Summary
シアノバクテリアの花と関連するシアノトキシンの早期発見のための高速-学際的な戦略がここに記載されています。これにより、水サンプルおよび二枚貝サンプルなどの有機マトリックス中のシアノバクテリアおよび関連するシアノトキシンを24時間で検出できます。
Abstract
シアノバクテリアおよびシアノトキシンの迅速な検出は、高速検出戦略(FDS)を使用して達成される。水サンプルや二枚貝抽出物などの有機マトリックス中のシアノバクテリアおよび関連するシアノトキシンの存在を解明するために必要なのは24時間だけです。FDSは、リモート/近位センシング技術と分析/バイオインフォマティクス分析を組み合わせた技術です。サンプリング スポットは、リモート センシングを含む 3 次元の物理空間で、複数の分野、多段階、およびマルチパラメトリックモニタリングを通じて選択されます。試料の顕微鏡観察と分類分析は、シアノバクテリア種の同定を可能にする実験室の設定で行われる。その後、サンプルを有機溶媒で抽出し、LC-MS/MSで処理し、MS/MSで得られたデータを、オンラインプラットフォームグローバルナチュラルプロダクツソーシャル(GNPS)を使用してバイオインフォマティクスアプローチを使用して分析し、分子のネットワークを作成します。これらのネットワークを解析して毒素を検出し、同定し、質量分析により得られた断片化スペクトルのデータをGNPSライブラリと比較します。これにより、同じ分子ネットワークに関連して現れる既知の毒素と未知の類似体を検出することができます。
Introduction
シアノバクテリアの花は、過去15年、2年の間に世界中の環境問題として浮上している。シアノバクテリアの花は、シアノバクテリアという微生物の過剰増殖によるものです。彼らは熱帯地域や非常に冷たい水を含む環境の大規模な配列に住むために自分自身を適応している光合成微生物の顕著なグループです。彼らは、特に栄養素の大規模な濃縮、いわゆる富栄養化プロセス3に応答して、水面を覆う大きな花を生成するために知られています。
したがって、シアノバクテリアは、水質汚染4、5、6の優れたバイオ指標である。彼らはまた、興味深い薬理学的特性7、8を有する天然化合物の広い配列を生成することができます。シアノバクテリアに関する環境問題は、花そのものです。ブルームは、水中草への太陽光を遮断し、魚の死に至る水中の酸素を消費し、表面スカムと臭いを生成し、生物のフィルター供給を妨げる9。
さらに、さらに深刻なことに、温度、栄養素(リンおよび窒素)、太陽光(光合成用)、および水のpHなどの要因の特定の組み合わせで、シアノバクテリアの花は毒素産生を引き起こす。したがって、人間や動物に有害になります。シアノトキシンの最も研究されたクラスは、属ミクロシスシスによって生成されます。これらは、ミクロシスチン(MC)の一般名で知られている環状ペプチドである:微小シスチン-LRは、重篤な肝毒性を産生することができるとして最も研究されている10。動物や人間は、汚染された飲料水や食物を摂取することによってMCにさらされる可能性があります。世界保健機関(WHO)は、ガイドライン11として0.001mg/Lの総マイクロシスチン-LR値を提案した。しかし、これまでに単離された100個以上のミクロシスチンのうち、1つの変異体(MC-LR)にのみ関連しています。
MALDI-TOF MS解析12、13、14、15とのリモートセンシングなど、これまでに報告された複合的な方法は、MCの濃度検出に焦点を当ててきた。最新の方法では、広い花の広がりの検出に有効な低解像度センサーを使用しています。また、標準が利用可能な毒素のみを明らかにすることも可能です。さらに、これらの手順のほとんどは時間がかかり、時間は、安全上の問題を防止または最小限に抑えるために、花の早期発見のための劇的な要因です。ここで提案される学際的な戦略は、シアノバクテリアのブルームとシアノトキシンの迅速な検出を提供します, わずか24時間16後.
MuM3と呼ばれるプログラムのフレームでは、「3次元(3D)物理空間における多分野、多尺度および多パラメトリックモニタリング」17,18、高速検出戦略(FDS)は、いくつかの技術の利点を兼ね備えています: 1)リモートセンシングは、花を検出します。2)シアノバクテリア種を検出する顕微鏡観察;3)分析/バイオインフォマティクス分析、すなわち、LC-HRMSベースの分子ネットワーキングは、シアノトキシンを検出します。結果は24時間以内に得られる。
この新しいアプローチは、広い沿岸地域を短時間で監視し、多数のサンプリングと分析を回避し、検出時間とコストを削減するのに役立ちます。この戦略は、シアノバクテリアとその毒素のモニタリングに対するさまざまなアプローチの研究と応用の結果であり、それぞれの利点を兼ね備えています。具体的には、分析結果は、シアノバクテリア種の同定(顕微鏡、UV-Vis分光法、16S分析)および毒素(LC-MS分析、分子ネットワーキング)の多様な方法論的アプローチなど、リモートセンシング分析のための異なるプラットフォーム(衛星、航空機、ドローン)およびセンサー(MODIS、熱赤外線)の使用から来て、特定の目的と両方に最も適切な方法の選択を可能にした。新しい方法論は、カンパニアの環境保護機関の監視プログラムの枠組みの中で、カンパニア海岸(イタリア)でのその後の監視キャンペーンで実験され、検証されました。
図1: FDS戦略シアノバクテリアとシアノトキシンの高速検出戦略の概要.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
1. リモートセンシングと近接センシング:データ取得と分析
注: この場合、リモート/近接センシング データは、最初のマクロエリア調査に使用され、サンプリングする沿岸地域の特定のスポットを選択します。MuM3フレームワーク17スキームでは、論理フローは、情報層という名前の複数のレベルを含む階層的な監視モデルに基づいている。各レベルの情報は、異なる高度に位置するオンボードプラットフォームを搭載した1つ以上のセンサーを使用して取得したデータに基づいています。各レベルは、測定19の高度に応じて空間スケールを定義します。各レベルで複数のセンサーが発生する可能性があります。いくつかの例は、可視近赤外(VNIR)と衛星、航空機、ヘリコプター、UAV21と表面に20の熱赤外線(TIR)イメージング。表面での物理的、化学的、生物学的分析等22、およびモバイルラボを用いた迅速な応答で。各センサで取得したデータは、マルチスペクトルインデックス(正規化差植生指数(NDVI)、正規化差分水指数(NDVI)、クロロフィル指数など)を計算するために処理され、組み合わされるので、生データはより有用なパラメータと形式(例えば、主題マップ)に変換されます。
図2:サンプリング用のリモート/近位センシング分析(ステップ1~2)。シアノバクテリアブルームの検出のためのマルチレベルおよびマルチセンサーアプローチ。データ取得は、衛星(A)、航空機(B)、ドローン(C)によって行われます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- リモートセンシングおよび近接センシングデータ検索
- コンテンツベースの検索とシーン分類のために特に作成された、さまざまなパブリックおよびプライベート リモート センシング データセットからデータを取得します。このステップで使用される典型的なデータセットソースには、米国地質調査所23、SENTINEL-24、コペルニクスオープンアクセスハブ25、MODIS-Aqua26が提供するランドサット製品が含まれます。
- 特定の領域、期間に対して利用可能な製品を特定し、クラウド カバーによって導き出される制限を検討します。定義: A) グラフィカルユーザーインターフェイスとポリゴン選択を使用して関心のある領域。B) テキスト クエリ フィルター フィールドを使用して、日付範囲とクラウド カバレッジ。
注:多くの科学的なレポートは、許容できる雲量の値が<20%であることを挙げている場合でも、この種の研究では、水面上でのみ実際の雲量に注意を払うことが重要であるため、この領域の有効性値は<5%です。 - ミッションの特定のニーズに最も適したプラットフォームから派生した製品を選択します。衛星とペイロードの技術仕様の各組み合わせから、製品のいくつかのコレクションを得ることが可能です。たとえば、NASA EOSDIS24 データ製品はレベル0からレベル4までの様々なレベルで処理されます:レベル0の製品は、より高いレベルでは、データがより有用なパラメータとフォーマットに変換され、完全な機器の解像度で生データです。通常、レベル 0-1 が利用可能ですが、レベル 2 ~4 の製品は特定の研究目標に関連する特定の処理を必要とするため、その可用性は時間と地域で制限されます。
- 衛星観測の選択したデータセットをダウンロードします。詳細については、前のアクションの結果のリストから選択し、完全なデータセット製品(例えば、geo-tiffファイルのグループ、各バンドに対して1つ、および情報、その他のメタデータ)をダウンロードするか、または特定の単一のバンドのみをダウンロードします。
注: ステップ 1 の手順に含まれる各基本アクションの具体的な説明については、Huan-Huan Chen ら 202027を参照してください。
- マクロ領域の最初のスクリーニングを可能にする、より有用なパラメータとフォーマットへの分析と変換のためのデータの前処理と処理。
注: 次のアクション (ステップ 1.2) は、データ処理に専念して、下位レベルから取得した生データを情報に変換し、次に有用な情報 (上位レベル) に変換します。このステップは、各センサーからの生データ(例えば、製品レベル0-1)の処理と、より高いレベルの製品(例えば、レベル2-4)への変換、そして情報層で構成され、より有用なパラメータとフォーマット(例えば、主題図)を生成する。- 幾何学的および放射測定の口径測定を含む生データを前処理する。このアクションは、正確なワークフローを尊重して簡単な分類を実行するために、自動または半自動の方法 (教師なしまたは監視対象) でラスター処理用の接続ツールセットを提供する特定のソフトウェアを使用して実行できます。
注:この研究では、2つの無料のオープンソースツールが使用されています:Q-GIS 3.1428 と半自動分類プラグイン(SCP)を組み合わせた。SCPプラグイン29 は、リモートセンシング画像の半自動分類を可能にし、自由な画像のダウンロード、前処理、後処理、およびラスター計算のための完全なツールセットを提供する。 - マルチスペクトルインデックスを計算して、較正されたデータを処理します。通常、このアクションはラスター計算ツールを使用して実行されます。マルチスペクトル インデックスの計算では、異なるバンド/レイヤー間の相関関係が定義され、その結果、GIS プラットフォームで管理できる新しいレイヤーが生成されます。例えば、SentinelとLandsatの運用用ランドイメージャーセンサ(OLI)から始めて、正規化差分植生指数(NDVI)などのマルチスペクトルインデックスを計算することが可能です。次に、植物指数を使用してクロロフィル含有量30,31を推定する。
- 偽色主題図で表されるクロロフィル含有量指数の推定から得られた結果を分析し、クロロフィル濃度の高い臨界領域を定義します。本研究では、TerraおよびAqua衛星プラットフォームに搭載されたMODISセンサー32のデータセットを用いてクロロフィル-aマップが生成される。サンプリング スポットは、異常値が登録されている場所にローカライズされます。
注意:Chl-a濃度が20mg/L33を超えると、リモートセンシング領域で(各特定のスポットを定義する)藻類ブルームフラグが発生します。
- 幾何学的および放射測定の口径測定を含む生データを前処理する。このアクションは、正確なワークフローを尊重して簡単な分類を実行するために、自動または半自動の方法 (教師なしまたは監視対象) でラスター処理用の接続ツールセットを提供する特定のソフトウェアを使用して実行できます。
2. ガイド付きサンプリング
注:サンプリング スポットの選択は、大きな沿岸地域のスポットを選択できるリモート/近位センシング レイヤー解析によって駆動されます。マイクロシスチンの毒性のために、サンプリングはオペレータにとって危険である可能性があることを考慮して、安全サンプリング手順が必要です。特に、エアロゾル吸入や皮膚接触からオペレータを保護する必要があります。次に、以下の手順に従ってサンプリングを行います。
- 目の保護のためにゴーグルを着用し、エアロゾル吸入を防ぐためのFFP2マスク、皮膚接触を防ぐための安全手袋を着用してください。
- 各サイトで三重に水の0.5リットルを収集します。
- 屈折計を用いて各サンプルの分量を測定します。サンプルを屈折計に置き、1000分の部分(ppt -‰)の点で、占いの値を読み取ります。
- サンプリングの最後に、まず手を洗います。その後、手袋、マスク、ゴーグルを取り外し、個人保護具の外面に触れないように注意してください。
- サンプルを室温でラボに運びます。
3. 顕微鏡観察と分類学的同定によるシアノバクテリア種の同定
- 遠心分離機(≈0.5 L)で11,200 x g で5分間。
- 上清を抽出する:各サンプルにブタノールを500mL注ぎ、漏斗を用いて、抽出する混合物をセパネルに移す。セパネルをリングクランプに直立させて、両方の層を分離できるようにします。水相をエルレンマイヤーフラスコで排水させます。この手順を 3 回繰り返します。その後、有機相を真空下に濃縮し、重み付けします。
- ステップ3.1からペレットを収集し、顕微鏡用の18 MPデジタルカメラを搭載した光学顕微鏡で400倍と1,000倍の拡大率で分析します。その形態学的特徴に基づいてシアノバクテリアの存在を探す:青緑色、細胞形状、およびサイズは、他の微生物の間でシアノバクテリアを認識することができます。
- コマレクら 201434に記載の手順に従って、顕微鏡観察による分類学的分析を通じて種を同定する。
注:相補的な16Sメタゲノム分析は、シアノバクサ3を同定するために行うことができます。 - 藻の塩分に応じて、ペレットのアリコートを10mLの海水/淡水BG11培地で希釈して栽培します。
4. シアノトキシンの同定
- 有機溶剤を用いたサンプルの抽出
- ペレットの各サンプルをフラスコに入れ、氷浴を使用して5分間超音波処理します。その後、50mLの新鮮なMeOHを加え、軽く振ります。紙フィルターを使用して溶液をフィルターし、丸底フラスコに濾液を集めます。この手順を 2 回繰り返します。次いで、MeOH/DCMの50mL混合物を2回(1:1,50mL)、100%DCM(x2,50mL)35を用いて2回添加したペレットを抽出する。各丸底フラスコをそれぞれ「MeOH抽出物」、「MeOH/DCM抽出物」、「DCM抽出物」とラベル付けし、真空下で濃縮します。
- LC-HRMS/MSによる各有機抽出物(MeOH、MeOH/DCM、DCM)を分析します。
- LC-HRMS/MS 分析
- LC-HRMSおよびLC-HRMS/MSサンプル調製:MeOH≥99.9%を使用して各サンプルを溶解し、10mg/mLの最終濃度を得る。
- HPLCシステム(LC-HRMS/MSシステム)と組み合わせた高解像度ESI質量分析計を使用して、各サンプルを分析します。5 μm C18 カラム(100 x 2.10 mm)を室温で HPLC に取り組みます。H2O (0.1% HCOOH を補う) と MeOHat 200 μL 分-1との勾配溶出を使用します。勾配プログラムは、3分間10%のMeOH、30分間10%~100%のMeOH、7分間100%MeOHです。
- データ取得。データ依存型取得モード(DDA)でデータを収集する:フルスキャン質量スペクトルの最も集中的な10個のイオンは、高解像度タンデム質量分析(HRMS/MS)分析を受ける必要があります。CID断片化、絶縁幅2.0、正規化衝突エネルギー35、活性化Q0.250、および30ミリ秒の活性化時間を持つ選択されたイオンのHRMS/MSスキャンを取得します。
- バイオインフォマティクス解析と分子ネットワーク
- MS固有のソフトウェアを使用して、各強烈なイオンの断片化パターンを分析します。
- MS-Cluster を使用してデータをクラスタ化します (親の質量許容値が 1.0 Da、MS/MS フラグメントイオン許容値 0.5 Da)。2スペクトル未満を含むコンセンサススペクトルは除去される。
- 分子ネットワークのためのGNPS(グローバル天然物社会36)によるMS/MSデータの分析
- コンセンサススペクトルとGNPS-Mass-Iveライブラリで報告されているものをペアワイズ比較します。
- 取得したネットワーク37を可視化する。
注:分子ネットワークについては、Sigristら 202038を参照してください。
図3:FDSの実習手順(3-4)。サンプリング後に実験室で行われた主な活動の視覚的表現(ステップ3および4)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
最初の研究3では、2015年夏に衛星Landsat 8と航空機を使用して、SWイタリアのカンパニア海岸沿いの4つの人為的影響を受けたサイトが観測されました。Landsat 8 運用用陸上イメージャー センサー (OLI) および航空機マルチスペクトル カメラは、地域の正規化差分水指数 (NDWI) 画像を作成することを許可し、したがって、シアノバクテリア コミュニティの存在を明らかにします。シアノバクテリア群組成は、シアノバクテリア顔料フィコシアニン(PC)の検出のための分光光度分析を通じて決定した。次いで、相補的な16Sメタゲノム分析を行い、シアノバクテリアタキサを同定することを許可した。衛星/空中プラットフォームを介した単純化されたマルチスペクトル画像のインデックス化と分類は、強い富栄養状態( レプトリンビヤ sp.、 シュードオシラトリア sp.など)に関連する属に属するシアノバクテリアの存在を、開花の初期段階で検出するのに有効であった。
2番目の研究14では、FDSアプローチが2017年春夏の間にテストされました。衛星データは唯一のリモートセンシングレベルとして使用されました。詳細には、テラとアクア衛星プラットフォームに搭載されたMODerate画像分光放射計(MODIS)センサーによって取得されたデータは、カンパニア海岸沿いの水域におけるクロロフィルa(Chl-a)の定量化を可能にし、10のサンプリングスポットの選択を推進しました。試料を顕微鏡観察と分類学的同定によって実験室で処理し、次いで有機溶媒で抽出した。有機抽出物をLC-MS-MS分析で処理した。MS-MSで得られたデータを、GNPSプラットフォームを用いて分子のネットワークを作り出すバイオインフォマティクスを用いて分析した。ネットワークを解析し、質量分析によって得られた断片化スペクトルのデータとGNPSライブラリとの比較を行う毒素を検出し、同定した。これにより、同じ分子ネットワークに関連して現れる既知の毒素および未知の類似体を検出することができた。具体的には、リングビヤトキシンA、親油性皮膚科医毒は、すべての水サンプルと二枚貝のサンプルで検出されました。リンビヤトキシンA分子クラスターでは、リンビヤトキシンファミリーの既知の化合物に関係のない節点も存在し、未知のリンビヤトキシン類似体の存在を示唆した。サンプル中にミクロシスチンやその他の毒素は検出されなかった。すべての結果は24時間以内に得られた。
図4: FDS 代表結果.カンパニア海岸(イタリア)でのFDS戦略の適用の例。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
過去数年間、私たちのチームは、水域と二枚貝のシアノバクテリアとシアノトキシンの存在を解明することを可能にするいくつかの異なるアプローチをテストし、検証しました。新たに開発された戦略は、これらの研究の結果を表しています。高速検出の範囲に合った最適な技術と技術は、各シングルステップの有効性を最大化するユニークな手順の帽子の下に集められます。対象領域、ブルーム延長、成長段階は、使用する適切な方法と技術の選択への原動力です。
シアノバクテリアとシアノトキシンの迅速な検出が優先される場合、戦略は、4つの主要なステップに総数を減らすことが合理化されます: (1) 最初の調査のためのリモートおよびプロキシスセンサーとデータ分析, サイトの局在化と花のパターンと拡張の定義;(2) ガイド付きサンプリング(3) 顕微鏡観察と分類分析(4) 水サンプルの非複製およびシアノトキシンの高速検出のためのLC-MSデータの化学分析と分子ネットワーキング。
最初のステップに関しては、階層的な監視アプローチのすべての層をカバーする完全なプラットフォームチェーンによって取得されたデータが利用可能であっても、分析されたシナリオの完全なビジョンを取り扱う最善の解決策である場合でも、多くの場合、1つの情報層がエリア調査アクションを推進し、ホットスポットに効果的に集中してその場でサンプリングアクションを実行することができます。衛星、航空機、ヘリコプター、UAVを使用してデータを取得した報告された経験によると、高速検出戦略で必要とされるニーズに完全に一致するソリューションは、唯一の衛星製品の使用です。
さらに、衛星(航空機、ヘリコプター、UAVなど)よりも低い高度で飛行するプラットフォームによって実行されるミッションから派生する情報層は、非常に高い解像度で情報を払い戻しますが、飛行計画の定義と承認を含む完全な取得プロセスを完了するためにより多くの時間が必要です。
サンプルとなるスポットを選択すると(ステップ2)、分析/バイオインフォマティクス分析(LC-MSデータの分子ネットワーキング)は、水サンプルの高速な非複製およびシアノトキシンの高速検出のためのツールです(ステップ3および4)。16Sメタゲノム解析には少なくとも2週間の作業が必要です。また、一般的に毒性のあるシアノバクテリア種が同定されても、その毒素産生は実証されない。同じ理由から、顕微鏡観察自体は有毒なシアノバクテリアの存在を明らかにするのに十分ではない。もちろん、MS分析と分子ネットワーキングには、いくつかの制限があります。それらは、対象化合物(例えば、毒素)が、検出される十分な量であれば、適用された条件で十分にイオン化されている場合に非常に効果的である。既知のシアノバクテリア毒素検出およびモニタリングの目的のために、MSベースの分子ネットワーキングは、実際にはより堅牢で信頼性の高い技術の1つを表しています。
したがって、このアプローチは、シアノバクテリアおよび関連するシアノトキシンの迅速な検出が必要な場合に非常に有用であることが証明されています。さらに、シアノバクテリアの花と毒素の両方を空間と時間を超えて定量化することは、大規模なシアノバクテリア有毒な花によって生じる可能性のある健康コミュニティの問題を防ぐためにも可能です。
Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、プロジェクト「アッティヴィタ・ピロタ・ディ・モニターラッジョ・ディ・シノバッターリ・ネラ・ファシア・コスティエラ・デッラ地域カンパニア」のフレームに「セントロ・ディ・リプリメントメント・リージョナル・パー・ラ・シキュレッツァ・サニタリア・デル・ペスカト(CRiSaaP)」によって資金提供されました。 カンパニア地域環境保護庁(ARPAC)、イスキトゥト・ズールフィラッティコ・スペヒタルレ・デル・メッツォギオルノ/オセルヴァトリオ・リージョナ・ラ・シカレッツァ・アリメンタレ(IZSM/ORSA)、ナポリ大学「フェデリコ2世」と協力して実施
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Vitamin mix | Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL | ||
| 1-BuOH | Sigma-Aldrich | 33065.2.5L-R | |
| BG11 stock solution | Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL | ||
| Centrifuge | Hermle | Z36HK | |
| CHCl3 | Honeywell | 32211.2.5L | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 34877.2.5L | |
| Kinetex C18 cloumn | Phenomenex | ||
| LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system | Thermo | ||
| MeOH | Honeywell | 32213.2.5L | |
| Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera | Optech | Biostar B3 | |
| Multiband camera | Intergraph DMC | ||
| Nitsch's Solution | H3BO3 0.5 g/L MnSO4· H2O 2.28 g/L ZnSO4·7H2O 0.5 g/L CuSO4·5H2O 0.025 g/L COCl2·6H2O 0.135 g/L Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L |
||
| Refractomer mr 100 ATC | AQL | ||
| SWBG11 medium | BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L |
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