Summary
여기서, 우리는 NASOnia vitripennis에 있는 효율적인 pupal 및 성인 주사를 위한 방법을 태아 micro주입에 접근하는 대안으로, RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 유전자 녹아웃을 통해 RNA 침묵을 사용하여 관심있는 유전자의 기능적 분석을 가능하게 하는 방법을 기술합니다.
Abstract
보석 말벌, 나소니아 vitripennis,haplo-diploid 성 결정의 후성 유전학을 연구 하는 효율적인 모델 시스템 되고있다, B 염색체 생물학, 호스트 공생 상호 작용, speciation, 그리고 독 합성. CRISPR/Cas9를 포함하여 몇몇 분자 공구의 가용성에도 불구하고, 기능적인 유전 연구는 아직도 이 유기체에서 제한됩니다. N. vitripennis에 CRISPR/Cas9 기술을 적용하는 주요 제한은 배아 미세 주입의 도전에서 비롯됩니다. 배아의 주사는 작은 배아 크기와 배아 발달을 위한 호스트 강아지의 요구 사항 때문에 이 유기체 및 일반적으로 많은 기생말에서 특히 어렵습니다. 이러한 과제를 해결하기 위해 Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체는 배아 미세 주입이 아닌 성인 주사에 의한 여성 난소로의 복합 전달을 최적화하여 체세포 및 헤플라일성 세균 편집을 모두 생성했습니다. 주사 절차는 ReMOT 제어 (화물의 수용체 매개 난소 트랜스듀션) 또는 BAPC (분기 수륙 양용 펩티드 캡슐)를 사용하여 pupae및 여성 말벌에 최적화되었다. 이 방법은 사이트 특정 및 유전 성 생식선 돌연변이를 가능하게 하는 배아 주입에 효과적인 대안으로 표시됩니다.
Introduction
CRISPR/Cas9 유전자 편집은 기능성 유전 연구를 위한 강력한 기술이며, 특히 보석 말살, 나소니아 vitripennis와같은 많은 상승 모델 유기체에서. 사육의 용이성과 완전한 게놈의 가용성은 보석 말벌이 다른 생물학적 과정의 분자 메커니즘을 해명하기위한 중요한 실험 시스템입니다. 예를 들어, N. vitripennis는 최근에 haplodiploid 성 결정 시스템1,2,B 염색체3,4,5,6의생물학의 후성 유전학 적 기초를 해명하는 데 사용되었으며, circadian 및 계절 적조절7,8에대한 유전적기초가있다. N. vitripennis와 함께 작동 하도록 설정 하는 기능 중 일부는 짧은 세대 시간 포함 (~25°C에서 주), 높은 재생 속도, pupal 단계에서 쉽게 섹스 분리, 그리고 4°C에서 균주를 저장 하는 능력. 라이프 사이클은 여성 말벌이 블로우플라이, 사코카하 불라타의새끼를 기생시키는 것으로 시작됩니다. 그들의 ovipositor를 통해, 암컷은 블로우 플라이의 pupal 케이스에 50 개의 계란까지 누워. 계란은 S. bullata pupa에 먹이애로 발전하고, 앞으로 며칠 동안 계속 발전하고, 그 후에 강아지, 성숙한 백과기 및 호스트 puparium9에서출현에 선행됩니다.
RNA 간섭(RNAi)10 및 CRISPR/Cas911,12와같은 N. vitripennis에서기능성 유전 연구를 수행하는 분자 도구는 사용할 수 있지만, 주로 배아 미세주입을수행하는 데 어려움이 있기 때문에 제한된다. N. vitripennis 계란 개발을 위한 pupal 호스트를 필요로 하기 때문에, 계란 조작은 매우 도전. 전 -blastoderm 단계 배아는 호스트 블로우플라이 푸파에서 수집되어야하며, 신속하게 마이크로 주입하고 즉시 개발13을위해 호스트로 다시 옮겨져야 한다. 이러한 단계는 미세 주입 된 배아 또는 pupal 호스트(13)를손상시키지 않도록 정밀하고 전문적인 훈련이 필요합니다. 더욱이, 계란은 매우 작고 깨지기 쉬운, 특히 미세 주입 후, 주입 바늘의 지속적인 막힘을 일으키는 매우 점성 세포질(13). 이러한 기능은 배아 미세 주입을 매우 어렵게 만들며, 대부분의 N. vitripennis 실험실에서 결석한 고도로 훈련된 작업자와 특수 장비를 필요로 합니다.
CRISPR 시약의 전달을 위한 대체 주입 방법의 최적화는 모델 유기체로서 N. vitripennis의 통합에 기여할 것입니다. 강아지와 성인의 조작은 배아를 조작하는 것보다 덜 도전적이며 기본 주사 설정으로 달성 될 수 있습니다. 여기서, 두 가지 프로토콜은 푸파와 성인의 주사를 위해 기술된다: 주사를 위한 특수 한 장비를 관련시키는 하나, 및 유리 모세관 바늘을 장착한 아스피레이터 튜브 어셈블리의 사용을 관련시키는 다른. 흡구관의 사용은 배아 미세 주입을 위한 특수한 장비에 접근할 수 없는 실험실에 특히 적합합니다. 백색 또는 검은 새끼와 성인 말벌을 포함하여 N. vitripennis의다른 발달 단계의 효율적인 주사가 입증됩니다. 흰색 푸팔 단계에서 말벌은 RNAi 중재 녹다운 실험에 특히 적합합니다. 나소니아에서 RNAi는 처음 린치와 Desplan에 의해 설명 되었지만 200610,RNAi 주사가 수행 되는 방법에 대 한 사용할 수 있는 시각적 절차. RNAi는 최근에 B 염색체 PSR (아버지 성비율)3의 haploidizer 유전자를 발견하고 N. vitripennis 생물학적 리듬7에서시계 유전자, 기간의참여를 연구하기 위해 사용되었다.
검은 강아지와 성인 말벌은 ReMOT 제어를 사용하여 CRISPR / Cas9 생식선 유전자 편집을 유도하는 데 사용할 수 있습니다 (화물의 수용체 매개 난소 트랜스듀션) 및 BAPC (분지 수륙 양용 펩티드 캡슐) 프로토콜. 이들 2개의 난소 전달 방법은 최근에 표적 유전자, 신나바르7,12에서생식선 돌연변이를 생성하기 위한 나소니아에서 효과적이기 위하여 기술되었다. 여기서, 간단한 프로토콜은 특수 장비를 필요로하고 배아 미세 주입을 우회하지 않고, 나소니아에서 기능적 유전학 연구를 생성하고 다른 기생 말벌에서 가능성이 있는 pupal 및 성인 주사 모두에 대한 단계별 방법론의 시각적 절차를 포함하는 주사를 위해 제공됩니다.
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Protocol
1. 나소니아 사육
- 면에 연결된 작은 유리 테스트 튜브에 단독으로 ~ 20 개의 짝을 가진 여성을 설정합니다.
참고: 사육 공간을 줄이기 위해 10 x 85cm, 4mL 튜브가 최적입니다. 여성은 더 큰 날개와 배란의 존재(도 1A)로인해 남성과 쉽게 구별됩니다. N. vitripennis를 양육하기위한 자세한 프로토콜은 다른 문학13,14,15에서찾을 수 있습니다.- 튜브당 S. bullata 호스트 2개를 추가하고 말벌을 25± 1°C 및 상대 습도 30%로 유지하며, 2-3일 동안 12:12 의 어두운 사이클을 제공합니다.
참고: 말벌은 낮은 온도 또는 실온에서 유지 관리할 수 있습니다. 그러나 개발은 느려질 것입니다.
- 튜브당 S. bullata 호스트 2개를 추가하고 말벌을 25± 1°C 및 상대 습도 30%로 유지하며, 2-3일 동안 12:12 의 어두운 사이클을 제공합니다.
- 2-3 일 후, 미세 한 팁 페인트 브러시의 도움으로, 부드럽게 자손 개발에 지속적인 oviposition 및 비동기를 피하기 위해 여성을 제거합니다.
참고: 제거된 여성은 선택적으로 최대 한 달 동안 5°C에서 다시 호스팅하거나 저장할 수 있습니다.- 기생 된 숙주25 °C 및 30 % 상대 습도에서 유지, 원하는 주입 단계가 흰색 pupae를 필요로하는 경우 7 일 동안 12:12 밝은 어두운 주기와; 필요한 발달 단계가 검은 강아지인 경우 13 일 동안; 또는 젊은, 새로 등장 성인을위한 14 일.
참고: 노란색과 검은색 푸파는 최대 1주일 동안 5°C로 저장할 수 있습니다. 저장이 길어지면 다음 세대를 위해 애벌레에서 의 투경 빈도가 증가하여 주사 후 스크리닝및 돌연변이 선의 확립이 더 어려워집니다. - 균열은 원하는 단계에서 N. vitripennis pupae와 성인을 복구하기 위해 해부 바늘로 호스트 puparium을 엽니 다(그림 1A).
참고: 특정 성인 연령의 주사 또는 처녀 암컷을 모으기 위해 13일째에 어두운 새끼를 숙주로부터 제거하고 성별에 따라 분리하고 출현 후 성인을 모으는 것이 좋습니다.
- 기생 된 숙주25 °C 및 30 % 상대 습도에서 유지, 원하는 주입 단계가 흰색 pupae를 필요로하는 경우 7 일 동안 12:12 밝은 어두운 주기와; 필요한 발달 단계가 검은 강아지인 경우 13 일 동안; 또는 젊은, 새로 등장 성인을위한 14 일.
2. 흰색과 검은 강아지의 정렬
- 중앙에 학교 접착제 라인을 적용하여 유리 슬라이드를 준비합니다. pupae를 정렬하는 데 사용되는 두꺼운 층(도 1B)을얻기 위해 해부 바늘로 접착제를 확산. pupae를 옮기기 전에 접착제를 ~ 2 분 동안 건조시키십시오.
참고 : 그렇지 않으면 pupae가 슬라이드에 제대로 부착되지 않고 주사 중에 미끄러집니다. - 해부 현미경에서, 해부 바늘을 사용하여, 강아지의 머리 의 뒷면에 접착제를 적용.
- 새끼를 슬라이드의 접착제 층에 부착하고 복부가 위를 향하도록 합니다. 슬라이드(도 1C)에나란히 20-30 pupae를 정렬합니다.
참고 : 접착제로 복부를 만지지 말고 새끼를 접착제에 잠그지 마십시오. 그렇지 않으면 성인이 나타나지 않습니다. - 페트리 접시에 강아지와 함께 슬라이드를 놓고 접착제가 ~10 분 동안 건조하게합니다. 주사를 시작하기 전에 해부 바늘로 부드럽게 밀어 접착제에 강아지의 준수를 테스트합니다. 대부분의 강아지가 느슨해지면 새 슬라이드를 준비합니다. 또는 느슨한 모든 강아지를 제거하고 슬라이드에 적절하게 부착된 푸페를 주입합니다.
3. 바늘 준비
- 한 모세관 유리 튜브를 바늘 풀러에 넣고 제조업체의 지시에 따라 바늘을 당깁니다.
참고: P-1000 플래티넘 필라멘트 바늘 풀러와 알루미늄 규산 유리 모세혈관이 이 데모에 사용됩니다. 이 기기의작동 매뉴얼(재료 표 참조)은 모세관 유리 튜브를 올바르게 적재하고 이 기기에 프로그램을 설정하는 방법을 설명합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여(열: 536; 당겨: 80; 벨: 100; 지연: 70)알루미늄 규산염 유리 모세 혈관에 노란색 pupae, 검은 강아지, 성인을 주입합니다.
또한, P-2000 바늘 풀러는 매개 변수(Heat: 805)에 따라 석영 바늘을 준비하는 데사용되었습니다. 당겨: 145; 벨: 50; 지연: 145). 이 매뉴얼은 모세관 석영 튜브를 적재하고이 악기에 프로그램 설정을위한 지침을 제공합니다. 풀러가 없는 경우, 사용자 정의 모세관 유리를 사용할 수 있습니다. - 주사 혼합물의 5 μL(RNAi10 또는 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로틴 12(RNP) 주사에 대한 이전 프로토콜에따라 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 바늘을 적재한다.
참고: 시연 도중, 바늘은 백색 단계 pupae의 주입을 위한 빨간 염료 (재료의 표참조)와 결합된 이중 좌초 RNA (dsRNA)로 로드되고 검은 pupae 말벌과 성인의 주사를 위한 BAPC-Cas9-sgRNA와 더불어. 이 시약은 시나바르 유전자를 표적으로 할 것입니다. 성공적으로 쓰러뜨리는 말벌은 야생 형 갈색 눈 대신 붉은 눈을 보여줍니다. - 바늘을 열고 두 개의 겹치는 슬라이드(그림 1D)로만든 표면의 팁을 슬라이딩합니다. 또는, 날카로운 가장자리를 만들거나 천천히 말벌의 흉부 또는 복부를 관통하여 미세 한 집게의 쌍으로 바늘의 끝을 엽니 다.
4. 펨토젯을 곁들인 푸팔 주입
- 해부 현미경 아래에 정렬 된 pupae와 슬라이드를 놓습니다. 바늘을 펨토젯의 사출 튜브에 삽입하고 그립 헤드를 조입니다.
- 현미경 의 밑에 바늘을 보고, 펨토젯을 켜고 회전 손잡이를 회전하여 PC와 Pi 주입 매개변수를 설치합니다.
참고: 액체의 연속 흐름에 600 hPa의 PC 값을 권장합니다. PC 값은 바늘의 개구부에 따라 달라집니다. P-1000 바늘 풀러에서 표시된 파라미터를 사용하여 제조된 바늘의 경우, 500hPa와 700 hPa 사이의 PC 값은 일정한 흐름을 생성한다. PC값이 낮으면 개구부가 너무 크고 곤충이 손상될 수 있음을 나타내는 반면, 값이 높을수록 바늘이 여전히 닫혀 있거나 개구부가 너무 작다는 것을 나타냅니다. - 조심스럽게 약 30 °의 수직 각도와 2 와 3 눈에 보이는 복부 세그먼트 사이에 바늘을 삽입(도 1E). 전체 복부가 흰색 단계 강아지의 경우 분홍색으로 변할 때까지 연속 흐름으로 주입하거나 검은 강아지의 경우 복부의 크기가 증가 할 때까지. 복부가 더 이상 액체를 취할 수 없다는 것이 분명하거나 액체가 몸밖으로 흘러 나올 때 주입을 중단하십시오. 다음 푸파로 조심스럽게 이동하여 다음 단계를 반복합니다.
참고: 주사 중 바늘로 난란포시터를 만지고 손상시키지 마십시오. - 주입된 푸파를 넣은 슬라이드를 열화물로 담근 종이 타월이 들어 있는 페트리 접시에 전달하여 습도를 유지합니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 말뚝이 출현 할 때까지 25 °C로 놓습니다(그림 1F).
5. 아스피레이터 튜브를 가진 푸팔 주입
- 인자를 사용하여 사출 믹스의 양을 계산합니다: 4 pupae 주입/1 μL 용액.
참고: 20-30 pupae의 전형적인 주사는 BAPC12를가진 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합 사포닌 믹스 또는 RNP의 5-8 μL을 필요로 한다. - pupae를 정렬, 섹션 2에 제안 된 바와 같이, 해부 현미경(그림 1E)에서정렬 된 pupae와 하나의 슬라이드를 배치합니다.
- 모세관 바늘 중 하나를 가지고 단계 3.4(도 1D)에표시된 바와 같이 두 개의 유리 슬라이드 사이의 팁을 깰. 바늘 팁이 입으로 공기를 불어 주입하여 외출 할 수 있도록 충분히 열려 있는지 확인하지만 액체를 잃고 강아지(그림 1E)를손상시키지 않도록 너무 열지 않습니다.
참고 : 이 단계는 사용자가 입에서 공기를 사용하여 주입 혼합물을 곤충 용혈액으로 밀어 넣을 것이기 때문에 중요합니다. 특정 용액 믹스의 점도에 가장 적합한 바늘 조리개 유형을 확인하는 것이 좋습니다. 세트당 20 pupae의 주사의 5 세트는 입 주입 시스템에 익숙해 충분할 지도 모릅니다. - 마이크로로딩 팁을 사용하여 리보뉴클레오단백질용액(12)으로 바늘 1개를 적재하고, 바늘을 흡혈구 튜브 조립체의 커넥터 팩에 삽입한다.
참고: 시연 도중, 바늘은 NASOnia cinnabar 유전자 를 표적으로 하는 BAPC-Cas9-sgRNA로 로드됩니다12. - 조심스럽게 약 30 °의 수직 각도와 2 와 3 눈에 보이는 복부 세그먼트 사이에 바늘을 삽입(도 1E). 전체 복부가 흰색 단계 강아지의 경우 또는 검은 강아지의 경우 복부의 크기가 증가 할 때까지 전체 복부가 분홍색으로 변할 때까지 연속 흐름으로 주입하십시오. 복부가 더 이상 액체를 취할 수 없거나 액체가 몸에서 흘러 나올 때 주입을 중단하십시오. 다음 푸파로 신중하게 이동하여 다음 단계를 반복합니다.
참고: 주사 중 바늘로 난란포시터를 만지고 손상시키지 마십시오. - 주입된 푸파를 넣은 슬라이드를 열화물로 담근 종이 타월이 들어 있는 페트리 접시에 전달하여 습도를 유지합니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 말뚝이 출현 할 때까지 25 °C로 놓습니다(그림 1F).
6. 아스피레이터 튜브를 가진 성인 주입
- 성인 준비를 위해, 좋은 페인트 브러시와 깨끗한 작은 테스트 튜브에 20 처녀 여성의 별도의 그룹. 여성이 마취될 때까지 튜브를 얼음 위에 5분 간 놓습니다. 대안적으로, 암컷은 CO2를사용하여 마취및 주입될 수 있다.
참고: 얼음은 성인 말벌이 감기에 관대하고 주사 후 쉽게 회복되기 때문에 마취제로서 바람직합니다. 여성은 pupae보다 더 많은 주입 된 액체를 취할 수 있습니다 : 용액의 1 μL은 4 개의 강아지 대신 3 명의 여성에게 사용할 수 있습니다. 그에 따라 볼륨을 준비합니다. - 얼음 양동이를 준비하여 얼음 위에 유리 슬라이드 를 놓습니다. 여성이 차가운 슬라이드에 나란히 정렬하여 복부를 위로 향하여(도 1E)해부 범위 하에서 정렬합니다.
- 마이크로로딩 팁을 사용하여 리보뉴클레오단백질용액(12)으로 바늘 1개를 적재하고, 바늘을 흡혈구 튜브 조립체의 커넥터 팩에 삽입한다. 반대편에서 복부에 천천히 주입하는 동안 무딘 해부 바늘로 반대쪽에서 여성을 지원합니다. 난란증을 만지지 마십시오, 이것은 심각하게이 중요한 생식 구조를 손상(그림 1E).
참고: 운영자 기본 설정에 따라 두 방향이 허용됩니다. - 조심스럽게 약 30 °의 수직 각도와 2 와 3 눈에 보이는 복부 세그먼트 사이에 바늘을 삽입(도 1E). 여성 복부에 용액을 주입하거나, 더 이상 액체가 들어갈 수 없을 때 또는 잉여 용액의 누출이 관찰될 때 중지합니다. 다음 말하로 신중하게 이동하여 다음 단계를 반복합니다.
참고 : 천천히 주입, 매우 천천히 제거하기 전에 약 3 s에 대한 복부 내부에 바늘을 두고. 이것은 내부 액체 압력을 조정하고 바늘 제거 다음 주사 사이트에서 누출 용액을 방지하는 데 도움이 될 것입니다. - 완료되면, 페인트 브러시를 사용하여 하나의 호스트와 함께 새로운 튜브에 주입 된 단일 여성을 부드럽게 전송합니다. 약 1 시간 동안 실온에서 회복하여 생존을 확인한 다음 튜브를 양육 인큐베이터로 되돌려 둡니다.
참고: 시연 도중, 바늘은 NASOnia cinnabar 유전자 를 표적으로 하는 BAPC-Cas9-sgRNA로 로드됩니다12.
7. 사출 후 관리 및 돌연변이 검사
- 주입된 푸파에서 성인 용 백과후, 면으로 연결된 유리 튜브에 단일 말벌을 넣고 S. 불라타 호스트 1개(도1G)를삽입합니다. 대조적으로, 주사 직후 호스트와 개별 튜브에 주입 된 여성을 배치.
- CRISPR/Cas9 녹아웃 실험의 경우 여성이 호스트를 하루 동안 기생시키고 매일 3일 연속으로 호스트를 교체할 수 있도록 합니다.
참고 : N. vitripennis16에서haplodiploid 성 결정 시스템으로 인해 처녀 여성은 돌연변이의 검출을 용이하게 하는 haploid 남성 무리를 생산할 것입니다. 남성 특정 유전자의 RNAi를 통해 넉다운을 위해, 주입된 개별은 야생 모형 개별과 단독으로 결합될 수 있고 호스트를 기생할 수 있었습니다. 하루에 하나의 호스트를 사용하고 실험 설정에 따라 호스트를 교체합니다. - 기생 호스트를 G0 남성 자손의 출현까지 25 °C에 놓습니다 (~13-14 일 동안).
- 해부 현미경에서, 돌연변이 된 표현형에 대한 G0 남성을 검사합니다. 신나바 유전자는 안과 색소 침착에 대한 책임이 있습니다(12): 갈색 눈을 가진 말벌은 야생 유형이며, 밝은 적색 눈 또는 빨간색 눈과 갈색 눈 사이의 변이를 가진 말벌은 돌연변이체(도 1H)입니다.
8. 사출 후 십자가 및 양육
- 1-2 일 동안 야생 형 처녀 암컷과 함께 모든 돌연변이 G0 남성 (표현이 전형적으로 중단 된 시나바르12유전자)를 놓습니다(그림 2A).
참고: 중단된 유전자가 가시적인 표현형을 부여하지 않으면, 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 그 다음에 표적 유전자의 시퀀싱이 요구되어 돌연변이 동물을 식별하는 데 필요한 것이다. PCR에 대한 G0 남성에서 DNA를 얻기 전에, 야생 형 처녀 여성과 짝짓기하는 것이 이상적 일 것이다. 양자택일로, 돌연변이를 확인하기 위하여 G0 남성의 다리에서 DNA를 추출하고, 확인된 돌연변이를 가진 사람들만 짝짓기. - 여성당 S. bullata 호스트 2개를 추가하고 12:12 의 밝은 어두운 사이클로 25°C및 상대 습도 30%에서 난란을 허용합니다. 호스트를 2-3일마다 교체합니다.
- 기생 호스트를 25°C 및 30%의 상대 습도에 저장하고 12:12 의 밝은 어두운 주기를 ~10일 동안 저장합니다.
- ~10일 후에는 해부 바늘로 기생호스트를 열고 각 N. vitripennis pupa를 숙주로부터 제거합니다.
- 미세 한 팁 페인트 브러시의 도움으로, 여성 강아지(그림 1A)를선택합니다.
참고 : 여성은 디플로이드와 이종화구이기 때문에 눈 색깔은 야생 유형이 될 것입니다.
- 15-20 암컷 새끼를 유리 튜브에 25°C에서 25°C로 놓습니다. 출현 후 ~ 20 S. bullata 호스트를 추가하고 처녀 G1 여성이 2-3 일 동안 호스트를 기생시키십시오.
참고 : 이 여성은 50 % G2 돌연변이 남성을 생산할 것입니다.- G2 남성 성인이 출현할 때까지 12:12 의 밝은 -어두운 사이클로 25 °C 및 30 %의 상대 습도에서 기생 호스트를 저장합니다.
- 나머지 G1 푸파를 5°C에서 8-10일 동안 놓습니다. 이 기간 이후에는 이를 제거하고 25°C 및 상대 습도 30%로 배치하고, 12:12의 밝은-어두운 사이클이 출현할때까지(그림 2A).
- 8.3.1 단계에서 G2 남성의 출현 후, 적목 돌연변이 표현형의 존재를 위한 화면. 미세 한 팁 페인트 브러시의 도움으로, 야생 유형 남성에서 붉은 눈 의 남성을 분리.
참고: 이 세대에 적눈 말벌의 존재 (G2, 그림 2A)는유전자 편집이 생식선에서 발생했음을 나타내며 돌연변이가 유전적임을 나타냅니다. - G1 암컷을 가진 적목 수컷을 8.3.2 단계(그림 2A)에새롭게 등장시키고 1-2 일 동안 짝짓게하십시오. 여성 당 2 S. 불라타 호스트를 추가하고 10-11 일 동안 12:12 밝은 어두운 주기로 25 ° C 및 30 %의 상대 습도에 배치하십시오.
- 10-11일 후, 해부 바늘로 기생호스트를 열고 각 N. vitripennis pupa를 숙주(그림2A)에서제거합니다.
- 미세 팁 페인트 브러시의 도움으로, 야생 유형(그림 1H)에서별도의 적목 말벌 (남성과 여성). 유리 튜브에서 함께 빨간 눈 말벌의 양육을 계속하고 야생 형 말벌과 혼합하지 않습니다.
참고 : 이 단계에서 (G3, 그림 2A),haploid 남성 및 디플로이드 여성은 신나바르 돌연변이에 대한 표현형을 수행하고 보여줍니다. 영향을 받는 유전자가 보이지 않는 표현형에 대해 인코딩하는 경우, G0 남성을 단독으로 교차하여 1일 동안 하나의 야생 형 암컷을 한 명만 교차합니다. 이어서, PCR 및 시퀀싱에 의한 돌연변이의 분자 특성화를 위해 남성을 제거하고, 여성이 숙주를 기생하게 한다. 확인된 돌연변이 수컷(도2B)의자손만으로 횡단 방식을 계속한다. 목표가 응시유전자의 RNAi에 의한 녹다운인 경우, DsRNA에 주입된 개인을 직접 사용하여 원하는 기능적 분석(예: 치사, 멸균, 또는 투경 유도 분석3,7)을수행한다. RNAi는 일시적인, 원하는 표현형(도 2C)3,7로식민지를 생성할 수 없다.
그림 1: 푸팔과 성인 나소니아 vitripennis 미세주입에 대한 타임 라인. (A)남성 및 여성 흰색(위쪽) 및 검은색(아래쪽) 푸파가 수집되고,(B-C)접착제를 유리 슬라이드에 정렬하여 주입한다. (D)모세관 바늘이 준비되고 열리고 두 개의 겹치는 슬라이드에 슬라이딩합니다. (E)바늘은 펨토젯(상단) 또는 주사용 흡기튜브(아래쪽)에 부착된다. (F)슬라이드에 주입된 푸파는 습도를 유지하기 위해 바닥에 젖은 티슈가 있는 페트리 접시로 옮겨집니다. 출현시(G)암컷은 작은 유리튜브에 단독으로 배치되어 석관 푸파에 배란할 수 있다. (H)돌연변이를 검출하기 위해 자손의 선별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 주입 후 횡단 방식. 눈에 보이는 표현형을 유도하는 유전자(A)의 CRISPR/Cas9 중재 유전자 편집의 경우 교차 방식 절차의 회로도 표현및 가시적인 표현형을 부여하지 않는 (B). (C) RNAi 스크리닝 절차의 회로도 표현. 약어 : 신 = 시나바르; PCR = 폴리머라제 연쇄 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
이 논문은 펨토젯 또는 흡기 튜브를 사용하여 pupal 및 성인 미세 주입을위한 두 가지 쉬운 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 RNAi 일관성에 중요한 액체를 보다 정밀하게 주입할 수 있지만 두 번째 방법은 나소니아 푸파또는 성인에게 더 많은 양의 액체를 주입할 수 있게 합니다.
표 1에 제시된 대표적인 결과는 좋은 생존율을 보여줍니다 (20%에서 89%). 그리고 힘든 계란 주사를 요구하지 않고 여기에 설명 된 주입 방법을 사용하여 원하는 표현형 (RNAi 또는 CRISPR을 통해 유전자 편집을 통해 노크 중 하나)를 얻기의 효율.
| 무대 | 시약 | 농도 ng/μL (단백질/gRNA 또는 dsRNA) | N 주입 | N 생존 (%) | 자손을 낳는 주입 된 개인 | 표현형을 가진 자손을 생산하는 주입된 개별 | 노크다운/녹아웃 표현형을 보여주는 자손 | ||||
| N | % | N | 주입된 총 중 % | 자손을 생산하는 개인의 % | N | 돌연변이/주입된 강아지 또는 성인 | |||||
| 화이트 푸파 | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | NA |
| 블랙 푸파 | Cas9 | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| BAPC | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 h-48-h-늙은 성인 | Cas9 | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| *RNAi 실험은 그 때 비 주입 야생형 암컷에 짝짓기 된 남성에 수행되었다. 따라서 숫자는 자손을 생산하는 십자가의 수와 표현형을 생산한 십자가의 수를 재구성합니다. | |||||||||||
| ** 저자에 의해 강아지에 매우 첫 번째 주입. 약어: dsRNA = 이중 좌초 RNA; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; BAPC = 분지 양용 펩티드 캡슐. | |||||||||||
표 1: 퓨팔 및 성인 주사를 통해 RNAi 및 CRISPR/Cas9의 생존 및 효율 속도. RNAi 실험의 효율은 관심 유전자의 녹다운효율을 나타내며, 성비 왜곡3과같은 측정 가능한 효과를 부여한다. CRISPR/Cas9의 경우 효율성은 돌연변이 자손을 생산하는 주입된 여성의 수를 나타냅니다. 약어: dsRNA = 이중 좌초 RNA; gRNA = 가이드 RNA; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; BAPC = 분지 양용 펩티드 캡슐.
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Discussion
최근 나소니아 비트리피스니체의 다양한 생물학적 질문2,3,7,17의모델 유기체로서 의외의 사용이 증가함에 따라, N. vitripennis 유전자의 기능 분석을 위한 단순화되고 효율적인 프로토콜을 가능하게 하기 위해 주입 방법을 개발하고 최적화할 필요가 있다. 유전자 편집 시약의 배아 미세 주입을 포함하는 현재 방법은 특수 장비 및 고도로 훈련된 인력을 필요로 하는13에도전적입니다. 따라서 유전자 편집 기술을 비전문 실험실에 더 쉽게 접근하려면 CRISPR 시약의 대체 전달 접근법을 개발하는 것이 중요합니다. 따라서, 여기서 입증된 상세한 시각적 기술은 곤충 혈청계 및 난소로 편집 시약(CRISPR/Cas9 또는 dsRNA)의 전달을 허용하는 두 가지 대체 주입 절차를 기술한다.
곤충 혈구에 dsRNA를 주입하는 것은 절지동물18,19,20,21,22의다양한 종에서 dsRNA를 전달하기 위한 일반적인 접근법이다. 이전에 보고된 바와 같이, 백색 푸파에 사용될 때 N. vitripennis에서도 효율적입니다3,7. 세균성 곤충 돌연변이 발생을 위한 CRISPR/Cas9 방법은 배아 미세 주입에 거의 전적으로 의존합니다. 님프 또는 성인에 CRISPR 시약을 전달하는 몇몇 성공적인 실험은12,23,24,25,26,27보고되었습니다. 전반적으로, 여기에 설명된 방법은 기존방법(13)과관련하여 많은 중요한 이점을 제공한다. 첫째, 그들은 N. vitripennis 말벌의 여러 발달 단계의 주입을 가능하게 : 흰색, 검은 강아지, 성인. 추가적으로, 혈류량으로 주입은 배아 미세 주입을 우회하여 CRISPR을 통해 RNAi 또는 생식선 유전자 편집을 통해 노크할 수 있습니다.
이 프로토콜의 첫 번째 단계는 관심의 기능적 테스트 (예를 들어, 게놈 편집, RNAi)에 기초하여 올바른 발달 단계에 대한 나소니아 말벌을 결정하고 선별하는 것입니다. 흰색과 어두운 강아지와 성인에서 남녀를 식별하는 데 익숙해지는 것이 중요합니다. N. vitripennis 여성은 블로우 플라이의 pupal 케이스에 최대 50 개의 알을 낳고, S. 불라타,말벌 강아지는 흰색 단계에서 시작하여 많은 수의 쉽게 수집하고 선별 할 수있습니다. 또한, 5°C에서 주 동안 개발 속도를 늦추기 위해 다양한 단계에서 pupae를 저장할 수 있는 가능성은 시간과 조직9측면에서 시스템을 매우 유연하게 만든다.
주입 후 강아지와 성인의 생존은 사용자가 최적화해야하는 측면이다. 예를 들어,이 프로토콜에서, 강아지에 CRISPR / Cas9 시약의 첫 번째 주입극적으로 생존에 영향을 (15%) 주입 된 성인의 생존에 비해 (90 %). 그러나, 두 번째 세션에서, 강아지 생존은 60 %까지 증가했다. 여러 번의 주사 세션 후 유사한 생존을 유지할 수 있었습니다 (80%-100%) 강아지 또는 성인을 주입 한 후. 실제로, 주사 후 생존은 말벌을 정렬하는 것과 관련된 파라미터가 바늘에 적합한 조리개를 선택하고, 바늘로 말벌을 관통하거나 찌르는 것을 피하는 것이 최적화된 경우 향상될 수 있다.
여기에 제시된 프로토콜에 근거하여 주사를 위한 pupae및 여성을 정렬하고 준비하는 것은, 사망을 감소시킬 수 있습니다. 더욱이, 슬라이드에 접착하여 움직이지 않는 강아지를 정렬하는 방법을 제시하면 주입 중에 움직이지 못하게 하기 때문에 사출 공정을 용이하게 할 수 있다. 따라서, pupae는 배아 미세 주입에 관여하는 단계의 시간이 많이 걸리는 특성을 극복하여 매우 빠르게 주입 될 수 있습니다. 또한, 구강 흡인기로 주사를 할 수 있기 때문에 유전자 편집 이벤트를 수행하기 위해 특수 장비가 필요하지 않습니다. 그러나, 이 기술은 말벌을 접착제에 적시에 배치할 것을 요구합니다. 그렇지 않으면 제대로 부착되지 않으며 바늘 삽입 중에 슬라이드에서 미끄러집니다. 정렬의 여러 시험 후 이 수정될 수 있습니다.
성인은 복부와 다리를 움직일 수 있기 때문에이 방법을 사용하여 정렬 할 수 없습니다. 따라서, 그들은 마취 될 필요가있다. 이 프로토콜에서 선호하는 방법은 말벌이 쓰러질 때까지 얼음에 말벌을 포함하는 튜브를 넣고 얼음에 미리 차가운 슬라이드로 그룹으로 옮기는 것입니다. 이 방법을 사용하면 10-15 말벌의 그룹으로 주입을 위한 말벌의 정렬 및 준비를 가능하게 하며, 각 새로운 주사 그룹에 대한 얼음을 함유하는 새로운 페트리 접시를 사용할 수 있습니다. 주입 중에 얼음이 녹는 것을 방지하면 슬라이드를 안정적으로 유지하고 바늘을 부러 뜨리거나 실수로 말벌을 죽일 위험을 줄이는 데 도움이됩니다. 이 단계는 액세스 가능한 경우 냉각 테이블을 사용하여 개선할 수 있습니다.
또는, CO2 패드는 말벌을 마취하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 위해서는, 주사 중CO2에 노출되는 시간을 최적화하고 다른종(18)에대해 이전에 보고된 바와 같이 생존과 불임에 대한CO2 노출의 효과를 결정해야 할 것이다. 성인을 주입 할 때 한 가지 추가 장애물은 주입을위해 마취 된 말살을 유지하는 데 사용되는 방법에 의존합니다. 피어싱하거나 찌르는 위험없이 말뚝을 잡을 수있는 무딘 뾰족한 물체가 가장 적합합니다. 일반적으로 해부 바늘이나 무딘 집게가 잘 작동합니다.
말벌의 정렬 및 적절한 보유가 마스터된 후, 사출 공정이 매우 빠르게 진행될 수 있다. Pupae 및 성인 주사는 사용자의 취향에 따라 다른 농도에서 준비를 용이하게, 나노 리터의 수백의 범위에서 용액 볼륨으로 주입 될 수있다. 그러나, 손상 하 고 말하의 위험 없이 액체의 정확한 금액을 주입 하는 적절 한 바늘을 사용 하는 것이 중요 하다. 일반적으로, 아주 작은 조리개를 가진 아주 긴 바늘은 강아지의 복부에 더 적은 물리적 손상을 일으키는 원인이 되기 때문에 낫습니다. 더욱이, 액체의 흐름은 느리고, 압력의 큰 변화를 피하고 가장 중요한 것은 바늘에 의해 생성된 구멍을 통해 용액의 누설을 방지한다는 것입니다.
작은 조리개단점은 말벌의 단단한 외골격을 만질 때 바늘이 쉽게 부러질 수 있고 또한 복부 안쪽에서 물질로 막힐 수 있다는 것입니다. 따라서 작은 조리개 바늘은 펨토젯이나 나노젝트(nanoject)를 사용하여 매우 잘 작동하며, 그 사용은 이를 깨는 것을 피하기 위해 세심한 주의가 필요합니다. 이 바늘은 작은 조리개를 통해 입으로 액체를 주입하는 것이 매우 어렵기 때문에 입 흡인기에게 적합하지 않습니다. 이 방법의 경우 이상적인 바늘은 큰 조리개 바늘로 발생할 수있는 손상을 방지하면서 용액이 원활하게 흐를 수있는 최소한의 조리개를 필요로합니다. 다시 말하지만, 이 측면은 사용자가 최적화해야 합니다. 어쨌든 바늘을 자주 바꾸는 것은 생존과 효율성을 감소시키는 팁을 막히고 손상시키는 것을 피하는 데 도움이 됩니다.
N. vitripennis에서 복부에 있는 어떤 장소는 혈몰리엄으로 시약을 전달하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나, 추가 주의 해야 하 스 하 스 백의 ovipositor에 손상을 방지 하기 위해 이 먹이 및 계란 누워에 사용 됩니다. 강아지와 성인 모두에 대 한, 고정 기술은 ovipositor에서 멀리 주입을 허용 하기 위해이 프로토콜에서 제안 되었습니다., 주로 복부의 전방 부분을 향해 복부 지역에서. 또한, 성인에서, 이것은 또한 측면 또는 등쪽 지역에 주입 하 여 달성 될 수 있다. 본 명세서에 기재된 pupae에 대한 정렬 방법은 측면 주사를 용이하게 할 수 있지만 등쪽은 용이하지 않을 수 있다. 어쨌든, 다른 신체 부위를 관통하거나 복부를 손상시키는 것을 방지하기 위한 노력이 우선순위입니다.
바늘이 삽입되면 액체의 흐름이 느리고 일정해야합니다. 펨토젯은 각 바늘에 압력을 조정해야 할 수도 있지만 이를 쉽게 허용합니다. 입 흡인기를 사용하는 경우, 주사의 모공을 통해 누출될 수 있기 때문에 너무 빨리 많은 양의 액체를 주입하는 것을 피해야 한다. 사실, 액체로 부종을 관찰 하는 것 외에도, 누설은 주사를 중지 하는 표시. 주사가 끝나면 성인 말벌이 복구된 다음 호스트가 있는 튜브로 옮겨질 때까지 슬라이드에 남아 있어야 합니다.
여기에 제시 된 시스템은 쉽게 계란 미세 주입에 대한 특히 어려운 다른 곤충 종에 적응 할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 기생 말벌은 다른 곤충 애벌레에 알을 낳는다. 따라서 계란은 그 종에 도달하고 주입하는 것은 불가능합니다. 아시아 감귤류 psyllid Diaphorina citri와 같은 다른 해충 종의 계란은 또한 그들이 누워있는 식물에 부착되어 있기 때문에 주입에 도달하기가 매우 어렵습니다. 최근 보고서에 따르면 BAPC는 아시아 감귤류 psyllid, D. citri27에서CRISPR 유전자 편집에 사용될 수 있음을 시사한다. 유사하게, P2C 매개 전달 단백질, mCherry, 이종(28)의난소에서 수행되었으며, 여기에 설명된 이러한 주입 기술은 광범위한 곤충 해충 종에서 RNAi 및 CRISPR의 구현을 용이하게 하고 그들과 관련된 작물 손상을 방지하는 데 도움이 되는 방제 전략을 설계하는 데 도움이 될 수 있음을 시사한다.
다른 종의 구현은 관심있는 종의 수명 주기에 따라 최적화가 필요합니다. 예를 들어, 관심의 기능적 시험에 기초하여 주사의 올바른 단계를 설정하는 것이 중요하다. 따라서, CRISPR/Cas9를 난소로 전달하는 것은, vitellogenesis가난소(24,25,26,27,28)에의한 유전자 편집 시약의 섭취를 허용하는 것이 활성화되어 있는지 아는 것이 중요하다. 대조적으로, 효율적인 녹다운을 위해, 유전자가 발현되고 기능적일 때아는 것이 중요합니다. 그 주입 기술의 미래 구현은 곤충 혈류와 난소로 플라스미드 DNA와 같은 핵산의 다른 모형의 납품을 관련시킬 수 있었습니다. 이것은 플라스미드 DNA에 존재하는 유전자의 일시적인 발현을 승진시키는 가능하게 합니다. 또한 CRISPR/Cas 시약을 템플릿 DNA와 결합하면 상동성 지향 수리(HDR)를 통해 전염을 중재하거나 트랜스포슨 매개 전염을 유도하여 배아 미세 주입을 우회할 수 있습니다. 결론적으로, 이 향상된 기술은 RNAi를 통한 녹다운, 돌연변이 유도, 삭제 및 아마도 트랜스제닉 N. vitripennis를생성하기 위해 트랜스진 삽입과 같은 많은 종류의 기능 적 분석을 생성하는 데 사용할 수 있으며, 이는 이 유기체에서 기능 연구를 크게 가속화해야 합니다.
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Disclosures
JLR과 DCR은 ReMOT 제어 기술에 대한 잠정특허 보호를 신청했습니다. O.S.A.는 Agragene, Inc.의 창립자이며 지분 지분을 가지고 있으며 회사의 과학 자문위원회에서 근무하고 있습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 J.L.R.에 대한 1645331 O.S.A. 및 NSF/BIO 보조금으로 향하는 UCSD 스타트업 펀드에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
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