Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Tidlig påvisning av cyanobakterielle blomster og assosierte cyanotoksiner ved hjelp av rask deteksjonsstrategi

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/61889
Automatic Translation
1, 1, 2, *3, *1
1TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy, University of Naples Federico II, 2Department of Public Health, University of Naples Federico II, 3Department of Engineering, University Parthenope
* These authors contributed equally

Summary

En rask tverrfaglig strategi for tidlig påvisning av cyanobakterielle blomster og tilhørende cyanotoksiner er beskrevet her. Det gjør det mulig å oppdage cyanobakterier og relaterte cyanotoksiner i vannprøver og i organiske matriser, for eksempel bivalveprøver, i 24 timer.

Abstract

Rask påvisning av cyanobakterier og cyanotoksiner oppnås ved hjelp av en FDS (Fast Detection Strategy). Bare 24 timer er nødvendig for å avdekke tilstedeværelsen av cyanobakterier og relaterte cyanotoksiner i vannprøver og i en organisk matrise, for eksempel bivalveekstrakter. FDS kombinerer eksterne/proksimale sensorteknikker med analytiske/bioinformatiske analyser. Prøvetakingssteder velges gjennom tverrfaglig, flerskala og multiparametrisk overvåking i et tredimensjonalt fysisk rom, inkludert fjernmåling. Mikroskopisk observasjon og taksonomisk analyse av prøvene utføres i laboratoriemiljøet, noe som gjør det mulig å identifisere cyanobakterielle arter. Prøver blir deretter ekstrahert med organiske løsningsmidler og behandlet med LC-MS/MS. Data innhentet av MS/MS analyseres ved hjelp av en bioinformatisk tilnærming ved hjelp av den elektroniske plattformen Global Natural Products Social (GNPS) for å skape et nettverk av molekyler. Disse nettverkene analyseres for å oppdage og identifisere giftstoffer, og sammenligner data fra fragmenteringsspektraet oppnådd ved massespektrometri med GNPS-biblioteket. Dette gjør det mulig å oppdage kjente giftstoffer og ukjente analoger som vises relatert i samme molekylære nettverk.

Introduction

Cyanobakterielle blomster har dukket opp som et miljøproblem over hele verden de siste 15 årene1,2. Cyanobakterielle blomster skyldes overvekst av mikroorganismer kalt cyanobakterier. De er en iøynefallende gruppe fotosyntetiske mikroorganismer som har tilpasset seg til å leve i et stort utvalg av miljøer, inkludert tropiske områder og ekstremt kaldt vann. De er kjent for å produsere store blomster som dekker vannflater, spesielt som svar på en massiv berikelse av næringsstoffer, den såkalte eutrofieringsprosessen3.

Derfor er cyanobakterier gode bioindikatorer av vannforurensning4,5,6. De kan også produsere et bredt utvalg av naturlige forbindelser med interessante farmakologiske egenskaper7,8. Miljøproblemet knyttet til cyanobakterier er blomstene selv. Blooms kan blokkere sollys til undervannsgress, konsumere oksygen i vannet som fører til fiskedrap, produsere overflateskum og lukt og forstyrre filterfôringen av organismer9.

I tillegg, og enda mer alvorlig, i en bestemt kombinasjon av faktorer som temperatur, næringsstoffer (fosfor og nitrogen), sollys (for fotosyntesen) og pH i vannet, utløser cyanobakterielle blomster toksinproduksjon; Derfor blir de skadelige for mennesker og dyr. Den mest studerte klassen av cyanotoksiner er produsert av slekten Microcystis. Disse er sykliske peptider kjent under det generelle navnet på mikrocystiner (MCs): microcystin-LR er den mest studerte som å kunne produsere alvorlig hepatoksisitet10. Dyr og mennesker kan bli utsatt for MCs ved inntak av forurenset drikkevann eller mat. Verdens helseorganisasjon (WHO) foreslo en total mikrocystin-LR-verdi på 0,001 mg/l som en retningslinje11. Dette er imidlertid bare relatert til en variant (dvs. MC-LR) av mer enn 100 mikrocystiner som har blitt isolert så langt.

Kombinerte metoder som tidligere er rapportert, for eksempel fjernmåling med MALDI-TOF MS-analyse12,13,14,15, har fokusert på konsentrasjonsdeteksjon av MCer. De nyeste metodene bruker sensorer med lav oppløsning som er effektive for å oppdage bare brede blomsterflater; de er også i stand til å avsløre bare giftstoffer for hvilke standarder som er tilgjengelige. Videre er de fleste av disse prosedyrene tidkrevende, og tid er en dramatisk faktor for tidlig påvisning av blomsten for å forhindre eller minimere sikkerhetsproblemer. Den tverrfaglige strategien som foreslås her gir rask påvisning av cyanobakterier og cyanotoksiner, etter bare 24 timer16.

I rammen av programmet kalt MuM3, "Multi-disiplinær, Multi-skala og Multi-parametrisk overvåking i det tredimensjonale (3D) fysiske rommet"17,18, kombinerer en FDS (Fast Detection Strategy) fordelene med flere teknikker: 1) fjernmåling for å oppdage blomsten; 2) mikroskopisk observasjon for å oppdage cyanobakterier; og 3) analytiske/bioinformatiske analyser, nemlig LC-HRMS-basert molekylært nettverk, for å oppdage cyanotoksiner. Resultatene oppnås innen 24 timer.

Den nye tilnærmingen er nyttig for å overvåke brede kystområder på kort tid, unngå mange prøvetakinger og analyser, og redusere deteksjonstid og kostnader. Denne strategien er et resultat av studiet og anvendelsen av forskjellige tilnærminger til overvåking av cyanobakterier og deres toksiner og kombinerer fordelene ved hver av dem. Spesielt analysen av resultatene, som kommer fra bruk av forskjellige plattformer (satellitt, fly, droner) og sensorer (MODIS, termisk infrarød) for fjernmålingsanalyse, for eksempel av forskjellige metodologiske tilnærminger for identifisering av cyanobakterielle arter (mikroskop, UV-Vis spektroskopi, 16S-analyse) og toksiner (LC-MS-analyse, molekylært nettverk), tillot valg av den mest hensiktsmessige metoden både for spesifikke og generelle formål. Den nye metodikken ble eksperimentert og validert i påfølgende overvåkingskampanjer på Campania-kysten (Italia), i rammen av Campanias overvåkningsprogram for miljøvernbyråer.

Figure 1
Figur 1: FDS-strategi. En oversikt over Fast Detection Strategy for cyanobakterier og cyanotoksiner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Ekstern og proksimal sensing: datainnsamling og analyse

MERK: I dette tilfellet brukes fjerntliggende/proksimale sensordata til en første makroområdeundersøkelse og til å velge bestemte steder i kystområdene som skal prøves. I MuM3-rammeverk17-ordningen er logikkflyten basert på en hierarkisk overvåkingsmodell som inkluderer flere nivåer med navngitte informasjonslag. Informasjonen på hvert nivå er basert på data innhentet ved hjelp av en eller flere sensorer som bæres ombord på plattformer som ligger i forskjellige høyder. Hvert nivå definerer en romlig skala avhengig av høyden på målingen19. Det er potensial for flere sensorer på hvert nivå. Noen eksempler er: synlig nær infrarød (VNIR) og termisk infrarød (TIR) bildebehandling20 på satellitter, fly, helikoptre, UAV21 og på overflaten; fysiske, kjemiske og biologiske analyser, etc.22 på overflaten og i rask respons ved hjelp av det mobile laboratoriet. Dataene som samles inn av hver sensor, behandles og kombineres for å beregne multispektrale indekser (f.eks. normalisert forskjell vegetasjonsindeks (NDVI), normalisert forskjellsvannindeks (NDWI), klorofyllindeks, etc.), slik at rådataene konverteres til mer nyttige parametere og formater (f.eks. tematisk kart).

Figure 2
Figur 2: Eksterne/proksimale sensoranalyser for prøvetaking (trinn 1-2). Multi-level og multi-sensor tilnærming for påvisning av cyanobakteriell blomst. Datainnsamling utføres via satellitt (A), fly (B) og/eller drone (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Ekstern og proksimal registrering av datahenting
    1. Hent data fra de ulike offentlige og private datasettene for fjernmåling, produsert spesielt for innholdsbasert henting og sceneklassifisering. Typiske datakilder som brukes i dette trinnet, er Landat-produkter levert av U.S. Geological Survey23, Sentinel-2,3-produkter levert av NASA24og Copernicus Open Access Hub25, MODIS-Aqua26.
    2. Identifiser produktene som er tilgjengelige for det spesifikke området, datointervallet og vurder grensen som er avledet av skydekket. Definere: A) interesseområdet ved hjelp av grafisk brukergrensesnitt og polygonvalg; B) datoområdet og skydekningen ved hjelp av tekstspørringsfilterfeltene.
      MERK: Selv om mange vitenskapelige rapporter siterer at en akseptabel skydekkeverdi er <20%, er det i denne typen forskning viktig å være oppmerksom på det virkelige skydekket bare på vannoverflaten, så en effektivitetsverdi for denne regionen er <5%.
    3. Velg produkter avledet fra plattformene som passer best til de spesifikke behovene til oppdraget. Fra hver kombinasjon av satellitt- og nyttelast tekniske spesifikasjoner er det mulig å skaffe flere samlinger av produkter. For eksempel behandles NASA EOSDIS24-dataproduktene på forskjellige nivåer, fra nivå 0 til nivå 4: Level 0-produktene er rådata med full instrumentoppløsning, mens dataene på høyere nivåer konverteres til mer nyttige parametere og formater. Vanligvis er nivåene 0-1 tilgjengelige, mens produktene i nivå 2-4 trenger spesifikk behandling relatert til spesifikke forskningsmål, slik at tilgjengeligheten er begrenset i tid og regionen dekkes.
    4. Last ned det valgte datasettet med satellittobservasjoner. I detalj, ved å velge blant listen over resultatene fra den forrige handlingen, last ned et komplett datasettprodukt (f.eks. en gruppe geo-tiff-filer, en for hvert bånd, pluss infoer og andre metadata) eller bare et bestemt enkeltbånd.
      MERK: For den spesifikke beskrivelsen av hver grunnleggende handling som er inkludert i prosedyren i trinn 1, se også Huan-Huan Chen et al. 202027.
  2. Databehandling og behandling av data for analysen og transformasjonen til mer nyttige parametere og formater for å tillate en første screening av makroområdet.
    MERK: Følgende handlinger (trinn 1.2) er dedikert til databehandling som er fullført for å transformere rådata som kommer fra lavere nivåer til informasjon og deretter til nyttig informasjon (høyere nivåer). Dette trinnet består av behandling av rådata fra hver sensor (f.eks. produktnivåer 0-1) og transformasjon til produkter på høyere nivå (f.eks. nivåer 2-4) og deretter i informasjonslag for å generere mer nyttige parametere og formater (f.eks. tematisk kart).
    1. Preprosessering av rådata som involverer geometrisk og radiometrisk kalibrering. Denne handlingen kan utføres ved hjelp av bestemt programvare som, på en automatisk eller halvautomatisk måte (uten tilsyn eller overvåket), gir et sett med tilkoblede verktøy for rasterbehandling for å utføre en enkel klassifisering som respekterer en riktig arbeidsflyt.
      MERK: I denne forskningen brukes to gratis åpen kildekode-verktøy: Q-GIS 3.1428 kombinert med Semi-Automatic Classification Plugin (SCP). SCP-plugin29 tillater halvautomatisk klassifisering av fjernmålingsbilder, og gir et komplett verktøysett for nedlasting av gratis bilder, forhåndsbehandling, etterbehandling og rasterberegning.
    2. Behandle kalibrerte data som beregner multispektrale indekser. Vanligvis utføres denne handlingen ved hjelp av et rasterkalkulatorverktøy. Beregningen av en multispektral indeks definerer en korrelasjon mellom ulike bånd/lag som et resultat genererer et nytt lag som kan administreres på en GIS-plattform. For eksempel, fra Sentinel og Landsat operasjonell land imager sensor (OLI), er det mulig å beregne multispektrale indekser somNormalized Difference Vegetation Index (NDVI). Vegetasjonsindeks brukes deretter til å estimere klorofyllinnhold30,31.
    3. Analyser resultatene oppnådd ved estimering av klorofyllinnholdsindeks representert som i falske fargetematiske kart og definer kritisk område med høy klorofyllkonsentrasjon. I denne studien genereres klorofyll-et kart ved hjelp av datasett av MODIS sensor32, montert på Terra og Aqua satellittplattformer. Prøvetakingsstedene er lokalisert der unormale verdier registreres.
      MERK: Algeoppblomstringsflagget (som definerer hvert enkelt sted) heves i fjernmålingsdomenet når Chl-a-konsentrasjonen overstiger 20 mg/l33.

2. Veiledede prøvetakinger

MERK: Valget av prøvetakingssteder er drevet av fjern/proksimal sensorlaganalyse som gjør det mulig å velge steder i store kystområder. Med tanke på at prøvetaking kan være farlig for operatører på grunn av mikrocystins toksisitet, er det nødvendig med sikkerhetsprøvetakingsprosedyrer. Spesielt er det nødvendig å beskytte operatører mot aerosolinnånding og hudkontakt. Utfør deretter prøvetaking ved å følge prosedyren som er beskrevet nedenfor.

  1. Bruk vernebriller for øyebeskyttelse, FFP2-maske for å forhindre aerosolinnånding og vernehansker for å forhindre hudkontakt.
  2. Samle 0,5 liter vann i triplikat på hvert sted.
  3. Mål saltholdigheten for hver prøve ved hjelp av et refraktometer. Sett en dråpe av prøven på refraktomett og les saltholdighetsverdien når det gjelder deler per tusen (ppt - ‰).
  4. På slutten av prøvetakingen må du først vaske hendene; Fjern deretter hansker, maske og vernebriller, pass på at du ikke berører den ytre overflaten på det personlige beskyttelsesutstyret.
  5. Bær prøven til laboratoriet ved romtemperatur.

3. Identifisering av cyanobakterier av mikroskopiske observasjoner og taksonomisk identifikasjon

  1. Sentrifuger hver prøve (≈0,5 L) ved 11 200 x g i 5 minutter.
  2. Trekk ut supernatanter som følger: Hell 500 ml butanol i hver prøve og bruk en trakt, overfør blandingen som skal ekstraheres i separatortrakten. Plasser separatortrakten oppreist i ringeklemmen slik at begge lagene kan skilles. La den vandige fasen renne ut i en Erlenmeyer-kolbe. Gjenta dette trinnet tre ganger. Konsentrer deretter de organiske fasene under vakuum og vei dem.
  3. Samle pellets fra trinn 3.1 og analyser dem med 400x og 1000x forstørrelse med et optisk mikroskop utstyrt med et 18 MP digitalt kamera for mikroskop. Se etter tilstedeværelsen av cyanobakterier på grunnlag av deres morfologiske egenskaper: blågrønn farge, celleform og størrelse gjør det mulig å gjenkjenne cyanobakterier blant andre mikroorganismer.
  4. Identifiser arten gjennom taksonomisk analyse ved mikroskopisk observasjon, i henhold til prosedyren beskrevet i Komarék et al. 201434.
    MERK: Komplementær 16S metagenomisk analyse kan utføres for å identifisere cyanobakteriell taxa3.
  5. Fortynn et aliquot av pellets med 10 ml sjøvann / ferskvann BG11 media, i henhold til saltholdighet, for dyrking.

4. Identifisering av cyanotoksiner

  1. Ekstraksjon av prøver med organiske løsningsmidler
    1. Legg hver prøve av pellet i en kolbe og soniker i 5 minutter ved hjelp av et isbad. Tilsett deretter 50 ml fersk MeOH og rist forsiktig. Filtrer løsningen ved hjelp av et papirfilter og samle filtratet i en rund bunnflaske. Gjenta dette trinnet to ganger. Trekk deretter ut pelletsene og tilsett 50 ml blanding av MeOH/DCM to ganger (1:1, 50 ml) og to ganger ved hjelp av 100 % DCM (x2, 50 ml)35. Merk hver runde bunnflaske, henholdsvis som "MeOH-ekstrakt", "MeOH / DCM ekstrakt" og "DCM ekstrakt", og konsentrer under vakuum.
    2. Analyser hvert organiske ekstrakt (MeOH, MeOH/DCM, DCM) av LC-HRMS/MS.
  2. LC-HRMS/MS-analyse
    1. LC-HRMS- og LC-HRMS/MS-prøver: Løs opp hver prøve ved hjelp av MeOH ≥ 99,9 % for å få en endelig konsentrasjon på 10 mg/ml.
    2. Analyser hver prøve ved hjelp av et høyoppløselig ESI-massespektrometer kombinert med et HPLC-system (LC-HRMS/MS-system). Arbeid på HPLC med en 5-μm C18 søyle (100 x 2,10 mm), ved romtemperatur. Bruk en gradient elution med H2O (supplert med 0,1% HCOOH) og MeOHat 200 μL min-1. Gradientprogrammet er: 10% MeOH i 3 min, 10% til 100% MeOH i 30 min, 100% MeOH i 7 min. Bruk MeOH som kontroll.
    3. Datainnsamling. Samle inn data i den dataavhengige innsamlingsmodusen (DDA): De 10 mest intensive ionene i et fullskannings massespekter må utsettes for høyoppløselig tandemmassespektrometri (HRMS/MS) analyse. Anskaffe HRMS/MS-skanninger for utvalgte ioner med CID-fragmentering, en isolasjonsbredde på 2,0, normalisert kollisjonsenergi på 35, aktivering Q på 0,250 og en aktiveringstid på 30 ms.
  3. Bioinformatiske analyser og molekylært nettverk
    1. Analyser fragmenteringsmønstre for hver intense ion ved hjelp av MS-spesifikk programvare.
    2. Bruk MS-Cluster til å gruppere dataene (overordnet massetoleranse for 1.0 Da og MS/MS fragmentiontoleranse på 0,5 Da). Konsensusspektra som inneholder mindre enn 2 spektra elimineres.
    3. Analyser MS/MS-data ved hjelp av GNPS (Global Natural Products Social36) for molekylært nettverk.
    4. Parvis sammenligne konsensusspektra og også med de som er rapportert i GNPS-Mass-Ive-bibliotekene.
    5. Visualiser det oppnådde nettverket37.
      MERK: For molekylært nettverk, se Sigrist et al. 202038.

Figure 3
Figur 3: FDS-trinn i laboratoriet (3-4). Visuell fremstilling av hovedaktivitetene som utføres i laboratoriet etter prøvetaking (trinn 3 og 4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

I en første studie3ble fire menneskeskapte steder langs Campania-kysten i SW Italia observert ved hjelp av satellitt Landsat 8 og fly sommeren 2015. Landsat 8 operasjonell landbildesensor (OLI) og flyets multispektrale kamera fikk lov til å lage Normalized Difference Water Index (NDWI) bilder for områdene, derfor for å avsløre tilstedeværelsen av cyanobakterielle samfunn. Cyanobakteriell samfunnssammensetning ble bestemt gjennom spektrofotometriske analyser for påvisning av cyanobakterielle pigmentfykocyanin (PC). Deretter fikk komplementær 16S metagenomisk analyse lov til å identifisere cyanobakteriell taxa. Den forenklede multispektrale bildeindeksering og klassifisering gjennom satellitt/ luftplattformer i kombinasjon med metagenomiske analyser var effektive for å oppdage tilstedeværelsen av cyanobakterier som tilhører slekter forbundet med sterke eutrofiske forhold (som Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), i et tidlig stadium av blomstringen.

I en annen studie14ble FDS-tilnærmingen testet i løpet av våren/sommeren 2017. Satellittdata ble brukt som eneste fjernmålingsnivå. I detalj tillot data innhentet av MODerate Image Spectroradiometer (MODIS)-sensor, montert på Terra- og Aqua-satellittplattformer, kvantifisering av klorofyll-a (Chl-a) i vannkroppene langs Campania-kysten og drev valget av ti prøvetakingssteder. Prøver ble behandlet i laboratoriet ved mikroskopisk observasjon og taksonomisk identifikasjon, deretter ekstrahert med organiske løsningsmidler. Organiske ekstrakter ble behandlet av LC-MS-MS-analyse. Data innhentet av MS-MS ble analysert ved hjelp av en bioinformatisk tilnærming, ved hjelp av GNPS-plattformen for å skape et nettverk av molekyler. Nettverket ble analysert for å oppdage og identifisere giftstoffer som sammenlignet data fra fragmenteringsspektraet oppnådd ved massespektrometri med GNPS-biblioteket. Dette tillot å oppdage kjente giftstoffer og ukjente analoger som vil vises relatert i samme molekylære nettverk. Nærmere bestemt ble Lyngbyatoxin A, en lipofil dermatotoksiner, påvist i alle vannprøver og bivalvesprøver; i Lyngbyatoxin En molekylær klynge, noder som ikke er relatert til noen kjente forbindelser av lyngbyatoxins familie var også til stede, noe som tyder på tilstedeværelsen av ukjente lyngbyatoxinanaloger. Det ble ikke påvist mikrocystiner og andre giftstoffer i prøvene. Alle resultatene ble oppnådd innen 24 arbeidstimer.

Figure 4
Figur 4: FDS-representative resultater. Et eksempel på anvendelse av FDS-strategi på Campania-kysten (Italia). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I løpet av de siste årene testet og validerte teamet vårt flere forskjellige tilnærminger som tillot å avdekke tilstedeværelsen av cyanobakterier og cyanotoksiner i vannlegemer og bivalver. Den nye utviklede strategien representerer resultatet av disse studiene. De optimale teknikkene og teknologiene som passer til omfanget av rask deteksjon, samles under hatten av en unik prosedyre som maksimerer effektiviteten til hvert enkelt trinn. Målområdet, blomstringsforlengelsen og vekststadiet er drivkraften til valg av egnede metoder og teknologier å bruke.

Når cyanobakterier og cyanotoksiner rask deteksjon er prioriteten, er strategien strømlinjeformet redusere det totale antallet til fire hovedtrinn: (1) Ekstern og proksimal sensing og dataanalyse for en første undersøkelse, lokalisering av nettsteder og definisjon av blomstrende mønster og utvidelse; (2) Veiledet prøvetaking; (3) Mikroskopisk observasjon og taksonomisk analyse; (4) Kjemisk analyse og molekylært nettverk av LC-MS-data for dereplisering av vannprøvene og rask deteksjon av cyanotoksiner.

Når det gjelder det første trinnet, selv om tilgjengeligheten av data som er samlet inn av en komplett kjede av plattformer som dekker alle lagene med hierarkisk overvåkingsmetode, ville være den beste løsningen for å gjenopprette en komplett visjon av det analyserte scenariet, kan ofte bare ett informasjonslag drive områdeundersøkelseshandlingen og effektivt fokusere på aktiveringspunktene for å utføre in-situ prøvetakingshandlinger. Ifølge de rapporterte erfaringene der data ble samlet inn ved hjelp av satellitter, fly, helikoptre, UAVs, er løsningen som helt samsvarer med behovene som kreves av den raske deteksjonsstrategien, bruken av de eneste satellittproduktene.

I tillegg restituerer informasjonslagene som kommer fra oppdrag utført av plattformer som flyr i lavere høyder enn satellitter (f.eks. fly, helikoptre, UAVs) informasjon med stor oppløsning, men disse er svært dyre og krever også mer tid til å fullføre hele anskaffelsesprosessen som også inkluderer flyplandefinering og godkjenning.

Når flekkene som skal tas prøver er valgt (trinn 2), er analytiske/bioinformatiske analyser (Molekylært nettverk av LC-MS-data) verktøyet for rask dereplisering av vannprøvene og rask deteksjon av cyanotoksiner (trinn 3 og 4). 16S metagenomisk analyse tar minst 2 ukers arbeid. Videre, selv når cyanobakterielle arter som er generisk giftige er identifisert, er deres toksinproduksjon ikke demonstrert. Av samme grunn er mikroskopisk observasjon ikke selv tilstrekkelig til å avsløre tilstedeværelsen av giftig cyanobakterier. Selvfølgelig har MS-analyse og molekylært nettverk noen begrensninger; de er ganske effektive hvis forbindelser av interesse (f.eks. giftstoffer) er godt ionisert under de påførte forholdene, hvis de er i tilstrekkelig mengde til å bli oppdaget. I forbindelse med den kjente cyanobakterielle toksindeteksjonen og overvåkingen representerer MS-basert molekylært nettverk faktisk en av de mer robuste og pålitelige teknologiene.

Derfor viser denne tilnærmingen seg å være ganske nyttig når en rask påvisning av cyanobakterier og relaterte cyanotoksiner er nødvendig; Videre er kvantifisering av både cyanobakteriell blomstring og toksin over rom og tid også mulig ved denne strategien for å forhindre helseproblemer som kan oppstå ved store cyanobakterielle giftige blomster.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av "Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" i rammen av prosjektet "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania", og utført i samarbeid med Campania Region Environmental Protection Agency, Italia (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare" (IZSM/ORSA), University of Naples "Federico II" - Institutt for veterinærmedisin og dyreproduksjon, ref. prof. A. Anastasio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Vitamin mix Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH Sigma-Aldrich 33065.2.5L-R
BG11 stock solution Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge Hermle Z36HK
CHCl3 Honeywell 32211.2.5L
H2O Sigma-Aldrich 34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system Thermo
MeOH Honeywell 32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera  Optech Biostar B3
Multiband camera Intergraph DMC
Nitsch's Solution H3BO3 0.5 g/L
MnSO4· H2O 2.28 g/L
ZnSO4·7H2O 0.5 g/L
CuSO4·5H2O 0.025 g/L
COCl2·6H2O 0.135 g/L
Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC AQL
SWBG11 medium BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
  2. Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
  3. O'Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
  4. Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
  5. Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
  6. Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
  7. Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
  8. Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
  9. Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
  10. Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
  11. WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
  12. Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
  13. Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
  14. Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
  15. Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
  16. Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
  17. Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
  18. Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
  19. Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , 8286 LNCS (PART 2) (2013).
  20. Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), Switzerland. (2017).
  21. Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
  22. Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
  23. U.S. Geological Survey. , Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020).
  24. NASA Earthdata. , Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020).
  25. Copernicus Opern Access Hub. , Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020).
  26. MODerate Image Spectroradiometer (MODIS) Aqua. , Available from: podaac-tools.jpl.nasa.gov (2020).
  27. Chen, H. -H., Tang, R., Zhang, H. -R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  28. QGIS. , Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020).
  29. Congedo, L. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1. , Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016).
  30. Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
  31. Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
  32. Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
  33. Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
  34. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
  35. Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
  36. UCSD Commputational Mass Spectrometer Website. , Available from: http://gnps.ucsd.edu/ (2020).
  37. Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  38. Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Tags

Kjemi Utgave 168 cyanobakteriell blomstring cyanotoksiner rask deteksjon mikrocystiner LC-HRMS-basert molekylært nettverk fjernmåling proksimal sensing miljøovervåking marin forurensning sikkerhetsprøvetaking
Tidlig påvisning av cyanobakterielle blomster og assosierte cyanotoksiner ved hjelp av rask deteksjonsstrategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, … More

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter