Summary
Qui, descriviamo i metodi per iniezioni pupali e adulte efficienti in Nasonia vitripennis come alternative accessibili alla microiniezione embrionale, consentendo l'analisi funzionale dei geni di interesse utilizzando il silenziamento dell'RNA tramite interferenza dell'RNA (RNAi) o knockout genico tramite l'editing del genoma CRISPR / Cas9.
Abstract
La vespa gioiello, Nasonia vitripennis, è diventata un efficiente sistema modello per studiare l'epigenetica della determinazione del sesso aplo-diploide, la biologia cromosomica B, le interazioni ospite-simbionte, la speciazione e la sintesi del veleno. Nonostante la disponibilità di diversi strumenti molecolari, tra cui CRISPR/Cas9, gli studi genetici funzionali sono ancora limitati in questo organismo. La principale limitazione dell'applicazione della tecnologia CRISPR/Cas9 in N. vitripennis deriva dalle sfide delle microiniezioni embrionali. Le iniezioni di embrioni sono particolarmente difficili in questo organismo e in generale in molte vespe parassitoidi, a causa delle piccole dimensioni dell'embrione e del requisito di una pupa ospite per lo sviluppo embrionale. Per affrontare queste sfide, cas9 ribonucleoproteina consegna complessa nelle ovaie femminili per iniezione adulta, piuttosto che microiniezione embrionale, è stato ottimizzato, con conseguente modifica della linea germinale somatica ed ericolabile. Le procedure di iniezione sono state ottimizzate nelle pupe e nelle vespe femminili utilizzando remot control (trasduzione ovarica mediata dal recettore del carico) o BAPC (capsule peptidiche anfifile ramificate). Questi metodi si dimostrano efficaci alternativi all'iniezione embrionale, consentendo mutazioni germinali site-specific ed heritable.
Introduction
L'editing genico CRISPR/Cas9 è una potente tecnologia per studi genetici funzionali, specialmente in molti organismi modello in ascesa come la vespa gioiello Nasonia vitripennis. La facilità di allevamento e la disponibilità di un genoma completo rendono la vespa gioiello un importante sistema sperimentale per chiarire i meccanismi molecolari dei diversi processi biologici. Ad esempio, N. vitripennis è stato recentemente utilizzato per svelare la base epigenetica del sistema di determinazione sessuale aplodiploide1,2, la biologia dei cromosomi B3,4,5,6e la base genetica per la regolazione circadiana estagionale 7,8. Alcune delle caratteristiche che rendono N. vitripennis suscettibile di lavorare includono tempi di breve generazione (~ 2 settimane a 25 °C), alti tassi di riproduzione, facile separazione sessuale nella fase pupale e la capacità di diapausa e conservare ceppi a 4 °C. Il ciclo di vita inizia con le vespe femminili che parassitano le pupe della mosca soffiata, Sarcofago bullata. Attraverso il loro ovopositore, le femmine depongono fino a 50 uova nel caso pupale della mosca. Le uova si sviluppano in larve che si nutrono della pupa di S. bullata, continuano a svilupparsi nei prossimi giorni e poi si impupano, seguite dall'eclosion adulta e dall'emergere dal pupariumospite 9.
Sono disponibili strumenti molecolari per eseguire studi genetici funzionali in N. vitripennis, come l'interferenza dell'RNA (RNAi)10 e CRISPR/Cas911, 12, ma sono limitati, principalmente a causa delle difficoltà nell'esecuzione di microiniezioni embrionali13. Poiché le uova di N. vitripennis richiedono un ospite pupale per lo sviluppo, la manipolazione delle uova è molto impegnativa. Gli embrioni allo stadio pre-blastoderma devono essere raccolti dalle pupe della mosca soffiata ospite, rapidamente microiniettati e immediatamente trasferiti all'ospite per lo sviluppo13. Questi passaggi richiedono precisione e allenamento specializzato per evitare di danneggiare gli embrioni microiniettati o gli ospiti pupali13. Inoltre, le uova sono molto piccole e fragili, specialmente dopo le microiniezioni, con un citoplasma molto viscoso che causa un intasamento continuo dell'ago iniettabile13. Queste caratteristiche rendono le microiniezioni embrionali eccezionalmente impegnative, richiedendo operatori altamente qualificati e attrezzature specializzate assenti nella maggior parte dei laboratori N. vitripennis.
L'ottimizzazione di metodi di iniezione alternativi per la consegna di reagenti CRISPR contribuirebbe al consolidamento di N. vitripennis come organismo modello. La manipolazione di pupe e adulti è meno impegnativa rispetto alla manipolazione degli embrioni e può essere eseguita con una configurazione di iniezione di base. Qui vengono descritti due protocolli per l'iniezione di pupe e adulti: uno che coinvolge attrezzature specializzate per iniezioni e l'altro che comporta l'uso di un gruppo di tubi aspiratori dotato di un ago capillare in vetro. L'uso di un tubo aspiratore è particolarmente adatto per i laboratori che non hanno accesso a apparecchiature specializzate per microiniezioni embrionale. Vengono dimostrate iniezioni efficienti di diverse fasi di sviluppo di N. vitripennis, tra cui pupe bianche o nere e vespe adulte. Le vespe allo stadio pupale bianco sono particolarmente adatte per esperimenti di abbattimento mediati da RNAi. Sebbene RNAi in Nasonia sia stato descritto per la prima volta da Lynch e Desplan nel 200610, non è disponibile alcuna procedura visiva per il modo in cui vengono eseguite le iniezioni RNAi. RNAi è stato recentemente utilizzato per scoprire il gene aploidizzatore del PSR del cromosoma B (Rapporto sessuale paterno)3 e per studiare il coinvolgimento del gene dell'orologio, periodo, nei ritmi biologici N. vitripennis 7.
Pupe nere e vespe adulte possono essere utilizzate per indurre l'editing genico della linea germinale CRISPR /Cas9 utilizzando protocolli ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) e BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Questi due metodi di somministrazione dell'ovaio sono stati recentemente descritti come efficaci in Nasonia per generare mutazioni germinali nel gene bersaglio, cinabro7,12. Qui, viene fornito un protocollo semplificato per le iniezioni che include una procedura visiva di una metodologia passo-passo per iniezioni sia pupali che adulte che possono essere utilizzate per generare studi di genetica funzionale a Nasonia e probabilmente in altre vespe parassitoidi, senza richiedere attrezzature specializzate e bypassando le microiniezioni embrionali.
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Protocol
1. Allevamento nasonia
- Impostare ~ 20 femmine accoppiate singolarmente in piccole provette di vetro collegate con cotone.
NOTA: Per ridurre lo spazio di allevamento, 10 x 85 cm, i tubi da 4 ml sono ottimali. Le femmine si distinguono facilmente dai maschi a causa delle ali più grandi e della presenza dell'ovopositore (Figura 1A). Protocolli dettagliati per l'allevamento di N. vitripennis si trovano anche in altreletterature 13,14,15.- Aggiungere due host S. bullata per tubo e mantenere le vespe a 25 ± 1 °C e 30% di umidità relativa, con un ciclo luce-buio 12:12 per 2-3 giorni.
NOTA: Le vespe possono essere mantenute a temperatura più bassa o a temperatura ambiente; tuttavia, lo sviluppo sarà rallentato.
- Aggiungere due host S. bullata per tubo e mantenere le vespe a 25 ± 1 °C e 30% di umidità relativa, con un ciclo luce-buio 12:12 per 2-3 giorni.
- Dopo 2-3 giorni, con l'aiuto di un pennello a punta fine, rimuovere delicatamente le femmine per evitare ovideposizione continua e astronia nello sviluppo della prole.
NOTA: le femmine rimosse possono facoltativamente essere ri-ospitate o conservate a 5 °C per un massimo di un mese.- Mantenere l'ospite parassitato a 25 °C e al 30% di umidità relativa, con un ciclo luce-buio 12:12 per 7 giorni se lo stadio di iniezione desiderato richiede pupe bianche; per 13 giorni se lo stadio di sviluppo richiesto è pupe nere; o 14 giorni per giovani adulti appena emersi.
NOTA: Le pupe gialle e nere possono anche essere conservate a 5 °C per un massimo di una settimana. Una conservazione più lunga aumenterà la frequenza della diapausa nelle larve per la prossima generazione, rendendo più difficile lo screening post-iniezione e la creazione di linee mutanti. - Aprire il puparium ospite con un ago sezionante per recuperare n. vitripennis pupe e adulti nella fase desiderata(Figura 1A).
NOTA: Per le iniezioni in una particolare età adulta o per la raccolta di femmine vergini, si consiglia di rimuovere le pupe scure il giorno 13 dall'ospite, separate dal sesso, e raccogliere gli adulti dopo l'emergenza.
- Mantenere l'ospite parassitato a 25 °C e al 30% di umidità relativa, con un ciclo luce-buio 12:12 per 7 giorni se lo stadio di iniezione desiderato richiede pupe bianche; per 13 giorni se lo stadio di sviluppo richiesto è pupe nere; o 14 giorni per giovani adulti appena emersi.
2. Allineamento delle pupe bianche e nere
- Preparare uno scivolo di vetro applicando una linea di colla scolastica al centro. Stendere la colla con un ago di sezionazione per ottenere uno strato spesso (Figura 1B), che verrà utilizzato per allineare le pupe. Lasciare asciugare la colla per ~ 2 minuti prima di trasferire le pupe.
NOTA: Non inceffezionare escolare la colla, altrimenti le pupe non saranno correttamente attaccate allo scivolo e scivoleranno durante le iniezioni. - Al microscopio sezionato, utilizzando l'ago di sezionazione, applicare la colla sul retro della testa della pupa.
- Attaccare la pupa allo strato di colla sullo scivolo con l'addome rivolto verso l'alto. Allineare 20-30 pupe fianco a fianco sullo scivolo (Figura 1C).
NOTA: Evitare di toccare l'addome con la colla ed evitare di immergere le pupe nella colla; altrimenti, gli adulti non saranno in grado di emergere. - Posizionare lo scivolo con le pupe in una piastra di Petri per lasciare asciugare la colla per ~ 10 minuti. Prima di iniziare le iniezioni, testare l'aderenza delle pupe alla colla spingendole delicatamente con l'ago di sezionazione. Se la maggior parte delle pupe viene allentata, preparare una nuova diapositiva. In alternativa, rimuovere tutte le pupe sciolte e procedere a iniettare quelle correttamente attaccate alla diapositiva.
3. Preparazione dell'ago
- Caricare un tubo di vetro capillare in un estrattore di ago e tirare gli aghi seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: In questa dimostrazione vengono utilizzati un estrattore di aghi a filamento di platino P-1000 e capillari in vetro silicato di alluminio. Il manuale d'uso di questo strumento (vedi Tabella dei materiali)spiega come caricare correttamente tubi di vetro capillari e impostare programmi su questo strumento. Utilizzare i seguenti parametri (Calore: 536; Trazione: 80; Vel: 100; Ritardo: 70) sui capillari in vetro silicato di alluminio per iniettare pupe gialle, pupe nere e adulti.
Inoltre, l'estrattore ad ago P-2000 è stato utilizzato per preparare aghi al quarzo seguendo iparametri (Calore: 805; Trazione: 145; Vel: 50; Ritardo: 145). Il manuale fornisce istruzioni per il caricamento di tubi di quarzo capillari e l'installazione di programmi in questo strumento. In assenza di estrattore, è disponibile un vetro capillare personalizzabile. - Caricare l'ago con 5 μL della miscela di iniezione (preparata in anticipo seguendo i protocolli precedenti per iniezioni di ribonucleoproteina12 (RNP) RNAi10 o CRISPR/Cas9 in N. vitripennis)utilizzando punte di pipetta microloader.
NOTA: Durante la dimostrazione, l'ago viene caricato con RNA a doppio filamento (dsRNA) combinato con colorante rosso (vedi Tabella dei materiali)per l'iniezione di pupe a stadio bianco e con BAPC-Cas9-sgRNA per iniezione di vespe pupe nere e adulti. Questi reagenti prendono di mira il gene cinabro. Le vespe abbattute / fuori con successo mostreranno occhi rossi invece degli occhi marroni di tipo selvaggio. - Aprire l'ago, facendo scorrere la punta su una superficie composta da due diapositive sovrapposte (Figura 1D). In alternativa, aprire la punta dell'ago con un paio di pini fini per creare un bordo affilato o perforando lentamente il torace o l'addome della vespa.
4. Iniezione pupale con femtojet
- Posizionare la diapositiva con le pupe allineate al microscopio di sezionazione. Inserire l'ago nel tubo di iniezione del femtojet e stringere la testa di presa.
- Guardando l'ago al microscopio, accendere il femtojet e impostare i parametri di iniezione pc e pi ruotando le manopole rotanti.
NOTA: Un valore pc di 600 hPa è consigliato per un flusso continuo del liquido. Il valore del Pc dipende dall'apertura dell'ago. Per gli aghi preparati utilizzando i parametri indicati nell'estrattore dell'ago P-1000, i valori del Pc tra 500 hPa e 700 hPa producono un flusso costante. Se sono richiesti valori più bassi di Pc, ciò indica che l'apertura potrebbe essere troppo grande e potrebbe danneggiare gli insetti, mentre valori più alti indicano che l'ago è ancora chiuso o che l'apertura è troppo piccola. - Inserire con cura l'ago tra i 2 e i 3 segmenti addominali visibili con un angolo verticale di circa 30°(Figura 1E). Iniettare un flusso continuo fino a quando l'intero addome diventa rosa nel caso di pupe a stadio bianco o fino a quando l'addome aumenta di dimensioni nel caso di pupe nere. Interrompere l'iniezione quando è chiaro che l'addome non può assumere altro liquido o quando il liquido inizia a fluire fuori dal corpo. Spostarsi con attenzione alla pupa successiva e ripetere questi passaggi.
NOTA: Evitare di toccare e danneggiare l'ovopositore con l'ago durante l'iniezione. - Trasferire lo scivolo con le pupe iniettate in una piastra di Petri contenente un tovagliolo di carta imbevuto di acqua deionizzata per mantenere l'umidità. Coprire il piatto con il coperchio e posizionarlo a 25 °C fino all'emergere della vespa(Figura 1F).
5. Iniezione pupale con tubo aspiratore
- Calcolare la quantità di miscela di iniezione utilizzando il fattore: 4 pupe iniettate/1 μL soluzione.
NOTA: Un'iniezione tipica di 20-30 pupe richiede ~ 5-8 μL di ribonucleoproteina (RNP) miscela di saponina complessa o RNP con BAPC12. - Allineare le pupe, come suggerito nella sezione 2, e posizionare una diapositiva con le pupe allineate al microscopio di sezionamento (Figura 1E).
- Prendere uno degli aghi capillari e rompere la punta tra due vetrini, come indicato al passaggio 3.4 (Figura 1D). Assicurarsi che la punta dell'ago sia abbastanza aperta da consentire alla soluzione di iniezione di uscire soffiando aria con la bocca, ma non troppo aperta per evitare di perdere liquido e danneggiare le pupe(Figura 1E).
NOTA: Questo passaggio è fondamentale perché l'utente utilizzerà l'aria dalla bocca per spingere la miscela di iniezione nell'emolinfa dell'insetto. È meglio praticare in modo da accertare quale tipo di apertura dell'ago è ottimale per la viscosità di una particolare miscela di soluzioni. Cinque set di iniezioni di 20 pupe per set possono essere sufficienti per abituarsi al sistema di iniezione della bocca. - Caricare un ago con la soluzione di ribonucleoproteina12 utilizzando una punta di microcarico e inserire l'ago nel pacchetto di connettori dell'assieme del tubo aspiratore.
NOTA: Durante la dimostrazione, l'ago viene caricato con BAPC-Cas9-sgRNA che prende di mira il gene cinabro Nasonia 12. - Inserire con cura l'ago tra i 2 e i 3 segmenti addominali visibili con un angolo verticale di circa 30°(Figura 1E). Iniettare un flusso continuo fino a quando l'intero addome diventa rosa nel caso di pupe a stadio bianco o fino a quando l'addome aumenta di dimensioni nel caso di pupe nere. Interrompere l'iniezione quando è chiaro che l'addome non può assumere più liquido o quando il liquido inizia a fluire fuori dal corpo. Spostarsi con attenzione alla pupa successiva e ripetere questi passaggi
NOTA: Evitare di toccare e danneggiare l'ovopositore con l'ago durante l'iniezione. - Trasferire lo scivolo con le pupe iniettate in una piastra di Petri contenente un tovagliolo di carta imbevuto di acqua deionizzata per mantenere l'umidità. Coprire il piatto con il coperchio e posizionarlo a 25 °C fino all'emergere della vespa(Figura 1F).
6. Iniezione per adulti con tubo aspiratore
- Per la preparazione degli adulti, gruppi separati di 20 femmine vergini in una piccola provetta pulita con un pennello fine. Posizionare il tubo sul ghiaccio per 5 minuti fino a quando le femmine non vengono anestetizzate. In alternativa, le femmine possono essere anestetizzate e iniettate utilizzando CO2.
NOTA: Il ghiaccio è preferibile come anestetico in quanto le vespe adulte sono tolleranti al freddo e si riprendono facilmente dopo le iniezioni. Le femmine possono assumere più liquido iniettato rispetto alle pupe: 1 μL di soluzione può essere utilizzato per tre femmine invece che per quattro pupe. Preparare i volumi di conseguenza. - Preparare un secchio di ghiaccio, posizionando uno scivolo di vetro sopra il ghiaccio. Allineare le femmine fianco a fianco sullo scivolo freddo con gli addome rivolti verso l'alto (Figura 1E) sotto un mirino di sezionazione.
- Caricare un ago con la soluzione di ribonucleoproteina12 utilizzando una punta di microcarico e inserire l'ago nel pacchetto di connettori dell'assieme del tubo aspiratore. Sostenere le femmine dal lato opposto con aghi di sezionazione smussati mentre si inietta lentamente nell'addome dall'altro lato. Evitare di toccare l'ovopositore, ciò danneggerà gravemente questa struttura riproduttiva critica (Figura 1E).
NOTA: entrambi gli orientamenti sono accettabili, a seconda delle preferenze dell'operatore. - Inserire con cura l'ago tra i 2 e i 3 segmenti addominali visibili con un angolo verticale di circa 30°(Figura 1E). Iniettare la soluzione nell'addome femminile, fermandosi quando non può entrare più liquido o quando si osserva una perdita di soluzione in eccesso. Spostarsi con attenzione alla vespa successiva e ripetere questi passaggi
NOTA: Iniettare lentamente, lasciando l'ago all'interno dell'addome per circa 3 s prima di rimuoverlo molto lentamente. Ciò aiuterà a regolare la pressione interna del liquido ed evitare perdite di soluzione dal sito di iniezione dopo la rimozione dell'ago. - Al termine, trasferire delicatamente singole femmine iniettate in un nuovo tubo con un ospite utilizzando un pennello. Lasciare recuperare a temperatura ambiente per circa 1 h, confermando la sopravvivenza, quindi riportare i tubi all'incubatore di allevamento.
NOTA: Durante la dimostrazione, l'ago viene caricato con BAPC-Cas9-sgRNA che prende di mira il gene cinabro Nasonia 12.
7. Cura post-iniezione e screening mutante
- Dopo l'esclusione adulta dalle pupe iniettate, posizionare singole vespe in un tubo di vetro collegato con cotone e inserire un ospite S. bullata (Figura 1G). Al contrario, posizionare le femmine iniettate in singoli tubi con ospiti immediatamente dopo l'iniezione.
- Per gli esperimenti knockout CRISPR/Cas9, consentire alle femmine di parassitare gli ospiti per un giorno e sostituire l'ospite ogni giorno per tre giorni consecutivi.
NOTA: A causa del sistema di determinazione del sesso aplodiploide in N. vitripennis16, le femmine vergini produrranno covate maschili aploidi, il che facilita l'individuazione di mutazioni. Per il knockdown tramite RNAi di geni specifici maschili, gli individui iniettati possono essere singolarmente accoppiati con individui di tipo selvatico e autorizzati a parassitare gli ospiti. Utilizzare un host al giorno e sostituire gli host in base alla configurazione sperimentale. - Posizionare gli ospiti parassiti a 25 °C fino all'emergere della prole maschile G0 (per ~ 13-14 giorni).
- Al microscopio sezionato, schermo G0 maschi per i fenotipi mutati. Il gene cinabro è responsabile della pigmentazione oculare12:le vespe con gli occhi marroni sono di tipo selvaggio e le vespe con occhi rosso vivo o le variazioni tra gli occhi rossi e marroni sono mutanti(Figura 1H).
8. Croci e allevamento post-iniezione
- Posizionare tutti i maschi G0 mutanti con gli occhi rossi (il gene cinnabar12interrotto fenotipicamente)con femmine vergini di tipo selvatico per 1-2 giorni(Figura 2A).
NOTA: Se il gene interrotto non conferisce un fenotipo visibile, è necessaria una reazione a catena della polimerasi (PCR) seguita dal sequenziamento del gene bersaglio per identificare gli animali mutanti. Prima di ottenere il DNA dai maschi G0 per pcr, sarebbe l'ideale accoppiarli con femmine vergini di tipo selvatico. In alternativa, estrarre il DNA da una gamba di un maschio G0 per identificare i mutanti e accoppiare solo quelli con mutazioni verificate. - Aggiungere due ospiti S. bullata per femmina e lasciare ovoposit a 25 °C e 30% di umidità relativa con un ciclo luce-buio 12:12. Sostituisci i padroni di casa ogni 2-3 giorni.
- Conservare gli ospiti parassitizzati a 25 °C e al 30% di umidità relativa, con un ciclo luce-buio 12:12 per ~ 10 giorni.
- Dopo ~ 10 giorni, aprire l'ospite parassitato con un ago di sezionazione e rimuovere ogni pupa di N. vetripennis dall'ospite.
- Con l'aiuto di un pennello a punta fine, selezionare pupe femminili (Figura 1A).
NOTA: Le femmine sono diploidi ed eterozigoti, e quindi il colore degli occhi sarà di tipo selvaggio.
- Posizionare 15-20 pupe femminili in tubi di vetro a 25 °C fino all'emergenza. Dopo l'emergenza, aggiungi ~20 ospiti S. bullata e lascia che le femmine vergini G1 parassitano i padroni di casa per 2-3 giorni.
NOTA: Queste femmine produrranno il 50% di maschi mutanti G2.- Conservare gli ospiti parassitizzati a 25 °C e al 30% di umidità relativa, con un ciclo di buio chiaro 12:12 fino all'emergere adulto maschio G2.
- Posizionare le restanti pupe G1 a 5 °C per 8-10 giorni. Dopo questo periodo, rimuoverli e posizionarli a 25 °C e al 30% di umidità relativa, con un ciclo luce-buio 12:12 fino all'emergere(Figura 2A).
- Dopo l'emergere dei maschi G2 nel passaggio 8.3.1, schermo per la presenza di fenotipo mutante dagli occhi rossi. Con l'aiuto di un pennello a punta fine, separare i maschi dagli occhi rossi dai maschi di tipo selvatico.
NOTA: La presenza di vespe dagli occhi rossi in questa generazione (G2, Figura 2A) indica che l'editing genico si è verificato nella linea germinale e che la mutazione è ereditaria. - Posizionare i maschi dagli occhi rossi con le femmine G1 appena emerse nel passaggio 8.3.2 (Figura 2A), e lasciarli accoppiare per 1-2 giorni. Aggiungere 2 ospiti S. bullata per femmina e posizionarli a 25 °C e al 30% di umidità relativa con un ciclo di buio chiaro 12:12 per 10-11 giorni.
- Dopo 10-11 giorni, aprire l'ospite parassitato con un ago di sezionazione e rimuovere ogni pupa di N. vetripennis dall'ospite (Figura 2A).
- Con l'aiuto di un pennello a punta fine, separare le vespe dagli occhi rossi (maschi e femmine) dal tipo selvaggio(Figura 1H). Continuare l'allevamento di vespe dagli occhi rossi insieme in tubi di vetro e non mescolarsi con le vespe di tipo selvaggio.
NOTA: In questa fase (G3, Figura 2A),i maschi aploidi e le femmine diploidi trasportano e mostrano fenotipi per le mutazioni cinnabare. Se il gene interessato codifica per un fenotipo invisibile, attraversare G0 maschio singolarmente con una femmina di tipo selvatico per ~1 giorno. Quindi, rimuovere il maschio per la caratterizzazione molecolare della mutazione da PCR e sequenziamento, e lasciare che la femmina parassita un ospite. Continuare lo schema di incrocio solo con la prole di un maschio mutante confermato (Figura 2B). Se l'obiettivo è il knockdown da parte di RNAi di un gene candidato, eseguire il saggio funzionale desiderato (come letalità, sterilità o saggio di induzione della diapausa3,7 )direttamenteusando individui iniettati con dsRNA. Poiché RNAi è transitorio, non è possibile generare una colonia con il fenotipo desiderato (Figura 2C)3,7.
Figura 1: Cronologia per la microiniezione nasonia vitripennis pupale e adulta. (A) Le pupe bianche (in alto) e nere (in basso) sono raccolte, (B-C) allineate e incollate ad un vetrino per iniezione. (D) L'ago capillare viene preparato e aperto, facendolo scorrere su due vetrini sovrapposti. (E) L'ago è attaccato al Femtojet (in alto) o a un tubo aspiratore (in basso) per le iniezioni. (F) Le pupe iniettate sullo scivolo vengono trasferite in una piastra di Petri con un tessuto bagnato sul fondo per mantenere l'umidità. All'emergenza,le femmine (G)sono poste singolarmente in piccoli tubi di vetro e possono ovoposirsi sulla pupa di sarcofago. (H) Screening della prole per rilevare i mutanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema di incrocio dopo iniezione. Rappresentazione schematica della procedura di crossing scheme nel caso di editing genico mediato da CRISPR/Cas9 di geni (A) che inducono un fenotipo visibile e (B) che non conferiscono fenotipo visibile. (C) Rappresentazione schematica della procedura di screening RNAi. Abbreviazioni: cin = cinabro; PCR = reazione a catena della polimerasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Questo documento presenta due semplici metodi per la microiniezione pupale e adulta, utilizzando un femtojet o un tubo aspiratore. Il primo metodo consente un'iniezione più precisa di liquido, che è importante per la consistenza RNAi, mentre il secondo consente l'iniezione di maggiori quantità di liquido in pupe nasonia o adulti.
I risultati rappresentativi presentati nella tabella 1 mostrano buoni tassi di sopravvivenza (dal 20% all'89%) ed efficienza di ottenere il fenotipo desiderato (knockdown tramite RNAi o editing genico tramite CRISPR) utilizzando i metodi di iniezione descritti qui senza richiedere laboriose iniezioni di uova.
| Palco | Reagente | Concentrazione ng/μL (Proteina/gRNA o dsRNA) | N Iniettato | N Sopravvivenza (%) | Individui iniettati che depongono la prole | Individui iniettati che producono prole con fenotipi | Prole che mostra fenotipi knockdown/knockout | ||||
| N | % | N | % del totale iniettato | % di individui che producono prole | N | Mutanti/ pupe iniettate o adulti | |||||
| Pupe bianche | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | Na |
| Pupe nere | Cas9 | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| Bapc | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| Bapc | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| Bapc | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 h-48-h-old adulto | Cas9 | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| * Gli esperimenti RNAi sono stati eseguiti su maschi che sono stati poi accoppiati a femmine di tipo selvatico non iniettate. Pertanto i numeri hanno ristantito il numero di croci che hanno prodotto prole e quelle che hanno prodotto fenotipi. | |||||||||||
| ** Prima iniezione sulle pupe da parte degli autori. Abbreviazioni: dsRNA = RNA a doppio filamento; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; BAPC = capsule peptidiche anfifile ramificate. | |||||||||||
Tabella 1: Tasso di sopravvivenza ed efficienza di RNAi e CRISPR/Cas9 tramite iniezioni pupali e adulte. L'efficienza negli esperimenti RNAi rappresenta l'efficienza nella abbattimento del gene di interesse, conferendo un effetto misurabile come la distorsione del rapporto tra isessi 3. Per CRISPR/Cas9, l'efficienza rappresenta il numero di femmine iniettate che producono prole mutante. Abbreviazioni: dsRNA = RNA a doppio filamento; gRNA = RNA guida; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; BAPC = capsule peptidiche anfifile ramificate.
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Discussion
Con il recente aumento dell'uso di Nasonia vitripennis come organismo modello per varie questioni biologiche2,3,7,17, è necessario sviluppare e ottimizzare metodi di iniezione per consentire un protocollo semplificato ed efficiente per l'analisi funzionale dei geni N. vitripennis. Gli attuali metodi che prevedono la microiniezione embrionale di reagenti per l'editing genicosono impegnativi 13,richiedendo attrezzature specializzate e personale altamente qualificato. Pertanto, per rendere la tecnologia di editing genico più accessibile ai laboratori non specializzati, è fondamentale sviluppare approcci alternativi di somministrazione dei reagenti CRISPR. Pertanto, qui è dimostrata una tecnica visiva dettagliata che descrive due procedure di iniezione alternative per consentire la consegna di reagenti di modifica (CRISPR / Cas9 o dsRNA) in emolinfa di insetti e ovaie.
L'iniezione di dsRNA nell'emocoel dell'insetto è un approccio comune per fornire dsRNA in varie specie di artropodi18,19,20,21,22. È anche efficiente in N. vetripennis se usato in pupe bianche, come riportato in precedenza3,7. I metodi CRISPR/Cas9 per la mutagenesi degli insetti germinali si basano quasi esclusivamente su microiniezioni embrionali. Pochi esperimenti di successo che consegnano reagenti CRISPR in ninfe o adulti sono statisegnalati 12,23,24,25,26,27. Nel complesso, i metodi qui descritti offrono una serie di vantaggi significativi rispetto ai metodi esistenti13. In primo luogo, consentono l'iniezione di diversi stadi di sviluppo delle vespe N. vitripennis: pupe bianche, nere e adulti. Inoltre, l'iniezione nell'emolinfa consente di abbattere tramite RNAi o l'editing genico della linea germinale tramite CRISPR, bypassando le microiniezioni embrionali.
Il primo passo di questo protocollo è determinare e schermare le vespe nasonia per il giusto stadio di sviluppo in base al test funzionale di interesse (ad esempio, editing del genoma, RNAi). È importante abituarsi a identificare entrambi i sessi in pupe bianche e scure e adulti. N. le femmine di vetripentini depongono fino a cinquanta uova nel caso pupale della mosca, S. bullata,e le pupe di vespa possono essere facilmente raccolte e schermate in gran numero, a partire dallo stadiobianco. Inoltre, la possibilità di conservare pupe in diverse fasi per rallentare il tasso di sviluppo per settimane a 5 °C rende il sistema molto flessibile in termini di tempo e organizzazione9.
La sopravvivenza delle pupe e degli adulti dopo l'iniezione è un aspetto che deve essere ottimizzato dagli utenti. Ad esempio, in questo protocollo, la prima iniezione di reagenti CRISPR/Cas9 nelle pupe ha influenzato drammaticamente la sopravvivenza (15%) rispetto alla sopravvivenza degli adulti iniettati (90%). Tuttavia, nella seconda sessione, la sopravvivenza delle pupe è aumentata fino al 60%. Dopo diverse sessioni di iniezione, è stato possibile mantenere una sopravvivenza simile (80%-100%) dopo aver iniettato pupe o adulti. Infatti, la sopravvivenza dopo l'iniezione può essere migliorata se vengono ottimizzati i parametri relativi all'allineamento delle vespe, alla selezione dell'apertura giusta per l'ago ed evitare di perforare o pugnalare le vespe con l'ago.
Allineare e preparare pupe e femmine per le iniezioni, sulla base del protocollo qui presentato, può ridurre la mortalità. Inoltre, il metodo presentato per allineare le pupe immobili incollandole allo scivolo può facilitare il processo di iniezione, perché impedisce loro di muoversi durante l'iniezione. Pertanto, le pupe possono quindi essere iniettate molto rapidamente, superando la natura dispendiosa in termini di tempo dei passaggi coinvolti nelle microiniezioni embrionali. Inoltre, poiché le iniezioni possono essere fatte con un aspiratore di bocca, non è necessaria alcuna apparecchiatura specializzata per realizzare eventi di editing genico. Tuttavia, questa tecnica richiede che le vespe siano posizionate in modo tempestivo sulla colla; in caso contrario, non saranno correttamente attaccati e scivoleranno fuori dalla diapositiva durante l'inserimento dell'ago. Questo può essere corretto dopo diverse prove di allineamento.
Gli adulti non possono essere allineati usando questo metodo perché possono muovere l'addome e le gambe; quindi, hanno bisogno di essere anestetizzati. Il metodo preferito di scelta in questo protocollo consiste nel posizionare il tubo contenente le vespe nel ghiaccio per ~ 5 minuti fino a quando le vespe non vengono abbattute, e quindi trasferirle in gruppi in uno scivolo pre-refrigerato sul ghiaccio. Questo metodo consente l'allineamento e la preparazione delle vespe per iniezione in gruppi di 10-15 vespe rivolte verso l'alto, con una nuova piastra di Petri contenente ghiaccio per ogni nuovo gruppo di iniezione. Prevenire lo scioglimento del ghiaccio durante l'iniezione aiuterà a mantenere stabile lo scivolo e ridurre il rischio di rompere gli aghi o uccidere le vespe per caso. Questo passaggio può essere migliorato utilizzando un tavolo agghiacciante, se accessibile.
In alternativa, i cuscinetti di CO2 possono essere utilizzati per anestetizzare le vespe. Per fare ciò, sarebbe necessario ottimizzare il tempo di esposizione alla CO2 durante l'iniezione e determinare gli effetti dell'esposizione alla CO2 sulla sopravvivenza e sulla fertilità, come riportato in precedenza per altrespecie 18. Un ulteriore ostacolo durante l'iniezione di adulti si basa sul metodo utilizzato per tenere iniettabile la vespa anestetizzata. Un oggetto con punta smussata che può contenere la vespa senza il rischio di piercing o accoltellamento è più adatto. In generale, gli aghi di dissezione o le pini smussate funzionano bene.
Dopo aver padroneggiato l'allineamento e la corretta tenuta delle vespe, il processo di iniezione può procedere molto rapidamente. Pupe e iniezioni di adulti possono essere iniettate con volumi di soluzione nell'intervallo di centinaia di nanolitri, facilitandone la preparazione a diverse concentrazioni in base alle preferenze dell'utente. Tuttavia, è importante utilizzare aghi adeguati per iniettare la corretta quantità di liquido senza il rischio di danneggiare e uccidere la vespa. In generale, aghi molto lunghi con aperture molto piccole sono migliori perché causano meno danni fisici all'addome delle pupe. Inoltre, il flusso del liquido è lento, evitando grandi cambiamenti di pressione e, soprattutto, prevenendo la perdita della soluzione attraverso il foro creato dall'ago.
Gli svantaggi di una piccola apertura sono che gli aghi possono rompersi facilmente quando toccano l'esoscheletro duro delle vespe e possono anche intasarsi con il materiale dall'interno dell'addome. Pertanto, i piccoli aghi ad apertura funzionano molto bene usando un femtoget o un nanoject e il loro uso richiede molta cura per evitare di romperli. Questi aghi non sono adatti per un aspiratore di bocca perché è molto difficile iniettare liquido con la bocca attraverso una piccola apertura. Per questo metodo, l'ago ideale richiede l'apertura minima che consente alla soluzione di fluire senza intoppi prevenendo i danni che possono essere causati con un grande ago di apertura. Ancora una volta, questo aspetto deve essere ottimizzato dagli utenti. In ogni caso, cambiare spesso l'ago aiuterà a evitare l'intasamento e danneggiare la punta che ridurrà la sopravvivenza e l'efficienza.
In N. vitripennis, qualsiasi posto nell'addome può essere utilizzato per fornire reagenti nell'emolinfa. Tuttavia, è necessario prestare particolare attenzione per evitare danni all'ovopositore della vespa in quanto questo viene utilizzato per l'alimentazione e la deposizione delle uova. Sia per le pupe che per gli adulti, in questo protocollo sono state suggerite tecniche di immobilizzazione per consentire l'iniezione lontano dall'ovopositore, principalmente nell'area ventrale verso la parte anteriore dell'addome. Inoltre, negli adulti, questo può essere ottenuto anche iniettando sui lati o nella zona dorsale. Il metodo di allineamento per le pupe descritto nel presente documento può facilitare l'iniezione laterale, ma non dorsale. In ogni caso, gli sforzi per prevenire il piercing di altre parti del corpo o danneggiare l'addome sono una priorità.
Una volta inserito l'ago, il flusso del liquido dovrebbe essere lento e costante. Il femtojet lo consente facilmente, anche se la pressione potrebbe essere necessario regolare per ogni ago. Quando si utilizza un aspiratore bocca, l'iniezione di grandi quantità di liquido troppo veloce dovrebbe essere evitata perché ciò potrebbe causare la perdita attraverso il poro dell'iniezione. Infatti, oltre ad osservare il gonfiore dell'addome con liquido, la perdita è un segno per fermare un'iniezione. Al termine dell'iniezione, le vespe adulte devono essere lasciate sullo scivolo fino a quando non si recuperano e quindi trasferite in un tubo con ospiti.
I sistemi qui presentati possono essere facilmente adattati ad altre specie di insetti che sono particolarmente impegnative per le microiniezioni di uova. Ad esempio, molte vespe parassitoidi depongono le uova in altre larve di insetti. Le uova sono quindi impossibili da raggiungere e iniettare in quelle specie. Anche le uova di altre specie di parassiti, come la psillide asiatica di agrumata Diaphorina citri, sono molto difficili da raggiungere per l'iniezione perché sono attaccate alla pianta in cui vengono deposte. Un recente rapporto suggerisce che bapc può essere utilizzato per l'editing genico CRISPR nello psillidi agrumato asiatico, D. citri27. Allo stesso modo, l'erogazione mediata da P2C della proteina, mCherry, è stata effettuata nelle ovaie diquesta specie 28, suggerendo che queste tecniche di iniezione descritte qui potrebbero facilitare l'implementazione di RNAi e CRISPR in una vasta gamma di specie di insetti nocivi e aiutare a progettare strategie di controllo che aiutano a prevenire i danni alle colture ad essi associati.
L'implementazione in altre specie richiede un'ottimizzazione basata sul ciclo di vita delle specie di interesse. Ad esempio, è importante stabilire la giusta fase di iniezione anche sulla base del test funzionale di interesse. Pertanto, per la consegna di CRISPR/Cas9 nelle ovaie, è importante sapere quando la vitellogenesi è attiva per consentire l'assorbimento dei reagenti di editing genico da parte delle ovaie24,25,26,27,28. Al contrario, per un'efficace abbattimento, è importante sapere quando il gene è espresso e funzionale. La futura implementazione di tali tecniche di iniezione potrebbe comportare la consegna di diversi tipi di acidi nucleici, come il DNA plasmide, in emolinfa e ovaie di insetti. Ciò consente di promuovere l'espressione transitoria dei geni presenti nel DNA plasmide. Inoltre, combinare il reagente CRISPR/Cas con un DNA modello potrebbe aiutare a mediare la transgenesi tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) o indurre una transgenesi mediata da transposon, aggirando la microiniezione embrionale. In conclusione, questa tecnica migliorata può essere utilizzata per generare molti tipi di analisi funzionale, come il knockdown tramite RNAi, l'induzione di mutazioni, deduzioni e possibilmente anche inserimenti transgenici per generare N. vitripennis transgenico,associando trasposoni con BAPC, che dovrebbe accelerare notevolmente la ricerca funzionale in questo organismo.
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Disclosures
JLR e DCR hanno presentato istanza di protezione brevettuale provvisoria sulla tecnologia remot control. O.S.A è uno dei fondatori di Agragene, Inc., ha una partecipazione azionaria e fa parte del Scientific Advisory Board della società. Tutti gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da fondi di avviamento UCSD diretti a O.S.A. e NSF/BIO 1645331 a J.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
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