Summary
Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.
Abstract
De juweelwesp, Nasonia vitripennis, is een efficiënt modelsysteem geworden om epigenetica van haploïde geslachtsbepaling, B-chromosoombiologie, gastheer-symbiontinteracties, speciatie en gifsynthese te bestuderen. Ondanks de beschikbaarheid van verschillende moleculaire hulpmiddelen, waaronder CRISPR/Cas9, zijn functionele genetische studies nog steeds beperkt in dit organisme. De belangrijkste beperking van het toepassen van CRISPR/Cas9-technologie in N. vitripennis komt voort uit de uitdagingen van embryonale micro-invoegingen. Injecties van embryo's zijn bijzonder moeilijk in dit organisme en in het algemeen bij veel parasitoïde wespen, vanwege de kleine embryogrootte en de vereiste van een gastheerpop voor embryonale ontwikkeling. Om deze uitdagingen aan te pakken, werd cas9 ribonucleoproteïne complexe levering in vrouwelijke eierstokken door injectie bij volwassenen, in plaats van embryonale micro-injectie, geoptimaliseerd, wat resulteerde in zowel somatische als erfelijke kiembaanbewerkingen. De injectieprocedures werden geoptimaliseerd bij poppen en vrouwelijke wespen met behulp van ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) of BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Deze methoden blijken effectieve alternatieven te zijn voor embryo-injectie, waardoor plaatsspecifieke en erfelijke kiembaanmutaties mogelijk zijn.
Introduction
CRISPR/Cas9 genbewerking is een krachtige technologie voor functionele genetische studies, vooral in veel opkomende modelorganismen zoals de juweelwesp, Nasonia vitripennis. Het gemak van opfokken en de beschikbaarheid van een compleet genoom maakt de juweelwesp een belangrijk experimenteel systeem voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van verschillende biologische processen. N. vitripennis is bijvoorbeeld onlangs gebruikt om de epigenetische basis van het haploïde geslachtsbepalingssysteem1,2,de biologie van B-chromosomen 3 ,4,5,6en de genetische basis voor circadiane en seizoensgebonden regulatie7,8teontrafelen . Enkele van de kenmerken die N. vitripennis vatbaar maken om mee te werken, zijn korte generatietijd (~ 2 weken bij 25 °C), hoge reproductiesnelheden, gemakkelijke geslachtsscheiding in het popstadium en de mogelijkheid om stammen bij 4 °C te diapause en op te slaan. De levenscyclus begint met vrouwelijke wespen die de poppen van de blaasvlieg parasiteren, Sarcophaga bullata. Via hun legboor leggen vrouwtjes tot 50 eieren in het popgeval van de blaasvlieg. Eieren ontwikkelen zich tot larven die zich voeden met de S. bullata-pop, zich de komende dagen blijven ontwikkelen en vervolgens verpoppen, gevolgd door volwassen eclosie en opkomst uit het gastheerpoppenarium9.
Moleculaire instrumenten voor het uitvoeren van functionele genetische studies in N. vitripennis, zoals RNA-interferentie (RNAi)10 en CRISPR/Cas911,12, zijn beschikbaar, maar zijn beperkt, voornamelijk als gevolg van problemen bij het uitvoeren van embryonale micro-invoegsels13. Omdat N. vitripennis-eieren een popgastheer nodig hebben voor ontwikkeling, is eimanipulatie zeer uitdagend. Embryo's in het pre-blastodermstadium moeten worden verzameld bij de blaasvliegpoppen van de gastheer, snel micro-geïnjecteerd en onmiddellijk worden overgebracht naar de gastheer voor ontwikkeling13. Deze stappen vereisen precisie en gespecialiseerde training om te voorkomen dat de micro-geïnjecteerde embryo's of de pop gastheren13beschadigen. Bovendien zijn de eieren erg klein en fragiel, vooral na micro-invoegingen, met een zeer stroperig cytoplasma dat een continue verstopping van de injectienaald veroorzaakt13. Deze kenmerken maken embryonale micro-injections uitzonderlijk uitdagend, waarvoor hoogopgeleide operators en gespecialiseerde apparatuur nodig zijn die in de meeste N. vitripennis-laboratoria ontbreekt.
De optimalisatie van alternatieve injectiemethoden voor de levering van CRISPR-reagentia zou bijdragen tot de consolidatie van N. vitripennis als modelorganisme. De manipulatie van poppen en volwassenen is minder uitdagend dan het manipuleren van embryo's en kan worden bereikt met een basisinjectieopstelling. Hier worden twee protocollen beschreven voor injectie van poppen en volwassenen: één met gespecialiseerde apparatuur voor injecties en de andere met behulp van een aspiratorbuisassemblage uitgerust met een glazen capillaire naald. Het gebruik van een aspiratorbuis is bijzonder geschikt voor laboratoria die geen toegang hebben tot gespecialiseerde apparatuur voor embryomicro-insecties. Efficiënte injecties van verschillende ontwikkelingsstadia van N. vitripennis, waaronder witte of zwarte poppen en volwassen wespen, worden aangetoond. Wespen in het witte popstadium zijn bijzonder geschikt voor RNAi-gemedieerde knockdown-experimenten. Hoewel RNAi in Nasonia voor het eerst werd beschreven door Lynch en Desplan in 200610, is er geen visuele procedure beschikbaar voor hoe RNAi-injecties worden uitgevoerd. RNAi werd onlangs gebruikt om het happloidizer-gen van het B-chromosoom PSR (Paternal Sex Ratio)3 te ontdekken en om de betrokkenheid van het klokgen, punt, in N. vitripennis biologische ritmes7te bestuderen .
Zwarte poppen en volwassen wespen kunnen worden gebruikt om CRISPR/Cas9 kiembaangenbewerking te induceren met behulp van ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) en BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules) protocollen. Deze twee eierstokafgiftemethoden zijn onlangs beschreven als effectief in Nasonia voor het genereren van kiembaanmutaties in het doelgen, cinnabar7,12. Hier is een vereenvoudigd protocol voorzien voor injecties, inclusief een visuele procedure van een stapsgewijze methodologie voor zowel pop- als volwassen injecties die kunnen worden gebruikt om functionele geneticastudies in Nasonia en waarschijnlijk bij andere parasitoïde wespen te genereren, zonder gespecialiseerde apparatuur te vereisen en embryonale micro-invoegingen te omzeilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nasonia opfok
- Zet ~ 20 gepaarde vrouwtjes op in kleine glazen reageerbuizen die zijn aangesloten op katoen.
OPMERKING: Om de opfokruimte te verkleinen, zijn buizen van 10 x 85 cm en 4 ml optimaal. Vrouwtjes zijn gemakkelijk te onderscheiden van mannetjes vanwege de grotere vleugels en de aanwezigheid van de legboor (figuur 1A). Gedetailleerde protocollen voor het fokken van N. vitripennis zijn ook te vinden in andere literatuur13,14,15.- Voeg twee S. bullata gastheren per buis toe en houd de wespen op 25 ± 1 °C en 30% relatieve vochtigheid, met een licht-donkercyclus van 12:12 gedurende 2-3 dagen.
OPMERKING: Wespen kunnen op een lagere temperatuur of kamertemperatuur worden gehouden; de ontwikkeling zal echter worden vertraagd.
- Voeg twee S. bullata gastheren per buis toe en houd de wespen op 25 ± 1 °C en 30% relatieve vochtigheid, met een licht-donkercyclus van 12:12 gedurende 2-3 dagen.
- Verwijder na 2-3 dagen, met behulp van een fijnpuntige verfborstel, voorzichtig de vrouwtjes om continue ovipositie en asynchronie in de ontwikkeling van nakomelingen te voorkomen.
OPMERKING: Verwijderde vrouwtjes kunnen optioneel worden her gehost of maximaal een maand bij 5 °C worden bewaard.- Houd de geparasiteerd gastheer op 25 °C en 30% relatieve vochtigheid, met een licht-donkercyclus van 12:12 gedurende 7 dagen als de gewenste injectiefase witte poppen vereist; gedurende 13 dagen als de vereiste ontwikkelingsfase zwarte poppen is; of 14 dagen voor jonge, pas opgedoken volwassenen.
OPMERKING: Gele en zwarte poppen kunnen ook maximaal een week bij 5 °C worden bewaard. Langere opslag zal de frequentie van diapause in larven voor de volgende generatie verhogen, waardoor de screening na injectie en het instellen van mutante lijnen moeilijker wordt. - Open het gastheerpoppenarium met een ontleednaald om N. vitripennis poppen en volwassenen in het gewenste stadium te herstellen (Figuur 1A).
OPMERKING: Voor injecties op een bepaalde volwassen leeftijd of voor het verzamelen van maagdelijke vrouwtjes, wordt aanbevolen om de donkere poppen op dag 13 van de gastheer te verwijderen, gescheiden door geslacht, en volwassenen te verzamelen na opkomst.
- Houd de geparasiteerd gastheer op 25 °C en 30% relatieve vochtigheid, met een licht-donkercyclus van 12:12 gedurende 7 dagen als de gewenste injectiefase witte poppen vereist; gedurende 13 dagen als de vereiste ontwikkelingsfase zwarte poppen is; of 14 dagen voor jonge, pas opgedoken volwassenen.
2. Uitlijning van witte en zwarte poppen
- Bereid een glazen dia voor door een lijn schoollijm in het midden aan te brengen. Verspreid de lijm met een ontleednaald om een dikke laag te verkrijgen(figuur 1B),die zal worden gebruikt om de poppen uit te lijnen. Laat de lijm ~2 min drogen voordat u de poppen overbrengt.
OPMERKING: Overdrijf de lijm niet, anders wordt de poppen niet goed aan de glijbaan bevestigd en glijdt deze tijdens de injecties over. - Breng onder een ontleedmicroscoop, met behulp van de ontleednaald, lijm aan op de achterkant van de kop van de pop.
- Bevestig de pop aan de lijmlaag op de glijbaan met de buik naar boven gericht. Lijn 20-30 poppen naast elkaar uit op de dia (Afbeelding 1C).
OPMERKING: Raak de buik niet aan met de lijm en vermijd het onderdompelen van de poppen in de lijm; anders kunnen de volwassenen niet tevoorschijn komen. - Plaats de glijbaan met de poppen in een petrischaaltje om de lijm ~10 min. te laten drogen. Voordat u met de injecties begint, test u de hechting van de poppen aan de lijm door ze voorzichtig met de ontleednaald te duwen. Als de meeste poppen zijn losgemaakt, bereid dan een nieuwe dia voor. U kunt ook alle poppen verwijderen die los zitten en doorgaan met het injecteren van de poppen die goed aan de dia zijn bevestigd.
3. Naaldvoorbereiding
- Plaats een capillaire glazen buis in een naaldtrekker en trek naalden volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Bij deze demonstratie worden een P-1000 platina filament naaldtrekker en aluminium silicaatglas haarvaten gebruikt. In de gebruiksaanwijzing van dit instrument (zie Materiaaltabel)wordt uitgelegd hoe capillaire glazen buizen correct kunnen worden geladen en programma's op dit instrument kunnen worden ingesteld. Gebruik de volgende parameters (Warmte: 536; Trekkracht: 80; Vel: 100; Vertraging: 70)op aluminium silicaatglascapillairen om gele poppen, zwarte poppen en volwassenen te injecteren.
Bovendien werd de P-2000 naaldtrekker gebruikt om kwartsnaalden te bereiden volgens de parameters (Warmte: 805; Trekkracht: 145; Vel: 50; Vertraging: 145). De handleiding bevat instructies voor het laden van capillaire kwartsbuizen en het instellen van programma's in dit instrument. Bij afwezigheid van een trekker is aanpasbaar capillair glas beschikbaar. - Laad de naald met 5 μL van het injectiemengsel (vooraf bereid volgens eerdere protocollen voor RNAi10 of CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïne12 (RNP) injecties in N. vitripennis) met behulp van microloader pipettips.
OPMERKING: Tijdens de demonstratie wordt de naald geladen met dubbelstrengs RNA (dsRNA) gecombineerd met rode kleurstof (zie tabel met materialen)voor injectie van poppen met een wit stadium en met BAPC-Cas9-sgRNA voor injectie van zwarte poppen wespen en volwassenen. Deze reagentia richten zich op het cinnabar gen. Wespen die met succes worden neergehaald / uitgeschakeld, zullen rode ogen vertonen in plaats van de wilde bruine ogen. - Open de naald en schuif de punt op een oppervlak dat bestaat uit twee overlappende dia's (figuur 1D). U kunt ook de punt van de naald openen met een paar fijne tangen om een scherpe rand te creëren of door langzaam de thorax of buik van de wesp te doorboren.
4. Popinjectie met femtojet
- Plaats de dia met de uitgelijnde poppen onder een ontleedmicroscoop. Steek de naald in de injectiebuis van de femtojet en draai de grijpkop vast.
- Als u naar de naald onder de microscoop kijkt, schakelt u de femtojet in en stelt u pc- en pi-injectieparameters in door de draaiknoppen te draaien.
OPMERKING: Een pc-waarde van 600 hPa wordt aanbevolen voor een continue stroom van de vloeistof. De pc-waarde is afhankelijk van de opening van de naald. Voor naalden bereid met behulp van de aangegeven parameters in de P-1000 naaldtrekker produceren pc-waarden tussen 500 hPa en 700 hPa een constante stroom. Als lagere waarden van Pc nodig zijn, geeft dit aan dat de opening te groot kan zijn en de insecten kan beschadigen, terwijl hogere waarden aangeven dat de naald nog steeds gesloten is of dat de opening te klein is. - Steek de naald voorzichtig tussen de 2 en 3 zichtbare buiksegmenten met een verticale hoek van ongeveer 30° (afbeelding 1E). Injecteer met een continue stroom totdat de hele buik roze wordt in het geval van poppen met een wit stadium, of totdat de buik in grootte toeneemt in het geval van zwarte poppen. Stop met injecteren wanneer het duidelijk is dat de buik geen vloeistof meer kan nemen, of wanneer de vloeistof uit het lichaam begint te stromen. Ga voorzichtig naar de volgende pop en herhaal deze stappen.
OPMERKING: Raak de legboor niet aan en beschadig deze niet met de naald tijdens de injectie. - Breng de glijbaan met de geïnjecteerde poppen over in een petrischaal met een papieren handdoek gedrenkt in gedeioneerd water om de vochtigheid te behouden. Bedek de schaal met het deksel en plaats deze op 25 °C tot de wesp opkwam (figuur 1F).
5. Popinjectie met aspiratorbuis
- Bereken de hoeveelheid injectiemix met behulp van de factor: 4 ingespoten poppen/1 μL oplossing.
OPMERKING: Een typische injectie van 20-30 poppen vereist ~ 5-8 μL ribonucleoproteïne (RNP) complex-saponine mix of RNP met BAPC12. - Lijn de poppen uit, zoals voorgesteld in sectie 2, en plaats één dia met de uitgelijnde poppen onder een ontleedmicroscoop (Afbeelding 1E).
- Neem een van de capillaire naalden en breek de punt tussen twee glazen dia's, zoals aangegeven in stap 3.4 (figuur 1D). Zorg ervoor dat de naaldpunt open genoeg is om de injectieoplossing naar buiten te laten gaan door lucht met de mond te blazen, maar niet te open om te voorkomen dat vloeistof verloren gaat en de poppen worden beschadigd (figuur 1E).
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang omdat de gebruiker lucht uit de mond zal gebruiken om het injectiemengsel in de hemolymph van het insect te duwen. Het is beter om te oefenen om te bepalen welk type naaldopening optimaal is voor de viscositeit van een bepaalde oplossingsmix. Vijf sets injecties van 20 poppen per set kunnen voldoende zijn om te wennen aan het mondinjectiesysteem. - Plaats één naald met de ribonucleoproteïneoplossing12 met behulp van een microlaadtip en steek de naald in de connectorverpakking van de aspiratorbuiseenheid.
OPMERKING: Tijdens de demonstratie wordt de naald geladen met BAPC-Cas9-sgRNA gericht op het Nasonia cinnabar gen12. - Steek de naald voorzichtig tussen de 2 en 3 zichtbare buiksegmenten met een verticale hoek van ongeveer 30° (afbeelding 1E). Injecteer met een continue stroom totdat de hele buik roze wordt in het geval van poppen met een wit stadium of totdat de buik in grootte toeneemt in het geval van zwarte poppen. Stop met injecteren wanneer het duidelijk is dat de buik geen vloeistof meer kan nemen of wanneer de vloeistof uit het lichaam begint te stromen. Ga voorzichtig naar de volgende pop en herhaal deze stappen
OPMERKING: Raak de legboor niet aan en beschadig deze niet met de naald tijdens de injectie. - Breng de glijbaan met de geïnjecteerde poppen over in een petrischaal met een papieren handdoek gedrenkt in gedeioneerd water om de vochtigheid te behouden. Bedek de schaal met het deksel en plaats deze op 25 °C tot de wesp opkwam (figuur 1F).
6. Volwassen injectie met aspiratorbuis
- Voor de voorbereiding voor volwassenen, afzonderlijke groepen van 20 maagdelijke vrouwtjes in een schone kleine reageerbuis met een fijne kwast. Plaats de buis 5 minuten op ijs totdat de vrouwtjes verdoofd zijn. Als alternatief kunnen vrouwtjes worden verdoofd en geïnjecteerd met CO2.
OPMERKING: IJs heeft de voorkeur als verdovingsmiddel, omdat volwassen wespen koudtolerant zijn en gemakkelijk herstellen na de injecties. Vrouwtjes kunnen meer geïnjecteerde vloeistof opnemen dan de poppen: 1 μL oplossing kan worden gebruikt voor drie vrouwtjes in plaats van voor vier poppen. Bereid de volumes dienovereenkomstig voor. - Bereid een ijsemmer voor en plaats een glazen glijbaan bovenop het ijs. Lijn de vrouwtjes naast elkaar uit op de koude glijbaan met de buik naar boven gericht (figuur 1E) onder een ontleedbereik.
- Plaats één naald met de ribonucleoproteïneoplossing12 met behulp van een microlaadtip en steek de naald in de connectorverpakking van de aspiratorbuiseenheid. Ondersteun de vrouwtjes van de andere kant met stompe ontleednaalden terwijl ze langzaam vanaf de andere kant in de buik injecteren. Raak de legboor niet aan, dit zal deze kritische voortplantingsstructuur ernstig beschadigen (figuur 1E).
OPMERKING: Beide oriëntaties zijn acceptabel, afhankelijk van de voorkeur van de operator. - Steek de naald voorzichtig tussen de 2 en 3 zichtbare buiksegmenten met een verticale hoek van ongeveer 30° (afbeelding 1E). Injecteer de oplossing in de vrouwelijke buik, stop wanneer er geen vloeistof meer kan binnendringen of wanneer lekken van overtollige oplossing wordt waargenomen. Ga voorzichtig naar de volgende wesp en herhaal deze stappen
OPMERKING: Injecteer langzaam en laat de naald ongeveer 3 s in de buik zitten voordat u deze heel langzaam verwijdert. Dit zal helpen om de interne vloeistofdruk aan te passen en te voorkomen dat de oplossing van de injectieplaats lekt na het verwijderen van de naald. - Wanneer u klaar bent, breng u de enkele geïnjecteerde vrouwtjes voorzichtig over naar een nieuwe buis met één gastheer met behulp van een penseel. Laat ongeveer 1 uur bij kamertemperatuur herstellen, wat de overleving bevestigt en breng de buizen vervolgens terug naar de broedmachine voor de opfok.
OPMERKING: Tijdens de demonstratie wordt de naald geladen met BAPC-Cas9-sgRNA gericht op het Nasonia cinnabar gen12.
7. Zorg na injectie en mutantenscreening
- Na volwassen eclosie van de geïnjecteerde poppen, plaats enkele wespen in een glazen buis aangesloten met katoen en plaats een S. bullata gastheer (Figuur 1G). Plaats daarentegen geïnjecteerde vrouwtjes in individuele buizen met gastheren onmiddellijk na injectie.
- Voor CRISPR/Cas9 knock-out experimenten, laat vrouwtjes de gastheren parasiteren voor één dag, en vervang de gastheer elke dag gedurende drie opeenvolgende dagen.
OPMERKING: Als gevolg van het haploïde geslachtsbepalingssysteem in N. vitripennis16,zullen maagdelijke vrouwtjes haploïde mannelijke broedsels produceren, wat de detectie van mutaties vergemakkelijkt. Voor knockdown via RNAi van manspecifieke genen kunnen de geïnjecteerde individuen enkelvoud worden gepaard met wilde type individuen en gastheren laten parasiteren. Gebruik één host per dag en vervang de hosts op basis van de experimentele installatie. - Plaats de geparasiteerd gastheren op 25 °C tot het verschijnen van de mannelijke nakomelingen van de G0 (gedurende ~ 13-14 dagen).
- Screen onder een ontleedmicroscoop G0-mannetjes op de gemuteerde fenotypes. Het cinnabar-gen is verantwoordelijk voor oogpigmentatie12: wespen met bruine ogen zijn wild type, en wespen met felrode ogen of variaties tussen rode en bruine ogen zijn mutanten (Figuur 1H).
8. Kruisen na injectie en opfok
- Plaats alle gemuteerde G0-mannetjes met rode ogen (het fenotypisch verstoorde cinnabar12-gen)gedurende 1-2 dagen bij wilde maagdelijke vrouwtjes(figuur 2A).
OPMERKING: Als het verstoorde gen geen zichtbaar fenotype verleent, is polymerasekettingreactie (PCR) gevolgd door sequencing van het doelgen vereist om de gemuteerde dieren te identificeren. Voordat het DNA van G0-mannetjes voor PCR wordt verkregen, zou het ideaal zijn om ze te paren met wilde maagdelijke vrouwtjes. U kunt ook DNA uit een been van een G0-man halen om mutanten te identificeren en alleen die met geverifieerde mutaties paren. - Voeg twee S. bullata gastheren per vrouw toe en laat legificeren bij 25 °C en 30% relatieve vochtigheid met een licht-donker cyclus van 12:12. Vervang de hosts elke 2-3 dagen.
- Bewaar geparasiteerd gastheren bij 25 °C en 30% relatieve vochtigheid, met een licht-donkercyclus van 12:12 gedurende ~ 10 dagen.
- Na ~ 10 dagen, open de geparasiteerd gastheer met een ontledende naald en verwijder elke N. vitripennis pop van de gastheer.
- Selecteer met behulp van een penseel met fijne punt vrouwelijke poppen (figuur 1A).
OPMERKING: Vrouwtjes zijn diploïde en heterozygoot, en dus zal de oogkleur wild type zijn.
- Plaats 15-20 vrouwelijke poppen in glazen buizen bij 25 °C tot de opkomst. Voeg na opkomst ~ 20 S. bullata-gastheren toe en laat de maagdelijke G1-vrouwtjes de gastheren 2-3 dagen parasiteren.
OPMERKING: Deze vrouwtjes produceren 50% G2 mutante mannetjes.- Bewaar geparasiteerd gastheren bij 25 °C en 30% relatieve vochtigheid, met een licht-donkere cyclus van 12:12 tot de opkomst van G2-mannelijke volwassenen.
- Plaats de resterende G1 poppen gedurende 8-10 dagen op 5 °C . Verwijder ze na deze periode en plaats ze op 25 °C en 30% relatieve vochtigheid, met een licht-donkercyclus van 12:12 tot het ontstaan (figuur 2A).
- Na het verschijnen van de G2-mannetjes in stap 8.3.1, screenen op de aanwezigheid van roodogig mutant fenotype. Met behulp van een penseel met fijne punt scheiden ze roodogige mannetjes van wilde mannetjes.
OPMERKING: De aanwezigheid van wespen met rode ogen in deze generatie (G2, figuur 2A) geeft aan dat genbewerking plaatsvond in de kiembaan en dat de mutatie erfelijk is. - Plaats roodogige mannetjes bij de G1-vrouwtjes die nieuw zijn verschenen in stap 8.3.2(figuur 2A)en laat ze 1-2 dagen paren. Voeg 2 S. bullata gastheren per vrouw toe en plaats ze op 25 °C en 30% relatieve vochtigheid met een licht-donker cyclus van 12:12 gedurende 10-11 dagen.
- Open na 10-11 dagen de geparasiteerd gastheer met een ontledende naald en verwijder elke N. vitripennis-pop van de gastheer (figuur 2A).
- Met behulp van een penseel met fijne punt scheiden wespen met rode ogen (mannetjes en vrouwtjes) van het wilde type (figuur 1H). Blijf wespen met rode ogen samen fokken in glazen buizen en meng je niet met de wilde wespen.
OPMERKING: In dit stadium (G3, figuur 2A)dragen haploïde mannetjes en diploïde vrouwtjes fenotypen voor de cinnabarmutaties. Als het aangetaste gen codeert voor een onzichtbaar fenotype, kruist u G0-mannetje in het bijzonder met één wild type vrouwtje gedurende ~ 1 dag. Verwijder vervolgens het mannetje voor moleculaire karakterisering van de mutatie door PCR en sequencing en laat het vrouwtje een gastheer parasiteren. Ga alleen door met het kruisingsschema met de nakomelingen van een bevestigd mutant mannetje (figuur 2B). Als het doel de knockdown door RNAi van een kandidaat-gen is, voert u de gewenste functionele test (zoals letaliteit, steriliteit of diapause inductietest3,7) rechtstreeks uit met behulp van personen die zijn geïnjecteerd met dsRNA. Aangezien RNAi van voorbijgaande aard is, is het niet mogelijk een kolonie te genereren met het gewenste fenotype (Figuur 2C)3,7.
Figuur 1: Tijdlijn voor pop en volwassen Nasonia vitripennis micro-injection. (A) Mannelijke en vrouwelijke witte (boven) en zwarte (onderste) poppen worden verzameld, (B-C) uitgelijnd en gelijmd op een glazen dia voor injectie. (D) Capillaire naald wordt voorbereid en geopend, glijdend op twee overlappende dia's. (E) De naald wordt voor injecties aan de Femtojet (boven) of aan een aspiratorbuis (onder) bevestigd. (F) De geïnjecteerde poppen op de glijbaan worden overgebracht naar een petrischaal met een nat weefsel aan de onderkant om de vochtigheid te behouden. Bij opkomst worden (G) vrouwtjes enkelvoud in kleine glazen buisjes geplaatst en mogen ze op Sarcophaga-poppen legponsen. (H) Screening van het nageslacht om mutanten op te sporen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Kruisingsregeling na injectie. Schematische weergave van de procedure voor kruisingsschema's in het geval van CRISPR/Cas9-gemedieerde genbewerking van genen (A) die een zichtbaar fenotype induceren en (B) die geen zichtbaar fenotype verlenen. (C) Schematische weergave van de RNAi-screeningsprocedure. Afkortingen: cin = cinnabar; PCR = polymerasekettingreactie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel presenteert twee eenvoudige methoden voor pop- en volwassen micro-injection, hetzij met behulp van een femtojet of een aspiratorbuis. De eerste methode maakt een nauwkeurigere injectie van vloeistof mogelijk, wat belangrijk is voor de consistentie van RNAi, terwijl de tweede de injectie van grotere hoeveelheden vloeistof in Nasonia-poppen of volwassenen mogelijk maakt.
De representatieve resultaten in tabel 1 laten een goede overlevingskans zien (van 20% tot 89%) en efficiëntie van het verkrijgen van het gewenste fenotype (knockdown via RNAi of genbewerking via CRISPR) met behulp van de hier beschreven injectiemethoden zonder moeizame ei-injecties.
| podium | Reagens | Concentratie ng/μL (Eiwit/gRNA of dsRNA) | N Geïnjecteerd | N Overleving (%) | Geïnjecteerde individuen die nakomelingen leggen | Geïnjecteerde individuen die nakomelingen produceren met fenotypes | Nakomelingen die knockdown/knockout fenotypes tonen | ||||
| N | % | N | % van het totaal geïnjecteerde | % van de individuen die nakomelingen produceren | N | Mutanten/geïnjecteerde poppen of volwassen | |||||
| Witte poppen | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | NA |
| Zwarte poppen | Cas9 | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| BAPC | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 uur-48-uur-oude volwassene | Cas9 | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| * RNAi-experimenten werden uitgevoerd op mannetjes die vervolgens werden gekoppeld aan niet-geïnjecteerde wilde vrouwtjes. Daarom reperesen de aantallen het aantal kruisen dat nakomelingen produceerde en kruisen die fenotypen produceerden. | |||||||||||
| ** Allereerste injectie op poppen door de auteurs. Afkortingen: dsRNA = dubbelstrengs RNA; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; BAPC = vertakte amfifiele peptidecapsules. | |||||||||||
Tabel 1: Overlevings- en efficiëntiepercentage van RNAi en CRISPR/Cas9 via pop- en volwassen injecties. Efficiëntie in RNAi-experimenten staat voor efficiëntie bij het neerhalen van het interessegen, waardoor een meetbaar effect wordt verspeeld, zoals verstoring van de geslachtsverhouding3. Voor CRISPR/Cas9 vertegenwoordigt efficiëntie het aantal geïnjecteerde vrouwtjes dat gemuteerde nakomelingen produceert. Afkortingen: dsRNA = dubbelstrengs RNA; gRNA = gids RNA; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; BAPC = vertakte amfifiele peptidecapsules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met het recente toegenomen gebruik van Nasonia vitripennis als modelorganisme voor verschillende biologische vragen2,3,7,17, is het nodig om injectiemethoden te ontwikkelen en te optimaliseren om een vereenvoudigd en efficiënt protocol voor de functionele analyse van N. vitripennis-genen mogelijk te maken. De huidige methoden met betrekking tot embryonale micro-injection van genbewerkingsreagentia zijn uitdagend13, waarvoor gespecialiseerde apparatuur en hoog opgeleid personeel nodig zijn. Om genbewerkingstechnologie toegankelijker te maken voor niet-gespecialiseerde laboratoria, is het dus van cruciaal belang om alternatieve leveringsbenaderingen van CRISPR-reagentia te ontwikkelen. Daarom is hier een gedetailleerde visuele techniek gedemonstreerd die twee alternatieve injectieprocedures beschrijft om de levering van bewerkingsreagentia (CRISPR / Cas9 of dsRNA) in insectenbloedings- en eierstokken mogelijk te maken.
Injectie van dsRNA in de hemocoel van het insect is een gebruikelijke benadering voor het leveren van dsRNA bij verschillende soorten geleedpotigen18,19,20,21,22. Het is ook efficiënt in N. vitripennis bij gebruik in witte poppen, zoals eerder gemeld3,7. CRISPR/Cas9-methoden voor kiembaaninsectenmutagenese zijn bijna uitsluitend afhankelijk van embryonale micro-invoegsels. Er zijn weinig succesvolle experimenten gemeld die CRISPR-reagentia leveren aan nimfen of volwassenen12,23,24,25,26,27. Over het geheel genomen bieden de hier beschreven methoden een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van de bestaande methoden13. Ten eerste maken ze de injectie mogelijk van verschillende ontwikkelingsstadia van N. vitripennis-wespen: witte, zwarte poppen en volwassenen. Bovendien maakt injectie in de hemolymph knockdown mogelijk via RNAi of kiembaangenbewerking via CRISPR, waarbij embryonale micro-invoegsels worden omzeild.
De eerste stap in dit protocol is het bepalen en screenen van Nasonia-wespen voor de juiste ontwikkelingsfase op basis van de functionele test van belang (bijv. genoombewerking, RNAi). Het is belangrijk om te wennen aan het identificeren van beide geslachten in witte en donkere poppen en volwassenen. N. vitripennis vrouwtjes leggen tot vijftig eieren in het popgeval van de blaasvlieg, S. bullata, en wespenpoppen kunnen gemakkelijk worden verzameld en gescreend in grote aantallen, beginnend bij het witte stadium. Bovendien maakt de mogelijkheid om poppen in verschillende stadia op te slaan om de ontwikkeling gedurende weken bij 5 °C te vertragen, het systeem zeer flexibel in termen van tijd en organisatie9.
De overleving van poppen en volwassenen na injectie is een aspect dat door gebruikers moet worden geoptimaliseerd. In dit protocol beïnvloedde de eerste injectie van CRISPR/Cas9-reagentia in poppen bijvoorbeeld de overleving dramatisch (15%) vergeleken met de overleving van geïnjecteerde volwassenen (90%). In de tweede sessie nam de overleving van poppen echter toe tot 60%. Na verschillende injectiesessies was het mogelijk om een vergelijkbare overleving te behouden (80%-100%) na het injecteren van poppen of volwassenen. Inderdaad, overleving na injectie kan worden verbeterd als parameters met betrekking tot het uitlijnen van de wespen, het selecteren van de juiste opening voor de naald en het vermijden van het doorboren of steken van de wespen met de naald worden geoptimaliseerd.
Het uitlijnen en voorbereiden van poppen en vrouwtjes op injecties, op basis van het hier gepresenteerde protocol, kan de mortaliteit verminderen. Bovendien kan de methode die wordt gepresenteerd om de onbeweeglijke poppen uit te lijnen door ze op de dia te lijmen, het injectieproces vergemakkelijken, omdat het voorkomt dat ze tijdens de injectie bewegen. Zo kan poppen dan zeer snel worden geïnjecteerd, waardoor de tijdrovende aard van de stappen die betrokken zijn bij embryonale micro-invoegingen wordt overspoeld. Bovendien, aangezien injecties kunnen worden gedaan met een mondaspirator, is er geen gespecialiseerde apparatuur nodig om genbewerkingsgebeurtenissen te bereiken. Deze techniek vereist echter dat de wespen tijdig op de lijm worden geplaatst; anders worden ze niet goed bevestigd en glijden ze van de glijbaan af tijdens het inbrengen van de naald. Dit kan worden gecorrigeerd na verschillende uitlijningsproeven.
Volwassenen kunnen niet worden uitgelijnd met deze methode omdat ze hun buik en benen kunnen bewegen; daarom moeten ze worden verdoofd. De voorkeursmethode in dit protocol omvat het plaatsen van de buis met de wespen in ijs gedurende ~ 5 minuten totdat de wespen worden neergehaald en ze vervolgens in groepen overbrengen naar een voorgekoelde glijbaan op ijs. Deze methode maakt het mogelijk om de wespen uit te lijnen en voor te bereiden voor injectie in groepen van 10-15 wespen naar boven gericht, met een nieuwe Petrischaal met ijs voor elke nieuwe injectiegroep. Het voorkomen van het smelten van het ijs tijdens de injectie zal helpen de glijbaan stabiel te houden en het risico op het breken van de naalden of het doden van de wespen per ongeluk te verminderen. Deze stap kan worden verbeterd door een koeltafel te gebruiken, indien toegankelijk.
Als alternatief kunnen CO2-pads worden gebruikt om de wespen te verdoven. Om dit te doen, zou het nodig zijn om de tijd van blootstelling aan CO2 tijdens injectie te optimaliseren en om de effecten van CO2-blootstelling op overleving en vruchtbaarheid te bepalen, zoals eerder gemeld voor andere soorten18. Een extra hindernis bij het injecteren van volwassenen is afhankelijk van de methode die wordt gebruikt om de verdoofde wesp voor injectie vast te houden. Een stomp puntig voorwerp dat de wesp kan vasthouden zonder het risico van piercing of steken is het meest geschikt. Over het algemeen werken dissectienaalden of stompe tangen goed.
Nadat de uitlijning en het juiste vasthouden van de wespen onder de knie is, kan het injectieproces zeer snel verlopen. Poppen en volwassen injecties kunnen worden geïnjecteerd met oplossingsvolumes in het bereik van honderden nanoliters, waardoor de bereiding ervan in verschillende concentraties wordt vergemakkelijkt op basis van de voorkeur van de gebruiker. Het is echter belangrijk om de juiste naalden te gebruiken om de juiste hoeveelheid vloeistof te injecteren zonder het risico van beschadiging en het doden van de wesp. Over het algemeen zijn zeer lange naalden met zeer kleine openingen beter omdat ze minder fysieke schade aan de buik van de poppen veroorzaken. Bovendien is de stroom van de vloeistof traag, vermijdt grote drukveranderingen en vooral voorkomt het lekken van de oplossing door het gat dat door de naald wordt gecreëerd.
De nadelen van een klein diafragma zijn dat de naalden gemakkelijk kunnen breken bij het aanraken van het harde exoskelet van de wespen en ook verstopt kunnen raken met het materiaal vanuit de buik. Daarom werken naalden met kleine openingen heel goed met behulp van een femtojet of een nanoject, en het gebruik ervan vereist grote zorg om te voorkomen dat ze breken. Deze naalden zijn niet geschikt voor een mondaspirator omdat het erg moeilijk is om vloeistof met de mond te injecteren via een klein diafragma. Voor deze methode vereist de ideale naald het minimale diafragma waardoor de oplossing soepel kan stromen en tegelijkertijd de schade kan worden voorkomen die kan worden veroorzaakt met een naald met grote opening. Nogmaals, dit aspect moet worden geoptimaliseerd door de gebruikers. In ieder geval zal het vaak verwisselen van de naald helpen om verstopping en beschadiging van de punt te voorkomen, wat de overleving en efficiëntie zal verminderen.
In N. vitripennis kan elke plaats in de buik worden gebruikt om reagentia in de hemolymph af te leveren. Er moet echter extra voorzichtig worden opgetreden om schade aan de legboor van de wesp te voorkomen, omdat deze wordt gebruikt voor het voeren en leggen van eieren. Voor zowel poppen als volwassenen zijn in dit protocol immobilisatietechnieken voorgesteld om injecteren buiten de legboor mogelijk te maken, voornamelijk in het ventrale gebied naar het voorste deel van de buik. Bovendien kan dit bij volwassenen ook worden bereikt door aan de zijkanten of in het dorsale gebied te injecteren. De in dit document beschreven uitlijnmethode voor poppen kan zijinjectie vergemakkelijken, maar niet dorsaal. In ieder geval zijn inspanningen om het doorboren van andere lichaamsdelen te voorkomen of de buik te beschadigen een prioriteit.
Zodra de naald is ingebracht, moet de vloeistofstroom langzaam en constant zijn. De femtojet maakt dit gemakkelijk mogelijk, hoewel de druk mogelijk voor elke naald moet worden aangepast. Bij gebruik van een mondaspirator moet injectie van grote hoeveelheden vloeistof te snel worden vermeden, omdat dit ertoe kan leiden dat het door de poriën van de injectie lekt. In feite is lekkage, naast het observeren van de zwelling van de buik met vloeistof, een teken om een injectie te stoppen. Nadat de injectie is voltooid, moeten de volwassen wespen op de glijbaan worden achtergelaten totdat ze herstellen en vervolgens worden overgebracht naar een buis met gastheren.
De hier gepresenteerde systemen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere insectensoorten die bijzonder uitdagend zijn voor eimicro-injections. Veel parasitoïde wespen leggen bijvoorbeeld eieren in andere insectenlarven. Eieren zijn daarom onmogelijk te bereiken en te injecteren in die soorten. De eieren van andere plaagsoorten, zoals de Aziatische citrus psyllid Diaphorina citri, zijn ook erg moeilijk te bereiken voor injectie omdat ze zijn bevestigd aan de plant waar ze worden gelegd. Een recent rapport suggereert dat BAPC kan worden gebruikt voor CRISPR-genbewerking in het Aziatische citrus psyllid, D. citri27. Evenzo werd P2C-gemedieerde levering van het eiwit, mCherry, bereikt in de eierstokken van deze soort28, wat suggereert dat deze hier beschreven injectietechnieken de implementatie van RNAi en CRISPR in een breed scala aan insectenplagen kunnen vergemakkelijken en kunnen helpen bij het ontwerpen van bestrijdingsstrategieën die helpen de gewasschade die ermee gepaard gaat te voorkomen.
De implementatie bij andere soorten vereist optimalisatie op basis van de levenscyclus van de betrokken soort. Het is bijvoorbeeld belangrijk om de juiste fase van injectie vast te stellen, ook op basis van de functionele test van belang. Voor de levering van CRISPR/Cas9 in de eierstokken is het dus belangrijk om te weten wanneer vitellogenese actief is om de opname van de genbewerkingsreagentia door de eierstokken24,25,26,27,28mogelijk te maken . Voor een efficiënte knockdown is het daarentegen belangrijk om te weten wanneer het gen wordt uitgedrukt en functioneel is. Toekomstige implementatie van deze injectietechnieken kan de levering van verschillende soorten nucleïnezuren, zoals plasmide-DNA, in insectenbloedings- en eierstokken inhouden. Dit maakt het mogelijk om voorbijgaande expressie van genen in het plasmide-DNA te bevorderen. Bovendien kan het combineren van CRISPR/Cas-reagens met een sjabloon-DNA helpen transgenese te bemiddelen via homologie-gerichte reparatie (HDR) of een transgenese met transgenese veroorzaken, waardoor embryonale micro-injectie wordt omzeild. Concluderend, deze verbeterde techniek kan worden gebruikt om vele soorten functionele analyse te genereren, zoals knockdown via RNAi, inductie van mutaties, deleties en mogelijk zelfs transgene inserties om transgene N. vitripenniste genereren , waarbij transposons worden geassocieerd met BAPC, wat functioneel onderzoek in dit organisme aanzienlijk zou moeten versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLR en DCR hebben voorlopige octrooibescherming aangevraagd op ReMOT Control-technologie. O.S.A is een oprichter van Agragene, Inc., heeft een aandelenbelang en zit in de Wetenschappelijke Adviesraad van het bedrijf. Alle andere auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door UCSD-opstartfondsen die waren gericht op O.S.A. en NSF / BIO-subsidie 1645331 J.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
