Summary
Burada bir küresel görüntüleme cihazının üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu cihaz kanser hücre sferoidlerinin dinamik veya boyuna floresan görüntülemesini sağlar. Protokol ayrıca kanser hücre invazyonunun analizi için basit bir görüntü işleme prosedürü sunmaktadır.
Abstract
Birincil tümörden kanser hücrelerinin bitişik sağlıklı dokulara istilası metastazda erken bir adımdır. İnvaziv kanser hücreleri büyük bir klinik zorluk oluşturur, çünkü yayılmaları başladıktan sonra ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem yoktur. Kanser hücre invazyonunu düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine yol açabilir. Tümörlere fizyolojik benzerlikleri nedeniyle, kollajene gömülü sferoidler, kanser hücresi istilasını hücre dışı matrise (ECM) yöneten mekanizmaları incelemek için araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu test (1) küresellerin ECM'ye gömülmesi üzerinde kontrol eksikliği ile sınırlıdır; (2) kollajen I ve cam alt yemeklerin yüksek maliyeti, (3) antikorların ve floresan boyaların verimsiz penetrasyonu ve (4) verilerin zaman alıcı görüntü işlemesi ve nicelemesi nedeniyle güvenilmez immünofluoresan etiketleme. Bu zorlukları ele almak için, üç boyutlu (3D) küresel protokolü, kollajen I'e gömülü floresan etiketli kanser hücrelerini zaman atlamalı videolar veya boyuna görüntüleme kullanarak görüntülemek ve kanser hücresi istilasını analiz etmek için optimize ettik. İlk olarak, sferoidleri güvenilir bir şekilde ve minimal bir kollajen I hacmine gömmek için bir küresel görüntüleme cihazının (SID) imalatını tarif ediyoruz ve test maliyetini azaltıyoruz. Daha sonra, canlı ve sabit küresellerin sağlam floresan etiketlemesi için adımları tanımlamaktadır. Son olarak, görüntü işleme ve veri nicelemesi için kullanımı kolay bir Fiji makrosu sunuyoruz. Tamamen, bu basit metodoloji kollajen I'de kanser hücresi invazyonunu izlemek için güvenilir ve uygun fiyatlı bir platform sağlar. Ayrıca, bu protokol kullanıcıların ihtiyaçlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir.
Introduction
Kanserin ilerlemesi sırasında, kanser hücreleri hareketli ve invaziv bir fenotip elde edebilir, tümör kütlesinden kaçmalarını ve çevre dokulara istila etmelerini sağlar1. Sonunda, bu invaziv kanser hücreleri ikincil organların içine ulaşabilir ve büyüyebilir, kanser metastazı1. Metastaz kansere bağlı ölümlerin% 90'ından fazla neden olur2. Bunun bir nedeni, lokalize tümörler klinik olarak yönetilebilir olsa da, metastatik yayılma meydana geldikten sonra invaziv kanser hücrelerinin ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem bulunmamasıdır. Bu nedenle, invaziv kanser hücrelerinin ortaya çıkması ve lokalize bir hastalıktan invaziv bir hastalığa geçiş büyük bir klinik zorluk oluşturmaktadır. Kanser hücrelerinin invaziv bir davranışı nasıl başlattığını ve sürdürdüğünü belirlemek, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine neden olabilir.
3D küresel model, kontrollü, ancak fizyolojik olarak ilgili koşullar altında kanser hücrelerinin hareketli davranışlarını araştırmak için ideal bir platformdur3. Gerçekten de, bu testte, kanser hücrelerinin küreselleri hücre dışı matrisin (ECM), örneğin basitleştirilmiş bir tümörü taklit eden kollajen I'in içine gömülür. Daha sonra, görüntüleme, kanser hücrelerinin sferoidden kollajen matrisine invazyonunun görselleştirilmesi için kullanılır. Ancak, birden çok zorluk bu yordamı sınırlar.
İlk zorluk, sıvı kollajen matrisinin çanak yüzeyine yayılabileceği ve küreselin yemeğin dibine dokunmasına neden olan gömme adımında gerçekleşir. Sonuç olarak, küreselden gelen hücreler iki boyutlu (2D) yüzeye yayılır ve üç boyutlu (3D) küresel morfolojiyi kırır. Kollajen hacmini artırmak verimli, ancak maliyetli bir çözümdür. Hücrelerin 2D yüzeye yayılmasını önlemek için, minimum miktarda kollajen korurken, 1 mm kalınlığında, 3 delikli bir polidimetilsiloksan (PDMS) kesici ucu cam bir alt kabın üzerine bağlayarak bir küresel görüntüleme cihazı (SID) geliştirdik.
Küresel testin ikinci zorluğu, sferoid boyutu ile artan bir etki olan antikorların ve floresan boyaların zayıf penetrasyonu ile sınırlı olan sferoidlerdeki kanser hücrelerinin etiketlenilmesidir. Hücreleri etiketlemek için ideal çözüm, floresan proteinleri(leri) kasten ifade eden hücre hatlarının kurulması olsa da, bu seçenek çoğunlukla ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarıyla sınırlıdır ve floresan protein chimeras mevcudiyeti ile sınırlıdır. Burada, sabit sferoidlerin immünofluoresans boyanmasının yanı sıra, küreseli gömmeden hemen önce hücreleri etiketlemek için sitoplazmik bir boyanın verimli kullanımı için optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz.
Küresel testlerin üçüncü zorluğu, zaman içinde hücre istilasının yarı otomatik ölçülmesi için basit Fiji makrolarının olmamasıdır. Bu zorluğu ele almak için, zaman içinde küresel alanı analiz etmek için basit bir metodoloji açıklıyoruz. Örnek olarak 4T1 ve 67NR hücre çizgilerini kullanarak bu protokolün avantajlarını gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Küresel gömmeyi optimize etmek için bir Küresel Görüntüleme Cihazının (SID) imalatı (Süre 1 gün)
- Aralayıcıyı bir 3D yazıcı kullanarak oluşturun (Şekil 1A, B ve Tamamlayıcı Dosya 1).
- Polidimetilsiloksan (PDMS) oluşturmak için plastik bir kapta 10:1 (wt/wt) taban polimer:çapraz bağlantı oranını [örneğin, 20 g etilbenzen baz polimer ve 2 g silikon reçine çaprazlayıcı] tartın.
- PDMS çözeltisini tek kullanımlık pipet kullanarak plastik bardakta iyice karıştırın.
- Hava kabarcıklarını karışımdan çıkarmak için plastik kabı bir vakum odasına yerleştirin. Karışımın yüzeyine sıkışan az miktarda havayı çıkarmak ve kalan hava kabarcıklarını dağıtmak için vakum basıncını hızla serbest bırakın.
- Esnekliğini artırmak için 3D baskılı ara çubuğu 100 °C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- PDMS kalıbını inşa etmek için kullanılacak iki cam plakayı % 100 izopropanol ile silerek iyice temizleyin. Cam plakalar daha önce PDMS dökmek için kullanılmışsa, cam plakaları jiletle hafifçe kazıyarak ve% 100 izopropanol ile silerek kalan eski PDMS'leri çıkardığınızdan emin olun.
- 3D baskılı ara çubuğu iki temiz cam plakanın arasına yerleştirerek kalıbı oluşturun.
- Cam plakaların dış kenarlarında büyük bağlayıcı klipsler kullanarak kalıbı kapatın. Alt kenara iki cilt klipsi ve üst köşeye bir tane yerleştirin.
- Ara parçanın cam plakalarla yıkandığından emin olmak için kalıbın üst kısmını inceleyin. Bu, herhangi bir deformasyon olmayacağını ve eşit bir PDMS sayfası oluşturulacağını garanti eder.
NOT: Elde edilen levha düzgün kalınlıkta değilse, klipslerin hafifçe ayarlanması gerekir. - Tek kullanımlık pipet ucunu kesin (uçtan ~ 2 cm) ve PDMS karışımını kalıbın sol üst köşesine yavaş ve sabit bir hızda ekleyin. Büyük hava ceplerinin oluşturulmasını önlemek için karışımı yavaşça dökün.
- Dökme sırasında oluşan hava kabarcıklarını çıkarmak için kalıbı bir vakum odasına yerleştirin.
- Kalıbı 1 saat boyunca 100 °C'de kuluçkaya yatırarak PDMS'yi tedavi edin.
- Kalıbı inkübatörden alın ve dokunmak için soğumasını bekleyin.
- Cilt klipslerini ve cam plakaları kürlenmiş PDMS'yi içeren aralayıcıdan çıkarın.
- Aralayıcı ve cam plaka arasındaki kalıbın dört tarafında oluşturulan contayı kesmek için bir jilet kullanın. Dört tarafı da kesilmişken, ara parçadaki PDMS levhasını ortaya çıkarmak için kalıbı ayırmaya başlayın.
- Yeni PDMS sayfasını cımbız kullanarak aralayıcıdan dikkatlice soyun.
- Bir kesme paspasında, tabakadan 17,5 mm çapında PDMS diskleri delme ve ardından farklı boyutlarda biyopsi zımbaları kullanarak eşit dağıtılmış üç adet 5,5 mm çapında delik açın. Burada bu 3 delikli PDMS diskleri "ekler" (Şekil 1C) olarak adlandırılır.
NOT: PDMS'ye yapılan nonuniform kesimler veya plazma tedavisi yoluyla hatalı bir bağlama, gelecekteki sızıntılara neden olabilir. - Bant kullanarak toz parçacıklarını nazikçe çıkararak her kesici ucu temizleyin.
- Kesici uçları çift taraflı bir bant parçasına yapıştırın ve bandı 10 cm'lik bir Petri kabının kapağına sarın.
- Petri kabının kapağını, açık 35 mm cam alt tabaklarla birlikte plazma makinesine yerleştirin.
- 300 mTorr'da 1 dakika plazma tedavisi ile kesici uçların ve camın yüzeyini etkinleştirin. Elde tutulan plazma değneği kullanılabilir.
- Cımbız kullanarak, bir kesici ucun(Şekil 1D)ters tarafını, yani işlenmiş tarafını bir cam alt kabın cam kısmına(Şekil 1E)hızla takın. Tüm yemekler için tekrarlayın.
- Cam alt kabı döndürürken eşit basınç uygulamak için işaretçi parmağınızı ve başparmağı kullanın. Bu, kesici ucun cam alt çanağa sabit bir şekilde sabitlenmesini sağlayacaktır.
- Cam ve PDMS arasındaki yapışkanı güçlendirmek için SID'leri (Şekil 1F) 60 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1.21. adımdakiyle aynı ayarları kullanarak veya elde tutulan değnekle SID'lerde ikinci bir plazma tedavisi gerçekleştirin. Bu, serbest PDMS yüzeyinin kaplama çözeltisinde poli-L lizine yapışmasını sağlayacaktır (bkz. 1.26).
- Aşağıdaki çözümleri yeni hazırlayın.
- Kaplama çözeltisi: %0,01 (vol/vol) poli-L-Lizin içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 90 μL'sine %0,1 (vol/vol) poli-L-Lizin'in 10 μL'sini ekleyin].
- Çapraz bağlama çözeltisi: 1x (vol/vol) glutaraldehit içeren damıtılmış su [örneğin, 90 μL damıtılmış suya 10 μL 10x glutaraldehit ekleyin].
- Depolama çözümü: 10x (vol/vol) Penisilin-Streptomisin içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 9 mL'sine 100x Penisilin-Streptomisin 1 mL ekleyin].
- Her delik başına 35 μL kaplama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Poli-L-Lizin'i epire edin ve tüm SID'yi damıtılmış suyla 3 kez durulayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırarak her delik başına 35 μL çapraz bağlama çözeltisi ekleyin.
- Çapraz bağlama çözeltisini epire edin ve tüm SID'yi damıtılmış suyla 3 kez durulayın.
- Her SID'ye %70 etanol ekleyin ve 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığın altına yerleştirin.
- Kaputun altında etanol epire edin ve SID'yi damıtılmış suyla 3 kez durulayın.
- Her SID başına 2,5 mL depolama çözümü ekleyin.
NOT: Bu aşamada, SID'ler bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. PDMS ile cam arasındaki bağlama mukavemetinin zamanla azaldığı gözlendi. Bir haftadan sonra, kullanıcıların kullanımdan önce SID'leri olası sızıntılara karşı test etmeleri önerilir. Bunu yapmak için, depolama çözümünü epire edin ve her deliğe 35 μL 1x PBS ekleyin. Kullanımdan sonra, PDMS kesici uçları cam alt tabaklardan soyulabilir. Cam alt tabakların optimum temizliğini sağlamak için, PDMS kalıntılarını gidermek için izopropanol ve hidroklorik asit ile çeşitli yıkamalar kullanılmalıdır.
2. Küresel oluşum ve kollajene gömme (Süre 4 gün)
NOT: Sferoidlerin uzunlamasına veya hızlandırılmış videolarda canlı görüntülenmesi için sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteini ifade eden bir hücre hattı kullanın. Böyle bir hücre satırı varsa, bu bölümde açıklanan adımları izleyin. Alternatif olarak, bölüm 3'te, sitoplazmik bir boya kullanarak küresellerdeki kanser hücrelerini etiketlemek için bir protokol önerilmiştir.
- 3.000 hücre/40 μL damlacık ve 3 günlük kuluçka süresi ile daha önceaçıklandığıgibi, asılı bırakma tekniğini kullanarak 4T1 ve/veya67NRhücrelerinin küresellerini oluşturur. Sığır atelocollagen I çözeltisini en son ekleyin ve tüm çözeltileri her zaman buz üzerinde koruyun.
- Parlak alan mikroskobu kullanarak doğru oluşturulmuş küreselleri tanımlayın.
- 15 mL konik bir tüpü önceden ısıtılmış 8 mL komple ortamla doldurun.
- Bir P1000 pipet ile küreselleri toplayın ve 15 mL konik tüpe aktarın. Pipet ucunun iç duvarlarına sferoidlerin yapışmasını önlemek ve küresel kaybı sınırlamak için pipet ucunu tam bir ortam içine ve dışına pipetleyerek ıslatın.
- Küresellerin tüpün dibine batmasına izin verin ve ortamı değiştirerek küreselleri dikkatlice yıkayın. İki kez tekrarlayın.
- Üreticinin önerilerine göre 5 mg/ mL kolajen I çözeltisi hazırlayın (alternatif jelasyon prosedürü, aşağıdaki örnek hesaplamaya bakın). Damıtılmış suyu tam orta ile değiştirin. Kullanılacak ortamın hacmini hesaplarken, küresellerin 20 μL tam ortamda ekleneceklerini dikkate alın [örneğin, bir SID için, 3 x 30 + (3 x 30) x % 20 = 108 μL 5 mg/ mL kollajen I gereklidir (viskoz sıvıları işlerken pipet kaybını hesaba katmak için% 20 ekstra hazırlayın); 22 μL komple orta + 10,8 μL 10x PBS + 1,2 μL 1 M NaOH + 54 μL 10 mg/mL kollajen I stok].
- Tüm küreselleri bir P200 pipet kullanarak 20 μL orta miktarda toplayın ve 2.6 adımda hazırlanan kollajen I çözeltisine ekleyin.
- Kollajen I konsantrasyonunda heterojenliği önlemek için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın, kabarcık oluşumunu sınırlayın. Çözeltiyi buzda tut.
- Depolama çözümünü SID'lerden çıkarın ve 3 mL 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kollajen I çözeltisini seyreltmemek için SID'leri kuru bırakın.
- Bir zamanlayıcı başlatın ve bir küresel içeren kollajen I çözeltisinin 30 μL'lik kısmını SID'nin üç deliğinden birine dağıtın. Görsel olarak 30 μL'de tek bir küreselin bulunduğundan emin olun.
- Sid'in 3 deliğini doldurmak için 2.10.
- PDMS sınırına yakın bir konumdaysa küreseli yeniden ortalamak için 10 μL pipet ucu kullanın. Deliklerden birinde iki veya üç sferoid dağıtılırsa, küreselleri birbirinden ayırmak için aynı pipet ucu kullanılabilir. Zamanlayıcıyı durdurun.
NOT: Kollajen I polimerizasyonu ve katılaşma süresi boyunca SID'nin sık sık baş aşağı ve baş aşağı çevrilmesi, küreselin ECM tabakasının dikey merkezine yerleştirilmesini sağlar ve hücrelerin 2D olarak istilasını önler. Ters çevirme (çevirme) sıklığı en üst düzeye çıkarılmalıdır. Çevirme frekansı 2.10-2.12 olarak ölçülen küresel "dağıtım süresi" ile kontrol edildikçe, dağıtım süresi en aza indirilmelidir. Laboratuvarımızda dağıtım süresi ortalama 2 dakikadır. - Sferoidi kollajen tabakasında dikey olarak ortalamak için SID'yi ters çevirin ve dağıtım süresi için 37 °C'de kuluçkaya yaslayın.
- SID'yi ters çevirin ve dağıtım süresi için 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
NOT: Küresellerin baş aşağı yönelimde geçirdikleri süre, baş aşağı yönelimde harcanan zamana eşit olmalıdır. - Kollajen I polimerize olana kadar 30 dakika boyunca 2.13 ve 2.14 adımlarını tekrarlayın.
- 2,5 mL tam orta/SID ekleyin ve gerekirse ilk zaman noktası için küresellerin bir görüntüsünü alın.
- Birden çok SID kullanılıyorsa 2.10-2.16 arası adımları yineleyin.
3. Küresellerin floresan etiketlemesi
- Canlı görüntüleme (Süre 6-7 gün)
NOT: Sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteini ifade eden bir hücre hattı varsa, bölüm 2'de açıklanan adımları izleyin. Alternatif olarak, sitoplazmik etiketleme için aşağıdaki protokol önerilmiştir.- Bölüm 2'de açıklanan protokolün 2.1-2.5 adımlarını izleyin.
- Sitoplazmik boyayı serumsuz ortamda 200 μL'de 25 μM'ye seyreltin.
NOT: Bu deneyde kırmızı sitoplazmik boya kullanılırken, mevcut diğer renklerin uygun olması gerekir. Kanser hücreleri, serumsuz ortamın 200 μL'sinde 20 μM'ye seyreltilmiş nükleer boyalar kullanılarak küresellerin içinde etiketlenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). - Son yıkamadan sonra, sitoplazmik veya nükleer boya çözeltisinde sferoidleri yeniden depolayın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatın.
NOT: Bu yaklaşımla, küresel merkezdeki hücrelerin etiketlenmesi verimli olmayacaktır. Tüm hücrelerin etiketlenmesine ulaşmak için, tabağı bir rocker üzerine yerleştirerek kuluçka bir gecede uzatılabilir. Alternatifler Tartışma'da açıklanmıştır. - Küreselleri tam ortamda 3 kez yıkayın.
- Bölüm 2'de açıklanan protokolün 2.6-2.17.
- Görüntü sferoidleri 24-72 saat boyunca her 10 dakikada bir zaman atlamalı görüntüleme yoluyla(Şekil 2) veya boylamsal görüntüleme yoluyla, günlük, 7 güne kadar(Şekil 3). Lazer tarama konfokal mikroskobu, 10x hava hedefi (0,4 sayısal diyafram ve 3,1 mm çalışma mesafesi), 1024 x 1024 piksel, pozlama süresi 8 μs/piksel, iğne deliği 90 μm, 6 x 15 μm z-adımlar ve her biri bir küreseloid içeren 3 görüş alanı kullanın.
NOT: Hızlandırılmış görüntüleme için minimum lazer gücü kullanın ve mikroskobu sıcaklık, nem ve gaz kontrolü ile çevresel bir oda ile donatın. Mikroskop üzerindeki süreyi en aza indirmek için gömülü küreselleri görüntülemeden önce 37 °C'de > 8 saat veya gece boyunca kültüre edin.
- Sferoidlerin immünofluoresans lekesi (Süre 2 gün)
NOT: Burada açıklanan yordam, daha önce yayınlanan8,9 protokollerinden uyarlanmış ve optimizeedilmiştir. Bu yöntem, bölüm 2 ve 3.1'de özetlenen protokolden sonra kullanılabilir.- Aşağıdaki çözümleri yeni hazırlayın.
- Sabitleme çözümü: %4 PFA (vol/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 15 mL'sine %16 (vol/vol) PFA'nın 5 mL'sini ekleyin].
- Sabitleme ve permeabilizasyon çözümü: %4 PFA (vol/vol) ve %0,5 Triton X-100 (vol/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 50 μL Triton X-100 ila 10 mL sabitleme çözümü ekleyin].
- Engelleme çözümü: %1 FBS (vol/vol) ve %1 BSA (wt/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 10 mg BSA'yı 10 mL 1x PBS'de çözün, ardından 100 μL FBS ekleyin].
- Yıkama çözeltisi: %0,05 Ara 20 (vol/vol) içeren 1x PBS [örneğin, 1x PBS'nin 20 ila 50 mL arası 25 μL ekleyin].
- Kültür ortamını SID'lerden çıkarın ve ılık 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- SID başına 2 mL sabitleme ve permeabilizasyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Sabitleme ve permeabilizasyon çözeltisini çıkarın ve SID başına 2 mL sabitleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- Yıkama solüsyonu ile 3 kez yıkayın.
- SID başına 2 mL blokaj çözeltisi ekleyin ve hafif sallama ile 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu adımda, numuneler hafta sonu boyunca 4 °C'de inkübe edilebilir. Daha uzun bir engelleme süresinin immünoresans etiketleme prosedürünü engelleyebileceğini lütfen unutmayın. - Blokaj çözeltisinde birincil antikorları seyreltin.
- 48 kuyulu bir plakaya birincil antikorlar / kuyu ile 150 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
- İnce cımbız kullanarak, bir küresel içeren kollajen fişini dikkatlice ayırın ve bir kuyuya aktarın. Birden çok küresel etiketlenmişse tekrarlayın. Kontaminasyonu önlemek için farklı antikorlarla çalışırken cımbızda kalabilecek sıvıları silin.
- Hafif titreme ile 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Boş ve tam kuyulara 300 μL yıkama çözeltisi ekleyin.
- Bir küresel içeren kollajen fişini dikkatlice bir "yıkama" kuyusuna aktarın.
- 2 saat boyunca yıkama çözeltisi ile oda sıcaklığında ve hafif sallanarak 3 kez yıkayın.
NOT: Bir küresel içeren kollajen fişlerinin aktarılması, çözümleri arzu etmek yerine, numune kaybını ve numune hasarını azaltmaya yardımcı olabilir. - Sekonder antikorları seyreltin, blokaj çözeltisinde 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ve/veya phalloidin.
- Kuyu başına ikincil antikorlar, DAPI ve/veya phalloidin ile 150 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
- Cımbız kullanarak, küreselleri içeren kollajen fişini dikkatlice kuyuya aktarın. Birden çok küresel etiketlenmişse tekrarlayın.
- Hafif sallama ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- 3.2.11 ve 3.2.12 adımlarını yineleyin.
- 30 dakika boyunca yıkama çözeltisi ile 3 kez, hafif sallama ile oda sıcaklığında yıkayın.
- Jilet kullanarak, her parçanın bir delik içermesi için 3 delikli bir PDMS kesici ucu üç parçaya bölün.
- Mikroskop slaydına iki parça PDMS yerleştirin.
- Ucu kesilmiş bir P200 ucu kullanarak bir damla montaj çözümü ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyin.
- Her deliğe taktığım bir kolajeni dikkatlice aktarın.
NOT: Sferoid kollajen fişinin üstüne yerleştirilmişse, kollajen fişini ters çevirin, böylece sferoid cam kapak ucuna daha yakın olur. - Üzerine bir kapak kılıfı yerleştirin ve bant kullanarak kapatın.
- Numunenin oda sıcaklığında 10 dakika kurumasına izin verin, ışıktan korunun.
- Numuneleri görüntülemeye kadar ışıktan korunarak 4 °C'de saklayın.
- Aşağıdaki çözümleri yeni hazırlayın.
4. Zaman içinde kanser istilasını analiz etmek için görüntü işleme
NOT: Bu makro için gereken biçim, .tiff dosyası olarak kaydedilen tek kanallı x,y,t görüntüsüdür.
- Birden çok z dilimi (x,y,z,t görüntü) edinilmişse, görüntüyü Fiji'de açın ve Görüntü | Yığınlar | Z Projesi. Maksimum Yoğunluk seçeneğini kullanmanız önerilir. Alternatif olarak, makroyu çalıştırmak için tek bir z dilimi kullanılabilir. Görüntüyü .tiff dosyası olarak kaydedin.
- Masaüstünde ayrı bir "İşleme" klasörü oluşturun.
- Dosya | Seç Farklı Kaydet | Görüntü Sırası. TIFF biçimini kullanın, kare sayısına göre basamak numarasını güncelleştirin, dilim etiketini dosya adı olarak kullanmak için kutuyu işaretleyin ve Tamam 'ıseçin. 2. adımda oluşturulan "İşleme" klasörünü seçin.
- "İşleme" klasöründen bir resim açın. Tek bir zaman noktasına karşılık gelen bir x,y görüntüsü olmalıdır.
- Görüntü | Seç | ayarlama Otomatik Eşik. Açılır menüde Tümünün dene yöntemini seçin ve siyah arka plandaki beyaz nesneler kutusunu işaretleyin.
- Her otomatik eşikleme yönteminin sonucunu gösteren bir montaj görüntüsü görüntülenir.
- En iyi otomatik eşik yöntemini tanımlayın, örneğin RenyIEntropy.
- Otomatik eşikleme yönteminin seçimini onaylamak için, "İşleme" klasöründen başka bir görüntüyü açın ve Image | kullanarak seçilen eşik yöntemini sınayın | ayarlama Otomatik Eşik.
- Tüm görüntüleri kapatın.
- SpheroidAreaTime makrosunu indirin (Tamamlayıcı Dosya 2).
- Sürükle ve bırak ile Fiji makrosunu açın.
- Satır 58'de, otomatik eşikleme yöntemini gerektiği gibi güncelleştirin.
- Satır 62'de, boyut aralığını hücre boyutlarına göre güncelleştirin.
- Çalıştır 'ıseçin.
- "İşleme" klasörünü seçin ve Üst klasör olarak "İşleme" yazın, sonra Tamam 'ıseçin.
- Çalıştırma bittikten sonra "Özet" tablosunu kaydedin. İlk sütun görüntünün adını gösterir; üçüncü sütun küresel alanı gösterir; altıncı, yedinci ve sekiz sütun, küresel üzerine takılan bir elips için parametreleri belirtir.
- "İşleme" klasörü artık her zaman noktası için _SpheroidArea uzantılı işlenmiş bir görüntü içeriyor.
NOT: Küresel merkez soluksa, tüm zaman noktaları için seçim araçlarını kullanarak beyazla doldurun ve 3. Benzer şekilde, görüntüyü "temizlemek" için küreselin etrafındaki boşluk siyahla doldurulabilir. Görüntü temizse, çalıştırmayı hızlandırmak için satır 61'i yorumla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyouyumluluğu nedeniyle PDMS, mikropatterning ve mikroakışkan cihazlarda devrim yapan hapsedici kuyuların, pulların ve kalıpların mikrofabrikasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada açıklanan yöntemde, Sferoid gömme ve görüntüleme prosedürünü optimize eden SID'ler, özelleştirilebilir kuyular oluşturmak için kullanılır. Şekil 1, SID'lerin imalatında kullanılan ana bileşenleri göstermektedir. PDMS kalıbını dökmek için, 1 mm kalınlığında bir aralayıcı, iki cam plaka arasına yerleştirilmiş, büyük klipslerle kapatılmış 3D baskılıdır (Şekil 1A,B). PDMS'yi plakalar arasındaki boşluğa dökmek ve pişirmek 1 mm kalınlığında bir PDMS tabakası oluşturur. SID şeması (Şekil 1C) en uygun cihazın boyutlarını gösterir, ancak biyopsi zımbaları kullanılarak deliklerin manuel olarak delinmesi nedeniyle delik mesafelerinde hafif farklılıklar meydana gelir (Şekil 1D). Şekil 1D,F, PDMS kesici uç içinde eşit aralıklı deliklerle temiz dairesel kesimleri gösterir.
SID'lerin kullanılması verimli gömmeyi kolaylaştırır ve bu nedenle zaman atlamalı ( Şekil 2 , Video 1) veya boyuna ( Şekil3) görüntüleme kullanarak kollajen içindeki kanser hücrelerinin istilasının kaydedilmesini sağlar. Kollajen I polimerizasyonu sırasında tüm SID'ler için aynı ters çevirme frekanslarını kullanmasına rağmen, kollajen fişinin içindeki küresel konumlar biraz değişecektir. Bu nedenle, uzun çalışma mesafesine (>1 mm) sahip bir hedef kullanmak önemlidir. Aksi takdirde kollajen fişinin üst kısmına yakın konumlandırılmış küreseller için odaklanma ve görüntüleme zor olabilir. Buna karşılık, kollajen fişinin altına yakın konumlandırılmış küreseller, kollajen I matrisine istila etmek yerine cam yüzeye taşınan ve cama göç eden hücrelere sahip olacaktır. Bu tür küresellerin videolarının atılması gerekir. Burada yaklaşık 800 μm olan kollajen fişinin kalınlığı, SID'nin her deliğinde dağıtılan hacim tarafından kontrol edilir ve sferoidlerin bu protokolde sergilediği istila mesafelerine göre ayarlanır. Kollajen fişinin kalınlığı, daha küçük veya daha az invaziv sferoidler kullanırken, SID'nin her deliğine daha düşük hacimli bir kollajen I dağıtılarak azaltılabilir.
Fiji makrosunu kullanarak istilanın doğru analizi için, kanser hücrelerinin görüntüleme seansı boyunca düzgün bir şekilde etiketlenmiş olması önemlidir. 4.17. adımda belirtildiği gibi, görüntü işleme adımı, etiketleme en uygunun altındaysa görüntü düzeltmeye izin verir. Sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteinin stabil ekspresyonını gerektiren 6 gün boyunca boyuna görüntülemeyi gösterirken (Şekil 3), benzer uzunlamasına görüntüleme boyalarla etiketleme kullanılarak daha kısa sürede yapılabilir.
Canlı görüntülemenin ardından epitel cadherin (E-cadherin), korteksin ve F-actin için immünal etiketleme işleminden bazı sonuçlar sunuyoruz (Şekil 4). Bu örneklerde 4T1 ve 67NR hücre hatlarını kullandık. Şekil 5, zaman içinde küresel alanı ölçmek için Fiji makrosunu kullanarak görüntü işleme prosedürünün adım adım çizimini gösterir.
Şekil 1: SID'lerin imalatı. (A) Aralayıcının şematik gösterimini üst görünüm. (B) 3D baskılı aralayıcı. (C) SID'nin üst görünüm şematik gösterimi. 3 delikli PDMS ekler (D) cam bir alt tabağa (E) bağlanır ve son SID'yi (F)oluşturur. Boyutlar milimetre cinsindendir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Küresellerin canlı görüntülenmesi. Video 1'den temsili 20 h ve 40 h zaman noktaları, 4T1 küreselinin maksimum projeksiyonu. Sitoplazmik boya kullanılarak 4T1 hücreleri etiketlendi. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sferoidlerin boyuna görüntülenmesi. Her gün görüntülenmiş karışık bir 4T1/67NR küreselinin temsili mikrografileri (maksimum projeksiyon). 4T1 ve 67NR hücreleri sırasıyla sitoplazmik mScarlet ve yeşil floresan proteini (GFP) saptırır. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sferoidlerin immünoresans görüntülemesi. Kollajen I. E-cadherin (siyan, A), korteksin (sarı, B) ve F-actin 'e (macenta, A ve B) gömüldükten 2 gün sonra sabitlenen 4T1 sferoidin temsili mikrografileri (maksimum projeksiyon) etiketlendi. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Görüntü işleme analizi. Zaman içinde küresel alanı ölçmek için Fiji makrosunu (A) kullanarak görüntü işleme prosedürünün adım adım çizimi (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: 46 saat ve 10 dakika boyunca her 10 dakikada bir görüntülenen 4T1 küreselinin temsili videosu sitoplazmik bir boya kullanılarak etiketlendi. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek dosya 1: Aralayıcının 3D modeli (STL dosyası). Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek dosya 2: SpheroidAreaTime makrosu. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D baskılı aralayıcı, deneysel uygulamaların gerektirdiği şekilde, pdms'nin çeşitli şekillerini kolayca oluşturmak için kullanılabilecek 1 mm kalınlığında PDMS sayfaları oluşturmak için tasarlanmıştır. İmalatının basitliği ve tasarımı değiştirme özgürlüğü nedeniyle, SID'nin ilk tasarımı için bu PDMS döküm yöntemi seçildi. Yüksek hacimli SID'ler gerekiyorsa, zaten üç eşit aralıklı deliği olan PDMS diskleri içeren 3D baskılı bir kalıp oluşturularak ve işlem tek adıma düşürülerek üretim daha verimli hale getirilebilir. Bu, sonraki üç delik ile birlikte her diski delme ihtiyacını ortadan kaldırır ve genel hazırlık süresini azaltır.
3 delikli zımba 35 mm cam alt tabaklarla kullanılmak üzere geliştirilirken, daha fazla delik ve dolayısıyla paralel olarak daha fazla küresel görüntü alınmasına izin veren diğer boyutlar mevcuttur. Ek olarak, 3D baskılı tutucularla birlikte yüksek verimli küresel testlere izin verebilen özel boyutlu kapak camı da ticari olarak mevcuttur. Böyle bir yaklaşımla, sınırlayıcı faktör veri toplama hızıdır - örneğin, çok renkli zaman atlamalı konfokal görüntülememizde, tek bir küreselin 3D yığınını elde etmek yaklaşık 2,5 dakika gerektirir. Bu nedenle, SID'de 3 küresel için 3D yığınlar elde etmek yaklaşık 8 dakika gerektirir. Sonuç olarak, tercih ettiğimiz görüntüleme frekansını yığın başına 10 dakikada tutmak için SID'lerdeki delik sayısını artıramayız.
3D küresel modelde canlı kanser hücrelerinin istilasını kaydetmek ve ölçmek için parlak alan görüntülemekullanılabilir 5. Bununla birlikte, görüntü işlemede daha fazla kontrast ve kolaylık ve hassasiyet sağladığı için floresan mikroskopi tercih edilir. Sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteini ifade eden bir hücre hattının üretilmesi mümkün değilse sitoplazmik boyaların kullanılmasını öneriyoruz. Sitoplazmik boyaların hücrelerin içindeki tutma süresi görüntüleme koşullarımızda üç gün olduğundan, hücreler asılı düşüşteki 3 günlük süreyi takiben ve gömülmeden hemen önce etiketlenmelidir. Katıştırma sonrası hücrelerin etiketlenmesi kollajeni özel olarak etiketlemeyebilir ve hücre etiketlemesini azaltabilir. Gömülme sonrası 3 günden daha uzun süre görüntüleme, floresan proteinleri (proteinleri) kasten ifade eden farklı bir küresel tohumlama protokolü10 veya hücre hatlarının kullanılmasını gerektirir.
60 ila 5.000 hücre/damla içeren sferoidleri başarıyla oluşturduk ve görüntüledik. Küçük küreseller, tüm istila alanları daha yüksek büyütme (20x-30x) hedeflerinin tek bir görüş alanına kolayca sığabileceğinden, birden fazla gün boyunca istilayı kaydetmek için idealdir. Ek olarak, sitoplazmik veya nükleer boyalarla kolayca etiketlenebilirler. Son olarak, saçılmanın azalması nedeniyle, küreseldeki her hücre görselleştirilebilir ve segmentlere ayırılabilir. Bununla birlikte, küçük küreseller çıplak gözlerle zar zor görülebilir ve doku belirteçleri ile ek etiketleme gerektirebilir. Buna karşılık, daha büyük küresellerin kullanımı daha kolaydır, ancak ağırlıkları nedeniyle yemeğin dibine batmaya daha duyarlıdır. Ayrıca, küresel merkezdeki hücreler boya kullanırken her zaman etiketlenir veya yaklaşık 100 mikrometre penetrasyon derinliğine sahip konfokal mikroskopi kullanılarak görünmez. Zaman atlamalı görüntüleme kullanarak büyük sferoidler boyunca tüm kanser hücrelerini görselleştirmek için multifotoğraf mikroskopisi kullanılabilir ve etiketlemeye gerek kalmadan ikinci harmonik nesil (SHG) tarafından kollajen lifleri görselleştirmesinin ekstra bir avantajını sunar. Ayrıca, görüntüleme ışık sayfası mikroskopisi8,11,12ile yapılabilir, daha az görüntü alma süresi sağlar ve bu nedenle yüksek verimli küresel testlere izin verir, aynı zamanda daha fazla veri depolama ve gelişmiş görüntü işleme gerektirir. Hızlandırılmış videolar gerekli değilse, sabit 3D küreseller için etiketleme prosedürümüz optik temizleme8,10ile daha da birleştirilebilir. Ek olarak, gömülü küresellerin kriyoseksiyonu, etiketleme sırasında boya veya antikor penetrasyonu ve görüntüleme sırasında ışığın penetrasyonu ile ilgili sorunları ortadan kaldırabilir. Bununla birlikte, elimizde, başarılı kriyoseksiyon, uzun ve kırılgan invaziv iplikçiklerin korunmasındaki teknik zorluklar nedeniyle istilanın erken aşamaları ve invaziv olmayan hücrelerle sınırlıydı.
Protokolümüz ayrıca nükleer boyaların kullanımıyla da uyumludur, küresellerin içindeki kanser hücrelerini etiketlemek için, zaman atlamalı verilerin tek hücreli takibini sağlar. Fiji eklentisi TrackMate13, hücre takibini otomatikleştirmek ve hız, anlık hız ve kalıcılık gibi tek hücrelerin hareketlilik parametrelerini ayıklamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Temple Bioengineering üyelerine değerli tartışmalar için teşekkür ederiz. Akış sitometri çekirdeğinden (Lewis Katz Tıp Fakültesi) David Ambrose'a hücre ayıklama konusundaki yardımı için ve IDEAS Hub'dan (Mühendislik Koleji, Temple Üniversitesi) Tony Boehm'e 3D baskı konusunda yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca finansman kaynaklarımıza da teşekkür ediyoruz: Amerikan Kanser Derneği Araştırma Bursiyeri Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Genç Araştırmacı Ödülü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, R00 CA172360 ve R01 CA230777, hepsi BG'ye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
