 임계 영역을 정의합니다. 이 연구에서엽록소-a 맵은 테라 및 아쿠아 위성 플랫폼에 장착된 MODIS센서(32)의데이터 집합을 사용하여 생성됩니다. 샘플링 스팟은 비정상적인 값이 등록된 위치에 국한됩니다.
참고: 철아 농도가 20 mg/L33을초과하면 조류 꽃 깃발(각 특정 지점을 정의하는)은 원격 감지 영역에서 발생합니다.
- 기하학적 및 방사선 보정을 포함하는 원시 데이터를 사전 처리합니다. 이 작업은 자동 또는 반자동 방식(감독되지 않거나 감독되지 않음)에서 래스터 처리를 위한 연결된 도구 세트를 제공하여 올바른 워크플로우를 존중하는 쉬운 분류를 수행하는 특정 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
2. 가이드 샘플링
참고: 샘플링 스팟의 선택은 넓은 해안 지역에서 반점을 선택할 수 있는 원격/근위 감지 층 분석에 의해 구동됩니다. 미세 한 키스틴의 독성으로 인해 샘플링이 운영자에게 위험 할 수 있다는 점을 고려하여 안전 샘플링 절차가 필요합니다. 특히 에어로졸 흡입 및 피부 접촉으로부터 작업자를 보호해야 합니다. 그런 다음 아래에 자세히 설명된 절차에 따라 샘플링을 수행합니다.
- 눈 보호를 위해 고글, 에어로졸 흡입을 방지하기 위한 FFP2 마스크, 피부 접촉을 방지하기 위한 안전 장갑을 착용하십시오.
- 각 사이트에서 트리플리케이트로 0.5 L의 물을 수집합니다.
- 각 샘플의 타당성을 측정하여 리프라도미터를 사용합니다. 리프라토미터에 시료 한 방울을 넣고 천 당 부품의 관점에서 살리니값 (ppt - ∞)을 읽습니다.
- 샘플링의 끝에서, 먼저 손을 씻는다; 그런 다음 장갑, 마스크 및 고글을 제거하여 개인 보호 장비의 외부 표면을 만지지 않도록주의하십시오.
- 샘플을 실온에서 실험실로 운반합니다.
3. 미세한 관찰 및 분류학적 식별에 의한 시아노박테리아 종 식별
- 원심분리기 각 샘플(≈0.5L)은 11,200 x g에서 5분 동안.
- 다음과 같이 수퍼나츠를 추출: 각 시료에 부타놀 500mL를 붓고 깔때기를 사용하여, 분리 유입경로로 추출되는 혼합물을 전달한다. 두 레이어를 분리할 수 있도록 분리 깔때기를 링 클램프에 똑바로 세워 놓습니다. 수성 단계가 에를렌마이어 플라스크에서 배출하자. 이 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 유기 상을 진공 상태에서 농축하고 무게를 측정합니다.
- 3.1 단계에서 펠릿을 수집하고 현미경을 위한 18MP 디지털 카메라가 장착된 광학 현미경으로 400x 및 1,000배율로 분석합니다. 블루 그린 색상, 세포 모양 및 크기는 다른 미생물 중 시아노박테리아를 인식 할 수 있습니다 : 자신의 형태적 특징에 기초하여 시아노 박테리아의 존재를 찾습니다.
- 코마렉 등201434에 기술된 절차에 따라 현미경 관찰에 의한 분류학 분석을통해 종을 식별한다.
참고: 상보적인 16S 메타뇨 분석은 시아노균 세세서3을식별하기 위해 수행될 수 있다. - 염분에 따르면 10mL의 바닷물/담수 BG11 매체로 펠릿의 알리쿼트(aliquot)를 희석하여 재배를 위해 희석합니다.
4. 시아노톡신 의 식별
- 유기 용매를 사용하여 시료 추출
- 펠릿의 각 샘플을 플라스크에 넣고 얼음 목욕을 사용하여 5 분 동안 초음파 처리하십시오. 그런 다음 50mL의 신선한 MeOH를 넣고 부드럽게 흔들어 줍니다. 용지 필터를 사용하여 용액을 필터링하고 둥근 바닥 플라스크에서 여과물을 수집합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 이어서, 100% DCM(x2, 50mL)35를사용하여 MeOH/DCM의 50mL 혼합물을 2회(1:1, 50mL)로 첨가한 펠릿을 추출한다. 각 라운드 하단 플라스크를 "MeOH 추출물", "MeOH/DCM 추출물", "DCM 추출물"으로 각각 라벨을 지정하고 진공 상태에서 농축합니다.
- LC-HRMS/MS를 통해 각 유기 추출물(MeOH, MeOH/DCM, DCM)을 분석합니다.
- LC-HRMS/MS 분석
- LC-HRMS 및 LC-HRMS/MS 샘플 준비: MeOH ≥ 99.9%를 사용하여 각 샘플을 용해하여 최종 농도를 10 mg/mL로 얻습니다.
- HPLC 시스템(LC-HRMS/MS 시스템)과 결합된 고해상도 ESI 질량 분광계를 사용하여 각 샘플을 분석합니다. 실온에서 5μm C18 컬럼(100 x 2.10mm)으로 HPLC에서 작업합니다. H2O(HCOOH 0.1% 보충) 및 MeOHat 200 μL min-1로그라데이션 용출을 사용합니다. 그라데이션 프로그램은 3분 동안 10%, 30분 동안 10% ~ 100% MeOH, 7분 동안 100% MeOH를 제어로 사용합니다.
- 데이터 수집. 데이터 종속 획득 모드(DDA)에서 데이터를 수집: 전체 스캔 질량 스펙트럼의 10개의 가장 집중적인 이온은 고해상도 탠덤 질량 분석법(HRMS/MS) 분석을 받아야 합니다. CID 단편화, 격리 폭 2.0, 정규화된 충돌 에너지 35, 활성화 Q 0.250 및 활성화 시간 30ms를 사용하여 선택한 이온에 대한 HRMS/MS 스캔을 획득합니다.
- 생물 정보 분석 및 분자 네트워킹
- MS 특정 소프트웨어를 사용하여 각 강렬한 이온에 대한 조각화 패턴을 분석합니다.
- MS-Cluster를 사용하여 데이터를 클러스터로 수집합니다(1.0 Da및 MS/MS 단편 이온 허용 오차 0.5Da의 상위 질량 허용 오차). 2미만의 스펙트럼을 포함하는 합의 스펙트럼이 제거됩니다.
- 분자 네트워킹을 위해 GNPS(글로벌 천연 제품 소셜36)로MS/MS 데이터를 분석합니다.
- 합의 스펙트럼과 GNPS-질량-Ive 라이브러리에 보고된 것과 쌍별비교합니다.
- 획득된네트워크(37)를시각화한다.
참고: 분자 네트워킹의 경우 시그리스트 외 202038을참조하십시오.
그림 3: FDS 인랩 단계(3-4). 샘플링 후 실험실에서 수행되는 주요 활동의 시각적 표현(3단계 및 4단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
첫 번째 연구에서3,SW 이탈리아의 캄파니아 해안을 따라 4 개의 인위적으로 영향을 받은 사이트는 위성 Landsat 8 및 2015 년 여름 동안 항공기를 사용하여 관찰되었습니다. Landsat 8 운영 토지 이미저 센서 (OLI)와 항공기 다중 스펙트럼 카메라는 지역에 대한 정규화 된 차이 물 지수 (NDWI) 이미지를 생성 할 수 있도록, 따라서, 시아노 박테리아 지역 사회의 존재를 공개. 시아노균 지역 사회 조성물은 시아노균 색소 피코시아닌(PC)의 검출을 위한 분광측정 분석을 통해 결정되었다. 이어서, 상보적인 16S 메타뇨 분석이 시안균 과세를 식별할 수 있게 되었다. 메라지노믹 분석과 함께 위성/공중 플랫폼을 통한 단순화된 다중 스펙트럼 이미지 인덱싱 및 분류는 강한 부영양 조건(예: 렙톨립비아 스프,Pseudooscillatoria sp.) 와 관련된 제네라에 속하는 시아노박테리아의 존재를 검출하는 데 효과적이었다.
두 번째 연구에서14,FDS 접근은 봄 / 여름 동안 테스트되었다 2017. 위성 데이터는 유일한 원격 감지 수준으로 사용되었습니다. 자세히, 테라와 아쿠아 위성 플랫폼에 장착 된 MODerate 이미지 분광기미터 (MODIS) 센서에 의해 획득 된 데이터는 캄파니아 해안을 따라 수역에서 엽록소 (Chl-a)의 정량화를 허용하고 10 개의 샘플링 스팟을 선택했습니다. 샘플은 현미경 관찰 및 분류학적 식별에 의해 실험실에서 처리된 다음 유기 용매로 추출하였다. 유기 추출물은 LC-MS-MS 분석에 의해 처리되었습니다. MS-MS에 의해 얻은 데이터는 분자의 네트워크를 만들기 위하여 GNPS 플랫폼을 사용하여 생물정보학적 접근을 사용하여 분석되었습니다. 네트워크는 질량 분석법에서 얻은 단편화 스펙트럼의 데이터를 GNPS 라이브러리와 비교하는 독소를 감지하고 식별하도록 분석되었다. 이것은 동일한 분자 네트워크에서 관련있는 나타날 알려진 독소 및 알려지지 않은 유사체를 검출할 수 있었습니다. 구체적으로, Lyngbyatoxin A, 리포메이터성 피부색, 모든 물 샘플 및 바이밸브의 샘플에서 검출되었다; Lyngbyatoxin A 분자 클러스터에서, lyngbyatoxins 가족의 어떤 알려진된 화합물과 관련되지 않은 노드도 존재했다, 알 수없는 lyngbyatoxin 유사체의 존재를 제안. 샘플에서는 미세 포스틴 및 기타 독소가 발견되지 않았습니다. 모든 결과는 24 시간 이내에 얻어졌다.
그림 4: FDS 대표 결과. 캄파니아 해안 (이탈리아)에 FDS 전략의 응용 프로그램의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
지난 몇 년 동안, 우리 팀은 수체와 바이밸브에서 시아노박테리아와 시아노톡신의 존재를 해명할 수 있는 몇 가지 다른 접근법을 테스트하고 검증했습니다. 새로운 개발 된 전략은 이러한 연구의 결과를 나타냅니다. 빠른 감지 범위에 맞는 최적의 기술과 기술은 각 단일 단계의 효과를 극대화하는 고유한 절차의 모자 아래에 수집됩니다. 대상 영역, 꽃 확장 및 성장 단계는 사용하기에 적합한 방법과 기술의 선택에 원동력입니다.
시아노박테리아와 시아노톡신이 빠른 검출을 우선순위인 경우, 전략은 총 수를 4단계로 줄이게 한다: (1) 첫 번째 조사를 위한 원격 및 동체 감지 및 데이터 분석, 사이트의 국소화 및 꽃 패턴 및 확장의 정의; (2) 가이드 샘플링; (3) 현미경 관찰 및 분류학 분석; (4) 물 시료의 복제 및 시아노톡신의 빠른 검출을 위한 LC-MS 데이터의 화학 분석 및 분자 네트워킹.
첫 번째 단계에서는 계층 적 모니터링 접근 방식의 모든 계층을 포괄하는 전체 플랫폼 체인에 의해 획득 된 데이터의 가용성이 분석 된 시나리오의 완전한 비전을 회복시키는 가장 좋은 솔루션이 되더라도 종종 하나의 정보 계층만이 지역 조사 작업을 유도하고 현장에서 샘플링 작업을 수행하기 위해 핫 스팟에 효과적으로 집중할 수 있습니다. 위성, 항공기, 헬리콥터, UAV를 사용하여 데이터를 획득한 보고된 경험에 따르면 빠른 탐지 전략에 필요한 요구와 완전히 일치하는 솔루션은 유일한 위성 제품을 사용하는 것입니다.
또한 위성(예: 항공기, 헬리콥터, UAV)보다 낮은 고도에서 비행하는 플랫폼에 의해 수행되는 임무에서 파생되는 정보 계층은 뛰어난 해상도로 정보를 제공합니다.
시료가 선택되면(2단계), 분석/생물정보학 분석(LC-MS 데이터의 분자 네트워킹)은 물 시료의 신속한 복제 및 원색소(3단계 및 4단계)의 신속한 검출을 위한 도구이다. 16S 메타게놈 분석은 적어도 2주의 작업이 소요됩니다. 더욱이, 일반적으로 유독한 시아노균 종이 확인되더라도, 그들의 독소 생성은 입증되지 않습니다. 같은 이유로, 현미경 관찰 자체는 독성 시아노 박테리아의 존재를 밝히기에 충분하지 않습니다. 물론 MS 분석 및 분자 네트워킹에는 몇 가지 제한이 있습니다. 그들은 관심의 화합물 경우 매우 효과적이다 (예를 들어, 독소) 그들은 검출 될 충분한 양에있는 경우, 적용 된 조건에서 잘 이온화되는 경우. 알려진 시아노균 독소 검출 및 모니터링을 위해 MS 기반 분자 네트워킹은 실제로 보다 견고하고 신뢰할 수 있는 기술 중 하나를 나타냅니다.
따라서, 이 접근법은 시아노박테리아및 관련 시아노톡신의 빠른 검출이 필요할 때 매우 유용하다는 것을 증명합니다; 또한 시아노균꽃과 독소의 정량화는 또한 큰 시아노균 독성 꽃에 의해 발생할 수 있는 건강 지역 사회의 문제를 방지하기 위하여 이 전략에 의해 가능합니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 프로젝트의 프레임에서 "라 시큐어자 사니타리아 델 페스카토 (CRiSSaP)당 센트로 디 리페리멘토 지역"에 의해 투자되었다 "Attività pilota 디 Monitoraggio 디 Cianobatteri 넬라 fascia costiera 델라 지역 캄파니아", 이탈리아 캄파니아 지역 환경 보호국(ARPAC)과 협력하여 수행, "이스티투토 Zooprofilattico Sperimentale 델 메조조르노 / Osservatorio 지역 라 시큐어자 알리멘타레당 "(IZSM/ORSA), 나폴리 대학 "페데리코 II" - 수의학 및 동물 생산 학과, 아피오)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Vitamin mix | Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL | ||
| 1-BuOH | Sigma-Aldrich | 33065.2.5L-R | |
| BG11 stock solution | Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL | ||
| Centrifuge | Hermle | Z36HK | |
| CHCl3 | Honeywell | 32211.2.5L | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 34877.2.5L | |
| Kinetex C18 cloumn | Phenomenex | ||
| LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system | Thermo | ||
| MeOH | Honeywell | 32213.2.5L | |
| Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera | Optech | Biostar B3 | |
| Multiband camera | Intergraph DMC | ||
| Nitsch's Solution | H3BO3 0.5 g/L MnSO4· H2O 2.28 g/L ZnSO4·7H2O 0.5 g/L CuSO4·5H2O 0.025 g/L COCl2·6H2O 0.135 g/L Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L |
||
| Refractomer mr 100 ATC | AQL | ||
| SWBG11 medium | BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L |
References
- Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
- Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
- O'Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
- Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
- Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
- Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
- Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
- Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
- Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
- Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
- WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
- Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
- Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
- Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
- Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
- Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
- Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
- Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
- Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , 8286 LNCS (PART 2) (2013).
- Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), Switzerland. (2017).
- Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
- Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
- U.S. Geological Survey. , Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020).
- NASA Earthdata. , Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020).
- Copernicus Opern Access Hub. , Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020).
- MODerate Image Spectroradiometer (MODIS) Aqua. , Available from: podaac-tools.jpl.nasa.gov (2020).
- Chen, H. -H., Tang, R., Zhang, H. -R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
- QGIS. , Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020).
- Congedo, L. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1. , Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016).
- Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
- Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
- Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
- Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
- Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
- Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
- UCSD Commputational Mass Spectrometer Website. , Available from: http://gnps.ucsd.edu/ (2020).
- Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
