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Chemistry

Détection précoce des proliférations de cyanobactéries et des cyanotoxines associées à l’aide d’une stratégie de détection rapide

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/61889
Automatic Translation
1, 1, 2, *3, *1
1TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy, University of Naples Federico II, 2Department of Public Health, University of Naples Federico II, 3Department of Engineering, University Parthenope
* These authors contributed equally

Summary

Une stratégie rapide-multidisciplinaire pour la détection précoce des proliférations de cyanobactéries et des cyanotoxines associées est décrite ici. Il permet la détection de cyanobactéries et de cyanotoxines apparentées dans des échantillons d’eau et dans des matrices organiques, telles que des échantillons de bivalves, en 24 h.

Abstract

La détection rapide des cyanobactéries et des cyanotoxines est réalisée à l’aide d’une stratégie de détection rapide (FDS). Seulement 24 h sont nécessaires pour démêler la présence de cyanobactéries et de cyanotoxines apparentées dans des échantillons d’eau et dans une matrice organique, comme des extraits de bivalves. FDS combine des techniques de télédétection/proximale avec des analyses analytiques/bioinformatiques. Les points d’échantillonnage sont choisis au moyen d’une surveillance multidisciplinaire, multi-échelles et multi-paramétrique dans un espace physique tridimensionnel, y compris la télédétection. L’observation microscopique et l’analyse taxonomique des échantillons sont effectuées en laboratoire, ce qui permet d’identifier les espèces de cyanobactéries. Les échantillons sont ensuite extraits avec des solvants organiques et traités avec de la LC-MS/MS. Les données obtenues par MS/MS sont analysées à l’aide d’une approche bioinformatique à l’aide de la plateforme en ligne Global Natural Products Social (GNPS) pour créer un réseau de molécules. Ces réseaux sont analysés pour détecter et identifier les toxines, en comparant les données des spectres de fragmentation obtenus par spectrométrie de masse avec la bibliothèque GNPS. Cela permet de détecter des toxines connues et des analogues inconnus qui semblent liés dans le même réseau moléculaire.

Introduction

Les proliférations de cyanobactéries sont apparues comme un problème environnemental dans le monde entier au cours des 15 dernières années1,2. Les proliférations de cyanobactéries sont dues à la prolifération de micro-organismes nommés cyanobactéries. Il s’agit d’un groupe remarquable de micro-organismes photosynthétiques qui se sont adaptés pour vivre dans un large éventail d’environnements, y compris les zones tropicales et les eaux extrêmement froides. Ils sont connus pour produire de grandes fleurs couvrant les surfaces de l’eau, en particulier en réponse à un enrichissement massif en nutriments, le processus dit d’eutrophisation3.

Par conséquent, les cyanobactéries sont d’excellents bioindicateurs de la pollution de l’eau4,5,6. Ils peuvent également produire un large éventail de composés naturels aux propriétés pharmacologiques intéressantes7,8. Le problème environnemental lié aux cyanobactéries sont les fleurs elles-mêmes. Les fleurs d’eau peuvent bloquer la lumière du soleil sur les herbes sous-marines, consommer de l’oxygène dans l’eau, ce qui entraîne la mort des poissons, produire de l’écume de surface et des odeurs, et interférer avec l’alimentation filtrante des organismes9.

En outre, et encore plus sérieusement, dans une combinaison spécifique de facteurs tels que la température, les nutriments (phosphore et azote), la lumière du soleil (pour la photosynthèse) et le pH de l’eau, les proliférations de cyanobactéries déclenchent la production de toxines; par conséquent, ils deviennent nocifs pour les humains et les animaux. La classe de cyanotoxines la plus étudiée est produite par les genres Microcystis. Ce sont des peptides cycliques connus sous le nom général de microcystines (MC) : la microcystine-LR étant la plus étudiée comme pouvant produire une hépatotoxicité sévère10. Les animaux et les humains peuvent être exposés aux MC par ingestion d’eau potable ou d’aliments contaminés. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a suggéré une valeur totale de microcystine-LR de 0,001 mg/L comme ligne directrice11. Cependant, ceci est lié seulement à une variante (c.-à-d., MC-LR) sur plus de 100 microcystins qui ont été isolés jusqu’ici.

Les méthodes combinées précédemment rapportées, telles que la télédétection avec l’analyse MALDI-TOF MS12,13,14,15,se sont concentrées sur la détection de concentration des MC. Les méthodes les plus récentes utilisent des capteurs à basse résolution qui ne détectent efficacement que les larges étendues de floraison; ils sont également capables de ne révéler que des toxines pour lesquelles des normes sont disponibles. De plus, la plupart de ces procédures prennent beaucoup de temps, et le temps est un facteur important pour la détection précoce de la prolifération afin de prévenir ou de minimiser les problèmes de sécurité. La stratégie multidisciplinaire proposée ici permet une détection rapide de la prolifération de cyanobactéries et des cyanotoxines, après seulement 24 h16.

Dans le cadre du programme appelé MuM3, « Surveillance multidisciplinaire, multi-échelle et multi-paramétrique dans l’espace physique tridimensionnel (3D) »17,18,une stratégie de détection rapide (FDS) combine les avantages de plusieurs techniques: 1) la télédétection pour détecter la prolifération; 2) observation microscopique pour détecter les espèces de cyanobactéries; et 3) les analyses analytiques et bioinformatiques, à savoir la mise en réseau moléculaire basée sur le SGRH-LC, pour détecter les cyanotoxines. Les résultats sont obtenus dans les 24 h.

La nouvelle approche est utile pour surveiller les vastes zones côtières en peu de temps, en évitant de nombreux échantillonnages et analyses et en réduisant le temps et les coûts de détection. Cette stratégie est le résultat de l’étude et de l’application de différentes approches de surveillance des cyanobactéries et de leurs toxines et combine les avantages de chacune d’entre elles. Plus précisément, l’analyse des résultats, provenant de l’utilisation de différentes plateformes (satellite, aéronefs, drones) et capteurs (MODIS, infrarouge thermique) pour l’analyse de télédétection, telles que diverses approches méthodologiques pour l’identification d’espèces de cyanobactéries (microscope, spectroscopie UV-Vis, analyse 16S) et de toxines (analyse LC-MS, mise en réseau moléculaire), a permis de choisir la méthode la plus appropriée à la fois pour les fins spécifiques et générales. La nouvelle méthodologie a été expérimentée et validée dans des campagnes de surveillance ultérieures sur les côtes de Campanie (Italie), dans le cadre du programme de surveillance de l’agence de protection de l’environnement de Campanie.

Figure 1
Figure 1: Stratégie FDS. Un aperçu de la stratégie de détection rapide des cyanobactéries et des cyanotoxines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

1. Télédétection et télédétection proximale : acquisition et analyse de données

NOTA : Dans ce cas, les données de télédétection/proximale sont utilisées pour une première enquête macro-zone et pour sélectionner des endroits spécifiques des zones côtières à échantillonner. Dans le schéma MuM3 framework17, le flux logique est basé sur un modèle de surveillance hiérarchique qui inclut plusieurs niveaux nommés couches d’informations. Les informations de chaque niveau sont basées sur des données acquises à l’aide d’un ou plusieurs capteurs embarqués sur des plateformes situées à différentes altitudes. Chaque niveau définit une échelle spatiale en fonction de l’altitude de la mesure19. Il est possible que plusieurs capteurs se trouvent à chaque niveau. En voici quelques exemples : imagerie visible dans le proche infrarouge (VNIR) et infrarouge thermique (TIR)20 sur les satellites, les aéronefs, les hélicoptères, les UAV21 et à la surface; analyses physiques, chimiques et biologiques, etc.22 à la surface et en réponse rapide à l’aide du laboratoire mobile. Les données acquises par chaque capteur sont traitées et combinées pour calculer des indices multispectraux (p. ex., indice de végétation par différence normalisée (NDVI), indice d’eau par différence normalisée (NDWI), indice de chlorophylle, etc.), de sorte que les données brutes sont converties en paramètres et formats plus utiles (p. ex., carte thématique).

Figure 2
Figure 2: Analyses par télédétection/proximale pour l’échantillonnage (étapes 1 à 2). Approche multi-niveaux et multi-capteurs pour la détection de la prolifération de cyanobactéries. L’acquisition de données est effectuée par satellite(A),avion(B)et/ou drone(C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Extraction de données de télédétection et de détection proximale
    1. Extraire des données des différents ensembles de données de télédétection publics et privés, produits spécialement pour la récupération basée sur le contenu et la classification des scènes. Les sources d’ensembles de données typiques utilisées dans cette étape comprennent: les produits Landsat fournis par le U.S. Geological Survey23,les produits Sentinel-2,3 fournis par la NASA24et Copernicus Open Access Hub25,MODIS-Aqua26.
    2. Identifiez les produits disponibles pour la zone spécifique, la plage de dates et tenez compte de la limite dérivée par la couverture nuageuse. Définir : A) la région d’intérêt à l’aide de l’interface utilisateur graphique et de la sélection de polygones; B) la plage de dates et la couverture cloud à l’aide des champs de filtre de requête de texte.
      REMARQUE: Même si de nombreux rapports scientifiques citent qu’une valeur de couverture nuageuse acceptable est de <20%, dans ce type de recherche, il est important de prêter attention à la couverture nuageuse réelle uniquement à la surface de l’eau, de sorte qu’une valeur d’efficacité pour cette région est <5%.
    3. Choisissez les produits dérivés des plateformes les mieux adaptées aux besoins spécifiques de la mission. À partir de chaque combinaison de spécifications techniques de satellite et de charge utile, il est possible d’obtenir plusieurs collections de produits. Par exemple, les produits de données EOSDIS24 de la NASA sont traités à différents niveaux allant du niveau 0 au niveau 4: les produits de niveau 0 sont des données brutes à pleine résolution d’instrument tandis qu’à des niveaux supérieurs, les données sont converties en paramètres et formats plus utiles. Habituellement, les niveaux 0 à 1 sont disponibles, tandis que les produits des niveaux 2 à 4 nécessitent un traitement spécifique lié à des objectifs de recherche spécifiques, de sorte que leur disponibilité est limitée dans le temps et la région couverte.
    4. Téléchargez l’ensemble de données choisi pour les observations par satellite. En détail, en sélectionnant dans la liste des résultats de l’action précédente, téléchargez un produit de jeu de données complet (par exemple, un groupe de fichiers geo-tiff, un pour chaque canal, plus des informations et d’autres métadonnées) ou seulement un canal unique spécifique.
      REMARQUE: Pour la description spécifique de chaque action de base incluse dans la procédure de l’étape 1, veuillez également vous référer à Huan-Huan Chen et al. 202027.
  2. Prétraitement et traitement des données pour l’analyse et la transformation en paramètres et formats plus utiles pour permettre un premier examen de la macro-zone.
    REMARQUE : Les actions suivantes (étape 1.2) sont dédiées au traitement des données finalisé pour transformer les données brutes provenant des niveaux inférieurs en informations, puis en informations utiles (niveaux supérieurs). Cette étape consiste à traiter les données brutes de chaque capteur (p. ex., les niveaux de produit 0 à 1) et à les transformer en produits de niveau supérieur (p. ex., niveaux 2 à 4) et, par la suite, en couches d’information pour générer des paramètres et des formats plus utiles (p. ex., carte thématique).
    1. Prétrage des données brutes impliquant un étalonnage géométrique et radiométrique. Cette action peut être effectuée à l’aide d’un logiciel spécifique qui, de manière automatique ou semi-automatique (non supervisée ou supervisée), fournit un ensemble d’outils connectés pour le traitement raster afin d’effectuer une classification facile respectant un flux de travail correct.
      REMARQUE: Dans cette recherche, deux outils open source gratuits sont utilisés: Q-GIS 3.1428 combiné avec semi-automatique Classification Plugin (SCP). Le plugin SCP29 permet la classification semi-automatique des images de télédétection, fournissant un ensemble complet d’outils pour le téléchargement d’images gratuites, le prétraitement, le post-traitement et le calcul raster.
    2. Traiter les données calibrées en calculant des index multispectraux. En règle générale, cette action est effectuée à l’aide d’un outil de calcul raster. Le calcul d’un index multispectral définit une corrélation entre différents canaux/couches qui, par conséquent, génère une nouvelle couche qui pourrait être gérée sur une plate-forme SIG. Par exemple, à partir du capteur d’imageur terrestre opérationnel (OLI) Sentinel et Landsat, il est possible de calculer des indices multispectraux tels que l’indice de végétation par différence normalisée (NDVI). L’indice de végétation est ensuite utilisé pour estimer la teneur en chlorophylle30,31.
    3. Analyser les résultats obtenus à partir de l’estimation de l’indice de teneur en chlorophylle représenté comme dans les cartes thématiques en fausses couleurs et définir la zone critique avec une concentration élevée de chlorophylle. Dans cette étude, la carte de chlorophylle-a est générée à l’aide de l’ensemble de données du capteur MODIS32, monté sur les plates-formes satellites Terra et Aqua. Les points d’échantillonnage sont localisés là où des valeurs anormales sont enregistrées.
      NOTA : Le drapeau de prolifération d’algues (qui définit chaque point spécifique) est relevé dans le domaine de la télédétection lorsque la concentration de Chl-a dépasse 20 mg/L33.

2. Échantillonnages guidés

REMARQUE: Le choix des points d’échantillonnage est déterminé par l’analyse de la couche de télédétection /proximale qui permet de sélectionner des points dans les grandes zones côtières. Compte tenu du fait que l’échantillonnage pourrait être dangereux pour les opérateurs en raison de la toxicité des microcystines, des procédures d’échantillonnage de sécurité sont nécessaires. En particulier, il est nécessaire de protéger les opérateurs contre l’inhalation d’aérosols et le contact avec la peau. Ensuite, effectuez un échantillonnage en suivant la procédure détaillée ci-dessous.

  1. Portez des lunettes de protection pour les yeux, un masque FFP2 pour prévenir l’inhalation d’aérosols et des gants de sécurité pour prévenir les contacts avec la peau.
  2. Recueillir 0,5 L d’eau en triple exemplaire dans chaque site.
  3. Mesurer la salinité de chaque échantillon à l’aide d’un réfractomètre. Mettez une goutte de l’échantillon sur le réfractomètre et lisez la valeur de salinité en termes de parties par millier (ppt - ‰).
  4. À la fin de l’échantillonnage, lavez-vous d’abord les mains; retirez ensuite les gants, le masque et les lunettes de protection en prenant soin de ne pas toucher la surface externe de l’équipement de protection individuelle.
  5. Transporter l’échantillon au laboratoire à température ambiante.

3. Identification des espèces de cyanobactéries par des observations microscopiques et identification taxonomique

  1. Centrifuger chaque échantillon (≈0,5 L) à 11 200 x g pendant 5 min.
  2. Extraire les surnageants comme suit: verser 500 mL de butanol dans chaque échantillon et à l’aide d’un entonnoir, transférer le mélange à extraire dans l’entonnoir séparateur. Placez l’entonnoir séparateur à la verticale dans la pince annulaire pour permettre aux deux couches de se séparer. Laisser la phase aqueuse s’écouler dans une fiole d’Erlenmeyer. Répétez cette étape trois fois. Ensuite, concentrez les phases organiques sous vide et pesez-les.
  3. Recueillir des pastilles de l’étape 3.1 et les analyser à grossissement 400x et 1 000x avec un microscope optique équipé d’un appareil photo numérique de 18 MP pour microscope. Recherchez la présence de cyanobactéries sur la base de leurs caractéristiques morphologiques: la couleur bleu-vert, la forme des cellules et la taille permettent de reconnaître les cyanobactéries parmi d’autres micro-organismes.
  4. Identifier l’espèce par analyse taxonomique par observation microscopique, selon la procédure décrite dans Komarék et al. 201434.
    REMARQUE : Une analyse métagénomique complémentaire 16S peut être effectuée afin d’identifier les taxons cyanobactériens3.
  5. Diluer une partie aliquote des granulés avec 10 mL de milieux BG11 d’eau de mer et d’eau douce, selon sa salinité, pour la culture.

4. Identification des cyanotoxines

  1. Extraction d’échantillons avec des solvants organiques
    1. Mettre chaque échantillon de pastilles dans une fiole et du sonique pendant 5 min à l’aide d’un bain de glace. Ensuite, ajoutez 50 mL de MeOH frais et secouez doucement. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre en papier et recueillir le filtrat dans une fiole inférieure ronde. Répétez cette étape deux fois. Ensuite, extrayez les pastilles en ajoutant 50 mL de mélange de MeOH/DCM deux fois (1:1, 50 mL), et deux fois en utilisant 100% de DCM (x2, 50 mL)35. Étiqueter chaque fiole de fond ronde, respectivement, comme « extrait de MeOH », « extrait de MeOH/DCM » et « extrait de DCM », et concentrer sous vide.
    2. Analyser chaque extrait organique (MeOH, MeOH/DCM, DCM) par LC-HRMS/MS.
  2. Analyse LC-HRMS/MS
    1. Préparation des échantillons LC-HRMS et LC-HRMS/MS : dissoudre chaque échantillon à l’aide de MeOH ≥ 99,9 % pour obtenir une concentration finale de 10 mg/mL.
    2. Analyser chaque échantillon à l’aide d’un spectromètre de masse ESI haute résolution couplé à un système HPLC (système LC-HRMS/MS). Travailler sur la CLHP avec une colonne C18 de 5 μm (100 x 2,10 mm), à température ambiante. Utilisez une élution de gradient avecH2O(complété par 0,1% HCOOH) et MeOHat 200 μL min-1. Le programme de gradient est le suit : 10 % MeOH pendant 3 min, 10 % à 100 % MeOH pendant 30 min, 100 % MeOH pendant 7 min. Utilisez MeOH comme témoin.
    3. Acquisition de données. Recueillir des données en mode d’acquisition dépendant des données (DDA) : les 10 ions les plus intensifs d’un spectre de masse à balayage complet doivent être soumis à une analyse par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (SGRH/SMRH). Acquérir des balayages HRMS/MS pour des ions sélectionnés avec fragmentation CID, une largeur d’isolement de 2,0, une énergie de collision normalisée de 35, une activation Q de 0,250 et un temps d’activation de 30 ms.
  3. Analyses bioinformatiques et mise en réseau moléculaire
    1. Analyser les modèles de fragmentation pour chaque ion intense à l’aide d’un logiciel spécifique à la SP.
    2. Utilisez MS-Cluster pour regrouper les données (tolérance de masse parente de 1,0 Da et tolérance aux ions de fragment MS/MS de 0,5 Da). Les spectres de consensus contenant moins de 2 spectres sont éliminés.
    3. Analyser les données MS/MS par GNPS (Global Natural Products Social36)pour la mise en réseau moléculaire.
    4. Comparez par paires les spectres de consensus et aussi avec ceux rapportés dans les bibliothèques GNPS-Mass-Ive.
    5. Visualiser le réseau obtenu37.
      REMARQUE: Pour la mise en réseau moléculaire, veuillez vous référer à Sigrist et al. 202038.

Figure 3
Figure 3: Étapes en laboratoire de la FDS (3-4). Représentation visuelle des principales activités réalisées en laboratoire après échantillonnage (étapes 3 et 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Representative Results

Dans une première étude3, quatre sites impactés par l’homme le long de la côte de campanie dans le sud-ouest de l’Italie ont été observés à l’aide du satellite Landsat 8 et d’aéronefs au cours de l’été 2015. Le capteur d’imageur terrestre opérationnel Landsat 8 (OLI) et la caméra multispectrale de l’avion ont permis de créer des images de l’indice d’eau par différence normalisée (NDWI) pour les zones, ainsi, pour révéler la présence de communautés de cyanobactéries. La composition de communauté de cyanobactérie a été déterminée par des analyses spectrophotométriques pour la détection de la phycocyanine de colorant cyanobactérien (PC). Ensuite, l’analyse métagénomique complémentaire 16S a permis d’identifier les taxons cyanobactériens. L’indexation et la classification simplifiées des images multispectrales par le biais de plates-formes satellitaires/aériennes, combinées à des analyses métagénomiques, ont été efficaces pour détecter la présence de cyanobactéries appartenant à des genres associés à de fortes conditions eutrophes (telles que Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), à un stade précoce de la floraison.

Dans une deuxième étude14, l’approche FDS a été testée au printemps /été 2017. Les données satellitaires ont été utilisées comme seul niveau de télédétection. Dans le détail, les données acquises par le capteur MODIS (MoDerate Image Spectroradiometer), monté sur les plateformes satellitaires Terra et Aqua, ont permis de quantifier la chlorophylle-a (Chl-a) dans les plans d’eau le long des côtes de Campanie et ont conduit au choix de dix points d’échantillonnage. Les échantillons ont été traités en laboratoire par observation microscopique et identification taxonomique, puis extraits avec des solvants organiques. Des extraits organiques ont été traités par analyse LC-MS-MS. Les données obtenues par MS-MS ont été analysées à l’aide d’une approche bioinformatique, en utilisant la plateforme GNPS pour créer un réseau de molécules. Le réseau a été analysé pour détecter et identifier les toxines en comparant les données des spectres de fragmentation obtenus par spectrométrie de masse avec la bibliothèque GNPS. Cela a permis de détecter des toxines connues et des analogues inconnus qui apparaîtront liés dans le même réseau moléculaire. Plus précisément, la lyngbyatoxine A, une dermatotoxine lipophile, a été détectée dans tous les échantillons d’eau et les échantillons de bivalves; dans le faisceau moléculaire de lyngbyatoxin A, des noeuds non liés à aucun composé connu de famille de lyngbyatoxins étaient également présents, suggérant la présence des analogues inconnus de lyngbyatoxin. Aucune microcystine et autre toxine n’a été détectée dans les échantillons. Tous les résultats ont été obtenus dans les 24 heures-homme.

Figure 4
Figure 4: Résultats représentatifs de la FDS. Un exemple d’application de la stratégie FDS sur la côte campanie (Italie). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Au cours des dernières années, notre équipe a testé et validé plusieurs approches différentes qui ont permis de démêler la présence de cyanobactéries et de cyanotoxines dans les plans d’eau et les bivalves. La nouvelle stratégie élaborée représente le résultat de ces études. Les techniques et technologies optimales qui correspondent à la portée de la détection rapide sont rassemblées sous le chapeau d’une procédure unique qui maximise l’efficacité de chaque étape. La zone cible, l’extension de la floraison et le stade de croissance sont la force motrice du choix des méthodes et des technologies appropriées à utiliser.

Lorsque la détection rapide des cyanobactéries et des cyanotoxines est la priorité, la stratégie est rationalisée en réduisant le nombre total à quatre étapes principales: (1) la détection à distance et proximale et l’analyse des données pour une première enquête, la localisation des sites et la définition du modèle et de l’extension de la floraison; (2) Échantillonnage guidé; 3) Observation microscopique et analyse taxonomique; (4) Analyse chimique et mise en réseau moléculaire des données LC-MS pour la déreplication des échantillons d’eau et la détection rapide des cyanotoxines.

En ce qui concerne la première étape, même si la disponibilité des données acquises par une chaîne complète de plates-formes qui couvrent toutes les couches de l’approche de surveillance hiérarchique serait la meilleure solution pour reposer une vision complète du scénario analysé, souvent une seule couche d’information peut conduire l’action d’enquête de zone et se concentrer efficacement sur les points chauds pour effectuer des actions d’échantillonnage in situ. Selon les expériences rapportées dans lesquelles les données ont été acquises à l’aide de satellites, d’avions, d’hélicoptères, d’UAV, la solution qui correspond totalement aux besoins requis par la stratégie de détection rapide est l’utilisation des seuls produits satellitaires.

De plus, les couches d’information qui découlent des missions effectuées par des plates-formes qui volent à des altitudes inférieures à celles des satellites (p. ex. aéronefs, hélicoptères, UAV) reformitent l’information avec une grande résolution, mais elles sont très coûteuses et nécessitent également plus de temps pour terminer le processus d’acquisition complet qui comprend également la définition et l’approbation du plan de vol.

Une fois les points à échantillons sélectionnés (étape 2), les analyses analytiques/bioinformatiques (mise en réseau moléculaire des données LC-MS) sont l’outil de déreplication rapide des échantillons d’eau et de détection rapide des cyanotoxines (étapes 3 et 4). L’analyse métagénomique 16S prend au moins 2 semaines de travail. De plus, même lorsque des espèces de cyanobactéries qui sont génériquement toxiques sont identifiées, leur production de toxines n’est pas démontrée. Pour la même raison, l’observation microscopique n’est pas elle-même suffisante pour révéler la présence de cyanobactéries toxiques. Bien sûr, l’analyse de la SP et la mise en réseau moléculaire ont certaines limites; ils sont très efficaces si les composés d’intérêt (p. ex. les toxines) sont bien ionisés dans les conditions appliquées, s’ils sont en quantité suffisante pour être détectés. Aux fins de la détection et de la surveillance des toxines cyanobactériennes connues, la mise en réseau moléculaire basée sur la SP représente en fait l’une des technologies les plus robustes et les plus fiables.

Par conséquent, cette approche s’avère très utile lorsqu’une détection rapide des cyanobactéries et des cyanotoxines apparentées est nécessaire; de plus, cette stratégie permet également de quantifier les proliférations de cyanobactéries et les toxines dans l’espace et dans le temps afin de prévenir les problèmes des communautés de santé qui pourraient survenir par de grandes proliférations toxiques de cyanobactéries.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le « Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP) » dans le cadre du projet « Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania », et réalisée en coopération avec l’Agence de protection de l’environnement de la région de Campanie, Italie (ARPAC), « Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare » (IZSM/ORSA), Université de Naples « Federico II » - Département de médecine vétérinaire et de production animale, réf. prof. A. Anastasio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Vitamin mix Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH Sigma-Aldrich 33065.2.5L-R
BG11 stock solution Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge Hermle Z36HK
CHCl3 Honeywell 32211.2.5L
H2O Sigma-Aldrich 34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system Thermo
MeOH Honeywell 32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera  Optech Biostar B3
Multiband camera Intergraph DMC
Nitsch's Solution H3BO3 0.5 g/L
MnSO4· H2O 2.28 g/L
ZnSO4·7H2O 0.5 g/L
CuSO4·5H2O 0.025 g/L
COCl2·6H2O 0.135 g/L
Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC AQL
SWBG11 medium BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chimie Numéro 168 prolifération de cyanobactéries cyanotoxines détection rapide microcystines réseau moléculaire basé sur le SGRH-LC télédétection détection proximale surveillance de l’environnement pollution marine échantillonnage de sécurité
Détection précoce des proliférations de cyanobactéries et des cyanotoxines associées à l’aide d’une stratégie de détection rapide
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Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

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