Summary
Presentert her er en protokoll for fabrikasjon av en sfæroid bildeenhet. Denne enheten muliggjør dynamisk eller langsgående fluorescensavbildning av kreftcellesfæroider. Protokollen tilbyr også en enkel bildebehandlingsprosedyre for analyse av kreftcelleinvasjon.
Abstract
Invasjonen av kreftceller fra den primære svulsten inn i det tilstøtende sunne vevet er et tidlig skritt i metastase. Invasive kreftceller utgjør en stor klinisk utfordring fordi det ikke finnes noen effektiv metode for eliminering når spredningen er i gang. En bedre forståelse av mekanismene som regulerer kreftcelleinvasjon kan føre til utvikling av nye potente terapier. På grunn av deres fysiologiske likhet med svulster, sfæroider innebygd i kollagen har jeg blitt mye brukt av forskere for å studere mekanismene som styrer kreftcelleinvasjon i den ekstracellulære matrisen (ECM). Denne analysen er imidlertid begrenset av (1) mangel på kontroll over innebygging av sfæroider i ECM; (2) høye kostnader for kollagen I og glass bunnretter, (3) upålitelig immunofluorescent merking, på grunn av ineffektiv penetrasjon av antistoffer og fluorescerende fargestoffer og (4) tidkrevende bildebehandling og kvantifisering av dataene. For å løse disse utfordringene optimaliserte vi den tredimensjonale (3D) sfæroidprotokollen til bilde fluorescerende merkede kreftceller innebygd i kollagen I, enten ved hjelp av time-lapse videoer eller langsgående bildebehandling, og analysere kreftcelleinvasjon. Først beskriver vi fabrikasjonen av en sfæroid bildeenhet (SID) for å bygge inn sfæroider pålitelig og i et minimalt kollagen I-volum, noe som reduserer analysekostnaden. Deretter avgrenser vi trinnene for robust fluorescensmerking av levende og faste sfæroider. Til slutt tilbyr vi en brukervennlig Fiji-makro for bildebehandling og datakvantifisering. Til sammen gir denne enkle metodikken en pålitelig og rimelig plattform for å overvåke kreftcelleinvasjon i kollagen I. Videre kan denne protokollen enkelt endres for å passe brukernes behov.
Introduction
Under kreftprogresjon kan kreftceller skaffe seg en motil og invasiv fenotype, slik at de kan unnslippe tumormassen og invadere inn i det omkringliggendevevet 1. Til slutt kan disse invasive kreftcellene nå og vokse inne i sekundære organer, en prosess som kalles kreftmetastase1. Metastase forårsaker mer enn 90% av kreftrelaterte dødsfall2. En grunn til dette er at mens lokaliserte svulster er klinisk håndterbare, finnes det ingen effektive metoder for eliminering av invasive kreftceller når metastatisk spredning har oppstått. Derfor utgjør fremveksten av invasive kreftceller og overgangen fra en lokalisert til en invasiv sykdom en stor klinisk utfordring. Å bestemme hvordan kreftceller initierer og opprettholder en invasiv atferd kan føre til utvikling av nye potente terapier.
3D-sfæroidmodellen er en ideell plattform for å undersøke motile oppførsel av kreftceller under kontrollerte, men fysiologisk relevante forhold3. Faktisk, i denne analysen, er sfæroider av kreftceller innebygd i ekstracellulær matrise (ECM), for eksempel kollagen I, som etterligner en forenklet svulst. Deretter brukes avbildning til å visualisere invasjonen av kreftceller fra sfæroiden til kollagenmatrisen. Flere utfordringer begrenser imidlertid denne prosedyren.
Den første utfordringen oppstår ved innebyggingstrinnet, hvor den flytende kollagenmatrisen kan spre seg over paraboloverflaten, noe som får sfæroiden til å berøre bunnen av parabolen. Følgelig spredte celler fra sfæroid på den todimensjonale (2D) overflaten, og brøt den tredimensjonale (3D) sfæroidmorfologien. Å øke volumet av kollagen er en effektiv, men kostbar løsning. For å hindre at celler sprer seg på 2D-overflaten, samtidig som vi opprettholder et minimalt volum kollagen, utviklet vi en spheroid bildeenhet (SID) ved å avgrense en 1 mm tykk, 3-hulls polydimetylsiloxane (PDMS) innsats på en glassbunnsrett.
Den andre utfordringen med sfæroidanalysen er merking av kreftceller i sfæroider, som er begrenset av dårlig penetrasjon av antistoffer og fluorescerende fargestoffer, en effekt som øker med sfæroidstørrelse. Mens den ideelle løsningen for merking av celler er etableringen av cellelinjer stabilt uttrykker fluorescerende protein(er), er dette alternativet for det meste begrenset til udødeliggjorte cellelinjer og er begrenset av tilgjengeligheten av fluorescerende protein chimeras. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for immunofluorescence farging av faste sfæroider, samt effektiv bruk av et cytoplasmatisk fargestoff for å merke celler umiddelbart før du bygger inn sfæroid.
Den tredje utfordringen med spheroid analysen er mangelen på enkle Fiji-makroer for halvautomatisk kvantifisering av celleinvasjon over tid. For å løse denne utfordringen beskriver vi en enkel metodikk for å analysere spheroidområdet over tid. Vi illustrerer fordelene med denne protokollen ved hjelp av 4T1- og 67NR-cellelinjene som eksempler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av en Spheroid Imaging Device (SID) for å optimalisere sfæroid innebygging (Varighet 1 dag)
- Opprett avstandsbryteren ved hjelp av en 3D-skriver (figur 1A, B og tilleggsfil 1).
- Vei ut et 10:1 (wt/wt) forhold mellom basepolymer:crosslinker i en plastkopp [f.eks. 20 g etylbenzenbasepolymer og 2 g silikonharpikskrysslinker for å lage polydimetylsiloxane (PDMS)].
- Bland PDMS-løsningen grundig i plastkoppen ved hjelp av en engangspipette.
- Legg plastkoppen i et vakuumkammer for å fjerne luftboblene fra blandingen. Slipp raskt vakuumtrykket for å fjerne den lille mengden luft som er fanget på overflaten av blandingen og spre de gjenværende luftboblene.
- Inkuber 3D-trykks avstandss avstandsspissen ved 100 °C i 5 min for å øke fleksibiliteten.
- Rengjør de to glassplatene som skal brukes til å konstruere PDMS-formen grundig ved å tørke dem med 100% isopropanol. Hvis glassplatene tidligere ble brukt til å kaste PDMS, må du sørge for å fjerne eventuelle gjenværende gamle PDMS ved å forsiktig skrape glassplatene med et barberblad og tørke dem med 100% isopropanol.
- Konstruer formen ved å plassere 3D-trykt avstandsspylingen mellom de to rene glassplatene.
- Forsegle formen ved hjelp av store bindemiddelklemmer på ytterkantene av glassplatene. Plasser to binderklemmer nederst i kanten og ett øverst i hjørnet.
- Inspiser den øverste delen av formen for å sikre at avstandsspylet er i flukt med glassplatene. Dette garanterer at ingen deformasjoner vil være til stede, og at et jevnt ark med PDMS vil bli opprettet.
MERK: Hvis det resulterende arket ikke er av jevn tykkelse, må klipsene justeres litt. - Klipp spissen av en engangspipette (~ 2 cm fra spissen) og legg til PDMS-blandingen med en langsom og konstant hastighet til øverste venstre hjørne av formen. Hell blandingen sakte for å hindre etablering av store luftlommer.
- Legg formen i et vakuumkammer for å fjerne luftbobler som dannes under hellet.
- Herd PDMS ved å inkubere formen ved 100 °C i 1 time.
- Hent formen fra inkubatoren og la den avkjøles for å berøre.
- Fjern binderklemmene og glassplatene fra avstandssdren som inneholder de herdede PDMSene.
- Bruk et barberblad til å skjære gjennom forseglingen som ble opprettet på alle fire sidene av formen mellom avstandsselen og glassplaten. Med alle fire sider skåret inn, begynn å trekke fra hverandre formen for å avsløre PDMS-arket i avstandssrommet.
- Fjern forsiktig det nye PDMS-arket av avstandssnren ved hjelp av pinsett.
- På en skjærematte, punch ut 17,5 mm diameter PDMS-disker fra arket, og deretter slå tre jevnt fordelte 5,5 mm diameter hull, ved hjelp av forskjellige størrelse biopsi slag. Her kalles disse 3-hulls PDMS-diskene "inserts" (figur 1C).
MERK: Ikke-uniformkutt gjort i PDMS, eller en defekt binding via plasmabehandling, kan føre til fremtidige lekkasjer. - Rengjør hver innsats ved å forsiktig fjerne støvpartikler ved hjelp av tape.
- Fest innsatsene på et stykke dobbeltsidig tape og vikle båndet rundt lokket på en 10 cm petriskål.
- Legg lokket på petriskålen i plasmamaskinen, sammen med de åpne 35 mm glassbunnsrettene.
- Aktiver overflaten av innsatsene og glasset via plasmabehandling i 1 min ved 300 mTorr. En håndholdt plasmastav kan brukes.
- Bruk pinsett, fest oppsiden raskt, det vil si behandlet side, av en innsats (figur 1D) til glassdelen av en glassbunnsfat (figur 1E). Gjenta for alle retter.
- Bruk pekefingeren og tommelen til å påføre et jevnt trykk mens du roterer glassbunnsfatet. Dette vil sikre stabil festing av innsatsen til glassbunnsfatet.
- Inkuber sidene (figur 1F) ved 60 °C i 20 min for å styrke vedheftet mellom glass og PDMS.
- Utfør en ny runde plasmabehandling på sidene, ved hjelp av de samme innstillingene som i trinn 1.21 eller med den håndholdte tryllestaven. Dette vil gjøre at den frie PDMS-overflaten fester seg til poly-L-lysinen i beleggoppløsningen (se 1.26).
- Klargjør følgende løsninger på nytt.
- Beleggoppløsning: 1x PBS som inneholder 0,01 % (vol/vol) poly-L-lysin [f.eks. tilsett 10 μL på 0,1 % (vol/vol) poly-L-Lysin til 90 μL μL på 1x PBS].
- Krysskoblingsløsning: Destillert vann som inneholder 1x (vol/vol) glutaraldehyd [f.eks. tilsett 10 μL 10x glutaraldehyd til 90 μL destillert vann].
- Oppbevaringsoppløsning: 1x PBS som inneholder 10x (vol/vol) Penicillin-Streptomycin [f.eks. tilsett 1 ml 100x Penicillin-Streptomycin til 9 ml 1x PBS].
- Tilsett 35 μL beleggoppløsning per hvert hull og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Aspirer poly-L-Lysin og skyll hele SID 3 ganger med destillert vann.
- Tilsett 35 μL krysskoblingsløsning per hvert hull inkuber i 30 min ved romtemperatur.
- Aspirer krysskoblingsløsningen og skyll hele SID 3 ganger med destillert vann.
- Tilsett 70% etanol i hver SID og plasser under ultrafiolett (UV) lys i 30 min.
- Under panseret aspirerer etanol og skyll SID 3 ganger med destillert vann.
- Tilsett 2,5 ml lagringsløsning per hver SID.
MERK: På dette stadiet kan SIDene oppbevares ved 4 °C i en uke. Det ble observert at bindingsstyrken mellom PDMS og glass reduseres over tid. Utover en uke anbefales brukere å teste SIDer for potensiell lekkasje før bruk. For å gjøre dette, aspirere lagringsløsningen og tilsett 35 μL 1x PBS i hvert hull. Etter bruk kan PDMS-innsatser skrelles av glassbunnsrettene. For å oppnå optimal rengjøring av glassbunnsretter, bør flere vasker med isopropanol og saltsyre brukes til å fjerne PDMS-rester.
2. Sfæroid dannelse og innebygging i kollagen (Varighet 4 dager)
MERK: For levende avbildning av sfæroider, langsgående eller i tidsforløpsvideoer, bruk en cellelinje som uttrykker et cytoplasmatisk og/eller kjernefysisk fluorescerende protein. Hvis en slik cellelinje er tilgjengelig, følger du trinnene som er beskrevet i denne delen. Alternativt, i seksjon 3, foreslås en protokoll for å merke kreftceller i sfæroider ved hjelp av et cytoplasmatisk fargestoff.
- Form sfæroider av 4T1 og / eller 67NR celler ved hjelp av hengende dråpe teknikk, som tidligere beskrevet4,5,6,7, med 3000 celler / 40 μL dråpe og en 3-dagers inkubasjonstid. Tilsett storfe atelocollagen Jeg løsning siste og opprettholde alle løsninger på is, til enhver tid.
- Identifiser de riktig dannede sfæroidene ved hjelp av et bright-field mikroskop.
- Fyll et konisk rør på 15 ml med 8 ml ferdigoppvarmet komplett medium.
- Samle sfæroider med en P1000 pipette og overfør til 15 ml konisk rør. Våt pipettespissen ved å pipe et komplett medium inn og ut for å hindre at sfæroider stikker til innsiden av pipettespissen og begrenser sfæroidtap.
- La sfæroider synke til bunnen av røret og vask forsiktig spheroidene ved å utveksle mediet. Gjenta to ganger.
- Forbered en 5 mg /ml kollagen I-løsning i henhold til produsentens anbefalinger (alternativ gelasjonsprosedyre, se eksemplarisk beregning nedenfor). Skift ut det destillerte vannet med komplett medium. Ved beregning av volumet av medium som skal brukes, ta hensyn til at sfæroider vil bli lagt til i 20 μL av komplett medium [f.eks, for en SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL 5 mg/ml kollagen jeg er nødvendig (klargjør 20 % ekstra for å ta høyde for pipetteringstap ved håndtering av viskøse væsker); 22 μL av komplett medium + 10,8 μL av 10x PBS + 1,2 μL på 1 M NaOH + 54 μL på 10 mg / ml kollagen jeg lager].
- Samle alle sfæroider i 20 μL medium, ved hjelp av en P200 pipette, og legg dem til kollagen I-løsningen tilberedt i trinn 2.6.
- Bland langsomt løsningen ved å pipetter opp og ned for å unngå heterogenitet i kollagen I konsentrasjon, begrense bobledannelse. Hold løsningen på is.
- Fjern oppbevaringsløsningen fra SID(er) og vask 3 ganger med 3 ml 1x PBS. Etter den endelige vasken, la SID(e) være tørr for ikke å fortynne kollagen I-løsningen.
- Start en timer og dispenser 30 μL av kollagen I-løsningen som inneholder en sfæroid i ett av de tre hullene i SID. Visuelt sikre at en enkelt sfæroid finnes i 30 μL.
- Gjenta trinn 2,10 to ganger til for å fylle alle de 3 hullene i en SID.
- Bruk en pipettespiss på 10 μL til å sentrere sfæroidet på nytt hvis den er plassert nær PDMS-grensen. Hvis to eller tre sfæroider ender opp dispensert i ett av hullene, kan samme pipettespiss brukes til å skille sfæroidene fra hverandre. Stopp tidtakeren.
MERK: Ofte invertering av SID opp-ned og opp-opp, gjennom hele kollagenet I polymerisering og størkning, sikrer at sfæroid er plassert i det vertikale sentrum av ECM-laget, og forhindrer invasjon av celler i 2D. Hyppigheten av invertering (flipping) bør maksimeres. Siden vendefrekvensen styres av spheroid "dispenseringstid" målt i 2,10-2,12, bør dispenseringstiden minimeres. I vårt laboratorium er dispenseringstiden 2 min i gjennomsnitt. - For å sentrere sfæroiden vertikalt i kollagenlaget, snu SID opp ned og inkuber ved 37 °C for dispenseringstid.
- Snu SID opp-opp og inkuber ved 37 °C for dispenseringstid.
MERK: Hvor lenge sfæroidene tilbringer i opp-ned-retningen, bør være lik tiden som brukes i opp-opp-orienteringen. - Gjenta trinn 2,13 og 2,14 i 30 min, til kollagen jeg polymeriserer.
- Legg til 2,5 ml komplett medium / SID, og om nødvendig, få et bilde av sfæroidene for det første tidspunktet.
- Gjenta trinn 2.10-2.16 hvis flere SIDer brukes.
3. Fluorescens merking av sfæroider
- Live imaging (Varighet 6-7 dager)
MERK: Hvis en cellelinje som uttrykker et cytoplasmatisk og/eller kjernefysisk fluorescerende protein er tilgjengelig, følger du trinnene som er beskrevet i avsnitt 2. Alternativt, for cytoplasmatisk merking, foreslås følgende protokoll.- Følg trinn 2.1-2.5 i protokollen som er beskrevet i avsnitt 2.
- Fortynn det cytoplasmatiske fargestoffet til 25 μM i 200 μL serumfritt medium.
MERK: Mens et rødt cytoplasmatisk fargestoff brukes i dette eksperimentet, bør enhver annen tilgjengelig farge være egnet. Kreftceller ble merket inne i sfæroider ved hjelp av kjernefysiske fargestoffer fortynnet til 20 μM i 200 μL serumfritt medium (se Materialtabell). - Etter den endelige vasken, resuspend spheroids i cytoplasmatisk eller kjernefysisk fargestoff løsning og inkubere ved romtemperatur i 20 min, beskyttet mot lys.
MERK: Med denne tilnærmingen vil merking av cellene i spheroid-senteret ikke være effektiv. For å oppnå merking av alle celler, kan inkubasjon utvides over natten, ved å plassere parabolen på en rocker. Alternativer er beskrevet i Diskusjon. - Vask sfæroider 3 ganger i komplett medium.
- Fortsett til trinn 2.6-2.17 i protokollen som er beskrevet i avsnitt 2.
- Bildesfæroider via bildebehandling hver 10. Bruk et konfokalt laserskanningsmikroskop, 10x luftmål (0,4 numerisk blenderåpning og 3,1 mm arbeidsavstand), 1024 x 1024 piksler, eksponeringstid 8 μs/piksel, pinhole 90 μm, 6 x 15 μm z-trinn og 3 felt av visning hver inneholder en sfæroid.
MERK: For tidsforløp, bruk minimal laserkraft og utstyr mikroskopet med et miljøkammer med temperatur, fuktighet og gasskontroll. Kultur de innebygde sfæroider ved 37 °C i > 8 timer eller over natten før bildebehandling for å minimere tiden på mikroskopet.
- Immunofluorescence farging av sfæroider (Varighet 2 dager)
MERK: Fremgangsmåten som er beskrevet her, er tilpasset og optimalisert fra tidligere publiserte protokoller8,9. Denne metoden kan brukes etter protokollen som er beskrevet i avsnittene 2 og 3.1.- Klargjør følgende løsninger på nytt.
- Festeløsning: 1x PBS som inneholder 4 % PFA (vol/vol) [f.eks. tilsett 5 ml 16 % (vol/vol) PFA til 15 ml 1x PBS].
- Fikse og permeabiliserende løsning: 1x PBS som inneholder 4% PFA (vol/ vol) og 0,5% Triton X-100 (vol / vol) [f.eks. tilsett 50 μL Triton X-100 til 10 ml festeløsning].
- Blokkeringsløsning: 1x PBS som inneholder 1 % FBS (vol/vol) og 1 % BSA (wt/vol) [f.eks. oppløs 100 mg BSA i 10 ml 1x PBS, og tilsett deretter 100 μL FBS].
- Vaskeoppløsning: 1x PBS som inneholder 0,05 % Tween 20 (vol/vol) [f.eks. tilsett 25 μL Tween 20 til 50 ml 1x PBS].
- Fjern kulturmediet fra SID(er) og vask én gang med varm 1x PBS.
- Tilsett 2 ml feste- og permeabiliserende løsning per SID og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Fjern feste- og permeabiliserende oppløsningen og tilsett 2 ml festeløsning per SID og inkuber ved romtemperatur i 20 min.
- Vask 3 ganger med vaskeoppløsningen.
- Tilsett 2 ml blokkeringsløsning per SID og inkuber ved 4 °C i 24 timer med mild risting.
MERK: På dette trinnet kan prøvene inkuberes ved 4 °C i løpet av helgen. Vær oppmerksom på at en lengre blokkeringstid kan forstyrre immunofluorescence merking prosedyren. - Fortynn primære antistoffer i blokkeringsløsning.
- Tilsett 150 μL blokkerende oppløsning med primære antistoffer/brønn i en 48-brønns plate.
- Bruk fine pinsett, koble forsiktig pluggen av kollagen jeg inneholder en sfæroid og overføre til en brønn. Gjenta hvis flere sfæroider er merket. Tørk av væske som kan forbli på pinsettene når du arbeider med forskjellige antistoffer, for å forhindre forurensning.
- Inkuber over natten ved 4 °C med mild risting.
- Tilsett 300 μL vaskeløsning til tomme og fulle brønner.
- Overfør forsiktig pluggen av kollagen jeg inneholder en sfæroid til en "vask" godt.
- Vask 3 ganger med vaskeløsning i 2 timer, ved romtemperatur og med mild risting.
MERK: Overføring av pluggene av kollagen Jeg inneholder en sfæroid, i stedet for å aspirere løsningene, kan bidra til å redusere prøvetap og prøveskade. - Fortynn sekundære antistoffer, 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og/eller falloidin i blokkeringsløsning.
- Tilsett 150 μL blokkeringsløsning med sekundære antistoffer, DAPI og/eller falloidin per brønn.
- Ved hjelp av pinsett, overfør forsiktig kollagenpluggen som inneholder sfæroidene inn i brønnen. Gjenta hvis flere sfæroider er merket.
- Inkuber ved romtemperatur i 1 time med mild risting.
- Gjenta trinn 3.2.11 og 3.2.12.
- Vask 3 ganger med vaskeløsning i 30 min, ved romtemperatur med mild risting.
- Bruk et barberblad til å kutte en 3-hulls PDMS-innsats i tre deler slik at hver del inneholder et hull.
- Plasser to stykker PDMS på et mikroskoplysbilde.
- Legg til en dråpe monteringsløsning ved hjelp av en P200-tupp med enden avskåret. Forhindre bobledannelse.
- Overfør forsiktig et kollagen jeg plugger inn i hvert hull.
MERK: Hvis sfæroiden ble plassert på toppen av kollagenpluggen, snu kollagenpluggen slik at sfæroiden ender opp nærmere glassdeksleppet. - Sett en dekkslips på toppen og forsegle med tape.
- La prøven tørke ved romtemperatur i 10 min, beskyttet mot lys.
- Oppbevar prøvene ved 4 °C, beskyttet mot lys til bildebehandling.
- Klargjør følgende løsninger på nytt.
4. Bildebehandling for å analysere kreftinvasjon over tid
MERK: Formatet som kreves for denne makroen er en enkeltkanals x, y, t bilde lagret som en .tiff fil.
- Hvis flere z-skiver ble anskaffet(det vil si x, y, z, t-bilde), åpner du bildet på Fiji og velger Bilde | Stabler | Z Prosjekt. Det anbefales å bruke alternativet Maks intensitet. Alternativt kan en enkelt z-skive brukes til å kjøre makroen. Lagre bildet som en .tiff fil.
- Opprett en egen "Processing" -mappe på skrivebordet.
- Velg Fil | Lagre som | Bildesekvens. Bruk TIFF-formatet, oppdater sifrenummeret i henhold til antall rammer, merk av i boksen for å bruke stykkeetikett som filnavn og velg Ok. Velg mappen "Behandling" opprettet i trinn 2.
- Åpne ett bilde fra "Behandling" -mappen. Det bør være et x,y-bilde, som tilsvarer et enkelt tidspunkt.
- Velg | Juster | Automatisk terskel. Velg metoden Prøv alle i rullegardinmenyen og merk av i boksen for hvite objekter på svart bakgrunn.
- Det vises et montasjebilde som viser resultatet for hver automatiserte terskelmetode.
- Identifiser den beste automatiserte terskelmetoden, for eksempel RenyIEntropy.
- Hvis du vil bekrefte valget for den automatiske terskelmetoden, åpner du et annet bilde fra «Behandling»-mappen og tester den valgte terskelmetoden ved hjelp av | Juster | Automatisk terskel.
- Lukk alle bilder.
- Last ned makroen SpheroidAreaTime (tilleggsfil 2).
- Åpne Fiji-makroen ved å dra og slippe.
- I linje 58 oppdaterer du den automatiserte terskelmetoden etter behov.
- I linje 62 oppdaterer du størrelsesområdet i henhold til celledimensjonene.
- Velg Kjør.
- Velg mappen "Behandling" og skriv inn "Behandling" som overordnet mappe, og velg deretter Ok.
- Når løpet er over, lagrer du tabellen "Sammendrag". Den første kolonnen angir navnet på bildet; den tredje kolonnen indikerer spheroid området; Den sjette, syvende og åtte kolonnene angir parametrene for en ellipse montert på sfæroidet.
- "Behandling"-mappen inneholder nå et bearbeidet bilde for hvert tidspunkt, med utvidelsen _SpheroidArea.
MERK: Hvis spheroid-senteret er svakt, fyller du det med hvitt ved hjelp av markeringsverktøyene for alle tidspunkter, og deretter går du videre til trinn 3. På samme måte kan plassen rundt spheroid fylles med svart for å "rense" bildet. Hvis bildet er rent, kommenterer du linjen 61 for å øke hastigheten på løpet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grunn av sin biokompatibilitet er PDMS mye brukt til mikrofabrikasjon av begrensende brønner, frimerker og former, som revolusjonerte mikrobryttering og mikrofluidiske enheter. I metoden som er beskrevet her, brukes den til å lage SIDer, tilpassbare brønner som optimaliserer sfæroid innebygging og bildebehandlingsprosedyre. Figur 1 illustrerer de viktigste komponentene som brukes i fabrikasjonen av SIDer. For å kaste PDMS-formen er en 1 mm tykk avstandss avstandssmør 3D-trykt (figur 1A,B), plassert mellom de to glassplatene, forseglet med store klips. Helle og bake PDMS i mellomrommet mellom platene danner en 1 mm tykk ark med PDMS. SID skjematisk (Figur 1C) indikerer dimensjonene på den optimale enheten, men liten variasjon oppstår i hullet avstander, på grunn av manuell punching av hull ved hjelp av biopsi slag (Figur 1D). Figur 1D,F indikerer rene sirkulære kutt med jevnt avstandshull i PDMS-innsatsen.
Ved hjelp av SIDer forenkler effektiv innebygging, og dermed opptak av invasjonen av kreftceller inne kollagen jeg bruker time-lapse (Figur 2, Video 1) eller langsgående (Figur 3) avbildning. Til tross for å bruke de samme inversjonsfrekvensene for alle SIDer under kollagen I polymerisering, vil sfæroide posisjoner inne i kollagenpluggen variere litt. Derfor er det viktig å bruke et mål med lang arbeidsavstand (> 1 mm). Ellers kan fokusering og bildebehandling være vanskelig for sfæroider plassert nær toppen av kollagenpluggen. I motsetning vil spheroider plassert nær bunnen av kollagenpluggen, ha celler som beveger seg til glassoverflaten og migrerer på glasset, i stedet for å invadere inn i kollagen I matrise. Videoer av slike sfæroider må kastes. Tykkelsen på kollagenpluggen, her ca. 800 μm, styres av volumet som dispenseres i hvert hull på SID og justeres til invasjonsavstander sfæroider viser i denne protokollen. Tykkelsen på kollagenpluggen kan senkes ved å dispensere et lavere volum kollagen I i hvert hull på SID, når du bruker mindre eller mindre invasive sfæroider.
For riktig analyse av invasjonen ved hjelp av Fiji-makroen, er det avgjørende for kreftceller å bli riktig merket i løpet av bildeøkten. Som nevnt i trinn 4.17., gjør bildebehandlingstrinnet mulighet for bildekorrigering hvis merkingen er sub-optimal. Mens vi illustrerer langsgående bildebehandling i løpet av 6 dager (figur 3), som krever stabilt uttrykk for cytoplasmatisk og / eller kjernefysisk fluorescerende protein, kan lignende langsgående bildebehandling utføres over kortere tid ved hjelp av merking med fargestoffer.
Etter levende bildebehandling presenterer vi noen resultater fra immunolabelingsprosedyren for epitelkadherin (E-kadherin), kortactin og F-actin (figur 4). I disse eksemplene brukte vi cellelinjene 4T1 og 67NR. Figur 5 viser trinnvis illustrasjon av bildebehandlingsprosedyren ved hjelp av Fiji-makroen til å måle området av sfæroiden over tid.
Figur 1: Fabrikasjon av SIDer. (A) Toppvisning skjematisk representasjon av avstandsbryteren. (B) 3D trykt avstandss avstandss avstandssm. (C) Skjematisk visning av SID-en. En 3-hulls PDMS-innsatser (D) er bundet til en glassbunnsfat (E), og skaper den endelige SID (F). Dimensjonene er i millimeter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Levende avbildning av sfæroider. Representant 20 t og 40 t timepoints fra Video 1, maksimal projeksjon av en 4T1 sfæroid. 4T1-celler ble merket ved hjelp av et cytoplasmatisk fargestoff. Skala bar, 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Langsgående avbildning av sfæroider. Representative mikrografer (maksimal projeksjon) av en blandet 4T1/67NR sfæroid avbildet daglig. 4T1- og 67NR-celler uttrykker stabilt henholdsvis cytoplasmatisk mScarlet og grønt fluorescerende protein (GFP). Skala bar, 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunofluorescence avbildning av sfæroider. Representative mikrografer (maksimal projeksjon) av en 4T1 sfæroid fast 2 dager etter innebygging i kollagen I. E-kadherin (cyan, A), kortactin (gul, B) og F-actin (magenta, A og B) ble merket. Skala bar, 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av bildebehandling. Trinnvis illustrasjon av bildebehandlingsprosedyren ved hjelp av Fiji-makroen (A) for å måle området av sfæroiden over tid (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Representativ video av en 4T1 sfæroid avbildet hver 10 min i 46 timer og 10 min. 4T1 celler ble merket ved hjelp av et cytoplasmatisk fargestoff. Skala bar, 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsfil 1: 3D-modell av avstandsbryteren (STL-fil). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: SpheroidAreaTime-makro. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-utskrevne avstandssnitt ble designet for å lage 1 mm tykke ark med PDMS som deretter enkelt kan brukes til å lage ulike former for PDMS, som kreves av eksperimentelle applikasjoner. På grunn av enkelheten i fabrikasjonen og friheten til å endre designen, ble denne metoden for PDMS-støping valgt for den første utformingen av SID. Hvis det kreves høyt volum av SIDer, kan produksjonen gjøres mer effektiv ved å opprette en 3D-trykt form, som allerede inneholder PDMS-disker med tre like avstandshull, og redusere prosessen til ett trinn. Dette ville eliminere behovet for å slå ut hver disk, sammen med de påfølgende tre hullene, og redusere den totale tilberedningstiden.
Mens 3-hulls punch er utviklet for bruk med 35 mm glass bunnretter, andre størrelser er tilgjengelig som tillater flere hull og dermed flere sfæroider som skal avbildes parallelt. I tillegg er tilpasset dekselglass også kommersielt tilgjengelig, som i kombinasjon med 3D-trykte holdere kan tillate sfæroide analyser med høy gjennomstrømning. Med en slik tilnærming er begrensende faktor hastigheten på datainnsamling- for eksempel i vår flerfargede time-lapse confocal imaging, anskaffe 3D-stabel av en enkelt sfæroid krever ca 2,5 minutter. Derfor krever anskaffelse av 3D-stabler for 3 sfæroider i SID ca. 8 minutter. Som et resultat, for å opprettholde vår foretrukne bildefrekvens på 10 minutter per stabel, kan vi ikke øke antall hull i SIDs.
For å registrere og kvantifisere invasjonen av levende kreftceller i 3D-sfæroidmodellen, kan lysfeltsavbildning brukes5. Fluorescensmikroskopi foretrekkes imidlertid, da den gir økt kontrast, og letthet og presisjon i bildebehandlingen. Hvis genereringen av en cellelinje som uttrykker et cytoplasmatisk og / eller kjernefysisk fluorescerende protein ikke er mulig, foreslår vi bruk av cytoplasmatiske fargestoffer. Siden oppbevaringstiden for cytoplasmatiske fargestoffer inne i cellene er tre dager under våre bildeforhold, bør cellene merkes etter 3-dagers perioden i hengende dråpe, og umiddelbart før innebyggingen. Merking av celler etter innebygging kan ikke spesifikt merke kollagen, og redusere cellemerking. Avbildning i mer enn 3 dager etter innebygging krever bruk av en annen sfæroid seedingprotokoll 10 eller cellelinjer stabilt uttrykker fluorescerende protein(er).
Vi klarte å danne og avbildet sfæroider som inneholder alt fra 60 til 5000 celler / slipp. Små sfæroider er ideelle for opptak invasjon over flere dager, som hele invasjonsområdet kan lett passe inn i et enkelt synsfelt av høyere forstørrelse (20x-30x) mål. I tillegg kan de lett merkes gjennom med cytoplasmatiske eller kjernefysiske fargestoffer. Til slutt, på grunn av redusert spredning, kan hver celle i sfæroid visualiseres og segmenteres. Imidlertid er små sfæroider knapt synlige med nakne øyne og kan kreve ekstra merking med vevsmarkører. I motsetning er større sfæroider lettere å håndtere, men mer utsatt for å synke til bunnen av parabolen, på grunn av vekten. Videre er celler i spheroid-senteret ikke alltid merket når de bruker fargestoffer, eller synlig ved hjelp av konfokal mikroskopi, som har penetrasjonsdybde på ca. 100 mikrometer. For å visualisere alle kreftceller gjennom de store sfæroidene ved hjelp av tidsforløpsbilder, kan multiphoton mikroskopi brukes, noe som gir en ekstra fordel med kollagenfibre visualisering ved andre harmoniske generasjon (SHG) uten behov for merking. Bildebehandling kan også gjøres med lysarkmikroskopi8,11,12,noe som gir redusert bildeanskaffelsestid og dermed tillater sfæroide analyser med høy gjennomstrømning, men krever også mer datalagring og avansert bildebehandling. Hvis det ikke er nødvendig med tidsforløpsvideoer, kan vår merkingsprosedyre for faste 3D-sfæroider kombineres ytterligere med optisk clearing8,10. I tillegg kan kryoseksjon av de innebygde sfæroidene eliminere problemer med penetrasjon av fargestoff eller antistoff under merking, samt penetrasjon av lys under avbildning. I våre hender var imidlertid vellykket kryoseksjon begrenset til tidlige stadier av invasjon og ikke-invasive celler, på grunn av de tekniske utfordringene med bevaring av lange og skjøre invasive tråder.
Vår protokoll er også kompatibel med bruk av kjernefysiske fargestoffer, for å merke kreftceller inne i sfæroidene, slik at enkeltcellesporing av tidsforløpsdata. Fiji plugin TrackMate13 kan brukes til å automatisere cellesporing og trekke ut motilitetsparametere for enkeltceller, for eksempel hastighet, øyeblikkelig hastighet og utholdenhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmer av Temple Bioengineering for verdifulle diskusjoner. Vi takker David Ambrose ved flytcytometrikjernen (Lewis Katz School of Medicine) for hans hjelp med cellesortering og Tony Boehm fra IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) for hjelp med 3D-utskriften. Vi takker også våre finansieringsressurser: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 og R01 CA230777, alt til BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
