Summary
Здесь представлен протокол по изготовлению сфероидного устройства визуализации. Это устройство позволяет динамические или продольные флуоресценции изображения сфероидов раковых клеток. Протокол также предлагает простую процедуру обработки изображений для анализа вторжения раковых клеток.
Abstract
Вторжение раковых клеток из первичной опухоли в соседние здоровые ткани является ранним шагом в метастазах. Инвазивные раковые клетки представляют собой серьезную клиническую проблему, поскольку после их распространения не существует эффективного метода их ликвидации. Лучшее понимание механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток может привести к разработке новых мощных методов лечения. Из-за их физиологического сходства с опухолями, сфероиды, встроенные в коллаген, я был широко использован исследователями для изучения механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток во внеклеточную матрицу (ECM). Однако этот анализ ограничен (1) отсутствием контроля над встраиванием сфероидов в ЭКМ; (2) высокая стоимость коллагена I и стеклянных нижних блюд, (3) ненадежная иммунофлуоресцентная маркировка, из-за неэффективного проникновения антител и флуоресцентных красителей и (4) трудоемкой обработки изображений и количественной оценки данных. Для решения этих проблем мы оптимизировали трехмерный (3D) сфероидный протокол для изображения флуоресцентно помеченных раковых клеток, встроенных в коллаген I, либо используя покадровые видео или продольную визуализацию, и анализируем вторжение раковых клеток. Во-первых, мы описываем изготовление сфероидного устройства визуализации (SID) для надежного встраивания сфероидов в минимальный объем коллагена I, снижая стоимость анализа. Далее мы разграничим шаги для надежной маркировки флуоресценции живых и фиксированных сфероидов. Наконец, мы предлагаем простой в использовании макрос Фиджи для обработки изображений и количественной оценки данных. В целом, эта простая методология обеспечивает надежную и доступную платформу для мониторинга вторжения раковых клеток в коллаген I. Кроме того, этот протокол можно легко модифицировать в соответствии с потребностями пользователей.
Introduction
Во время прогрессирования рака, раковые клетки могут приобрести пестрый и инвазивный фенотип, что позволяет им избежать опухолевой массы и вторгнуться в окружающиеткани 1. В конце концов, эти инвазивные раковые клетки могут достичь и расти внутри вторичных органов, процесс, называемый метастазированиерака 1. Метастазы вызывает более 90% смертей, связанных с раком2. Одна из причин этого заключается в том, что, хотя локализованные опухоли клинически управляемы, эффективных методов для ликвидации инвазивных раковых клеток после метастатического распространения не существует. Таким образом, появление инвазивных раковых клеток и переход от локализованных к инвазивным заболеваниям создает серьезную клиническую проблему. Определение того, как раковые клетки инициировать и поддерживать инвазивное поведение может привести к разработке новых мощных методов лечения.
3D-модель сфероидов является идеальной платформой для исследования подвижного поведения раковых клеток под контролем, но физиологически релевантных условий3. Действительно, в этом анализе, сфероиды раковых клеток встроены внутри внеклеточной матрицы (ECM), например коллагена I, который имитирует упрощенную опухоль. Затем визуализация используется для визуализации вторжения раковых клеток из сфероида в коллагеновую матрицу. Однако многочисленные проблемы ограничивают эту процедуру.
Первая проблема возникает на этапе встраивания, где жидкий коллаген матрицы может распространяться по поверхности блюда, в результате чего сфероид коснуться нижней части блюда. Следовательно, клетки сфероида распространяются на двумерной (2D) поверхности, нарушая трехмерную (3D) сфероидную морфологию. Увеличение объема коллагена является эффективным, но дорогостоящим решением. Чтобы предотвратить распространение клеток на 2D-поверхности, сохраняя при этом минимальный объем коллагена, мы разработали устройство сфероидной визуализации (SID), охвачив 1 мм толщиной, 3-луночное полидиметилсилоксан (PDMS) вставить на стеклянное дно блюдо.
Второй проблемой сфероидного анализа является маркировка раковых клеток в сфероидах, которая ограничена плохим проникновением антител и флуоресцентных красителей, эффект, который увеличивается с размером сфероида. В то время как идеальным решением для маркировки клеток является создание клеточных линий, стабилизированно выражаюющих флуоресцентный белок (ы), этот вариант в основном ограничивается увековеченными клеточными линиями и ограничен наличием флуоресцентных белковых химер. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для иммунофлуоресценции окрашивания фиксированных сфероидов, а также эффективное использование цитоплазмического красителя для обозначения клеток непосредственно перед встраиванием сфероида.
Третьей проблемой сфероидного анализа является отсутствие простых макросов Фиджи для полуавтоматической количественной оценки вторжения клеток с течением времени. Для решения этой задачи мы описываем простую методологию анализа сфероидной области с течением времени. В качестве примеров мы иллюстр работаем с преимуществами этого протокола, используя линии ячеек 4T1 и 67NR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление устройства для визуализации сфероидов (SID) для оптимизации встраивания сфероидов (длительность 1 день)
- Создайте спейсер с помощью 3D-принтера(рисунок 1A, B и дополнительный файл 1).
- Взвесить соотношение базового полимера 10:1 (wt/wt) в пластиковом стаканчике (например, 20 г базового полимера этилбензена и 2 г кросслинкера силиконовой смолы для создания полидиметилсилоксана (PDMS)».
- Тщательно смешайте раствор PDMS в пластиковом стаканчике с помощью одноразовой пипетки.
- Поместите пластиковый стаканчик в вакуумную камеру, чтобы удалить пузырьки воздуха из смеси. Быстро отпустите вакуумное давление, чтобы удалить небольшое количество воздуха, захваченного на поверхности смеси и рассеять оставшиеся пузырьки воздуха.
- Инкубировать 3D печатный спейсер при 100 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы увеличить его гибкость.
- Очистите две стеклянные пластины, которые будут использоваться для создания формы PDMS тщательно, вытирая их 100% изопропанол. Если стеклянные пластины ранее были использованы для отливки PDMS, не забудьте удалить все оставшиеся старые PDMS, осторожно соскоб стеклянные пластины с лезвием бритвы и вытирая их 100% изопропанола.
- Постройте форму, поместив 3D печатный спейсер флеш между двумя чистыми стеклянными пластинами.
- Печать формы с помощью больших клипов связующего на внешних краях стеклянных пластин. Поместите два связующего клипа на нижний край и один на верхнем углу.
- Осмотрите верхнюю часть формы, чтобы убедиться, что спейсер заподлицо со стеклянными пластинами. Это гарантирует, что деформаций не будет и что будет создан овый лист PDMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если полученный лист не имеет однородной толщины, клипы должны быть слегка отрегулированы. - Вырезать кончик одноразовой пипетки (2 см от кончика) и добавить смесь PDMS на медленной и постоянной скоростью в верхнем левом углу формы. Налейте смесь медленно, чтобы предотвратить создание больших воздушных карманов.
- Поместите форму в вакуумную камеру, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые образовались во время заливки.
- Лечить PDMS путем инкубации плесени при 100 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
- Извлеки плесень из инкубатора и дайте ей остыть на ощупь.
- Удалите зажимы связующего звена и стеклянные пластины с промекающего, содержащего вылеченную PDMS.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы прорезать уплотнение, которое было создано со всех четырех сторон формы между спейсером и стеклянной пластиной. Со всеми четырьмя сторонами нарезать, начать потянув друг от друга плесень, чтобы выявить лист PDMS в spacer.
- Тщательно очистить новый лист PDMS от spacer с помощью пинцета.
- На режущей коврике выбивает из листа диски PDMS диаметром 17,5 мм, а затем пробивает три равномерно распределенных отверстия диаметром 5,5 мм, используя различные размеры биопсии ударов. Здесь эти 3-луноные диски PDMS называются "вставки"(рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Нониформные порезы, сделанные в PDMS, или неисправное связывание с помощью плазменной обработки, могут привести к будущим утечкам. - Очистите каждую вставку, аккуратно удалив частицы пыли с помощью ленты.
- Вставьте вставки на кусок односторонней ленты и оберните ленту вокруг крышки 10-сантиметровой чашки Петри.
- Поместите крышку чашки Петри в плазменную машину вместе с открытыми 35-мм стеклянными нижней посудой.
- Активируйте поверхность вставок и стекла с помощью плазменной обработки в течение 1 мин при 300 мТорр. Ручная плазменная палочка может быть использована.
- Используя пинцет, быстро прикрепите перевернутую, т.е. обработанную сторону,одной вставки (рисунок 1D)к стеклянной части стеклянной нижней тарелки(рисунок 1E). Повторите для всех блюд.
- Используйте указательный палец и большой палец, чтобы применить равномерное давление при повороте стеклянного дна блюдо. Это обеспечит стабильную защиту вставки к стеклянной нижней тарелке.
- Инкубировать СИДС(рисунок 1F) при 60 градусов по Цельсию в течение 20 минут, чтобы укрепить адгезию между стеклом и PDMS.
- Выполните второй раунд плазменной обработки на СИД, используя те же настройки, что и в шаге 1.21 или с ручной палочкой. Это сделает свободную поверхность PDMS придерживаться поли-L-лизина в растворе покрытия (см. 1.26).
- Свежеприготовь следующие решения.
- Решение для покрытия: 1x PBS, содержащий 0,01% (vol/vol) поли-L-лизин (например, добавить 10 л 0,1% (vol/vol) поли-L-лизин до 90 л 1x PBS.
- Перекрестный раствор: Дистиллированная вода, содержащая 1x (vol/vol) глутаралдегид (например, добавить 10 йл 10x глутаралдегида до 90 йл дистиллированной воды).
- Решение для хранения: 1x PBS, содержащий 10x (vol/vol) Пенициллин-Стрептомицин (например, добавить 1 мл 100x пенициллина-стрептомицина до 9 мл 1x PBS).
- Добавьте 35 мкл раствора покрытия на каждое отверстие и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Аспирировать поли-L-лизин и промыть весь СИД 3 раза дистиллированной водой.
- Добавьте 35 МКЛ кросссингового раствора на каждое отверстие, инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Аспирировать перекрестный раствор и промыть весь СИД 3 раза дистиллированной водой.
- Добавить 70% этанола в каждый СИД и поместить под ультрафиолетовый (УФ) свет в течение 30 мин.
- Под капотом, аспирировать этанол и промыть SID 3 раза с дистиллированной водой.
- Добавьте 2,5 мл раствора для хранения данных на каждый СИД.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе СИД могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение недели. Было отмечено, что прочность связывания между PDMS и стеклом уменьшается с течением времени. Помимо недели, пользователям рекомендуется проверить СИД на потенциальную утечку перед использованием. Для этого оспирировать решение для хранения и добавить 35 МКЛ 1x PBS в каждое отверстие. После использования, PDMS вставки могут быть очищены от стеклянной нижней посуды. Для достижения оптимальной очистки стеклянного дна посуды, несколько моет с изопропанолом и соляной кислотой должны быть использованы для удаления остатков PDMS.
2. Образование сфероидов и встраивание в коллаген (длительность 4 дня)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для живой визуализации сфероидов, продольно или в покадровых видео, используйте клеточную линию, выражают цитоплазмический и/или ядерный флуоресцентный белок. Если такая линия ячейки доступна, следуйте шагам, описанным в этом разделе. Кроме того, в разделе 3 предлагается протокол для обозначения раковых клеток в сфероидах с использованием цитоплазмического красителя.
- Форма сфероидов 4T1 и / или 67NR клеток с использованием техники висячие капли,как ранее описано 4,5,6,7, с 3000 клеток / 40 йл капли и 3-дневное время инкубации. Добавьте бычий atelocollagen I решение последнего и поддерживать все решения на льду, во все времена.
- Определите правильно сформированные сфероиды с помощью ярко-полевого микроскопа.
- Заполните коническую трубку 15 мл с 8 мл предварительно разогретой полной среды.
- Соберите сфероиды с помощью трубы P1000 и перенесите в коническую трубку 15 мл. Влажный кончик пипетки путем пипетки некоторые полные среды в и из, чтобы предотвратить сфероиды от прилипания к внутренней стенке кончика пипетки и ограничить потерю сфероидов.
- Разрешить сфероидов опускаться на дно трубки и тщательно мыть сфероиды путем обмена среды. Повторите дважды.
- Подготовье раствора коллагена 5 мг/мл I в соответствии с рекомендациями производителя (альтернативная процедура геля, см. примерный расчет ниже). Замените дистиллированную воду на полную среду. При расчете объема среды, которая будет использоваться, примите во внимание, что сфероиды будут добавлены в 20 л полной среды, например, для одного SID, 3 x 30 (3 x 30) х 20% и 108 л коллагена 5 мг/мл я необходим (подготовить 20% дополнительно для учета потери труб при обработке вязкой жидкости); 22 л полной среды - 10,8 л 10хТ PBS - 1,2 л из 1 М НаОХ ( 54 л коллагена 10 мг/мл коллагена I запасов).
- Соберите все сфероиды в 20 МКЛ среды, используя P200 пипетки, и добавить их в раствор коллагена I подготовлен в шаге 2.6.
- Медленно смешайте раствор, трубя вверх и вниз, чтобы избежать неоднородности в концентрации коллагена I, ограничивая образование пузырьков. Держите раствор на льду.
- Удалите раствор для хранения из SID (ы) и мыть 3 раза с 3 мл 1x PBS. После окончательной стирки оставьте SID (ы) сухой, чтобы не разбавить раствор коллагена I.
- Запустите таймер и раздайте 30 МКЛ раствора коллагена I, содержащего один сфероид в одно из трех отверстий SID. Визуально убедитесь, что один сфероид содержится в 30 МКЛ.
- Повторите шаг 2.10 в два раза больше, чтобы заполнить все 3 отверстия SID.
- Используйте наконечник пипетки 10 йл для повторного центра сфероида, если он расположен недалеко от границы PDMS. Если два или три сфероида в конечном итоге обойтись в одном из отверстий, тот же кончик пипетки могут быть использованы для отделить сфероиды друг от друга. Остановите таймер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто инвертирование SID вверх ногами и вверх, на протяжении всего периода полимеризации коллагена I и затвердевания, гарантирует, что сфероид расположен в вертикальном центре слоя ECM, и предотвращает вторжение клеток в 2D. Частота инвертирования (переворачивания) должна быть максимальной. Поскольку частота переворачивания контролируется сфероидным "временем дозирования", измеренным в 2.10-2.12, время дозирования должно быть сведено к минимуму. В нашей лаборатории время раздачи составляет в среднем 2 минуты. - Чтобы вертикально центр сфероида в коллагеновом слое, переверните SID вверх дном и инкубировать при 37 градусов по Цельсию для дозирования времени.
- Переверните SID вверх и инкубировать при 37 градусов по Цельсию для дозирования времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени, которое сфероиды проводят в перевернутой ориентации, должна быть равна времени, затяжная в перевернутой ориентации. - Повторите шаги 2.13 и 2.14 в течение 30 минут, пока коллаген I не полимеризуется.
- Добавьте 2,5 мл полной среды/SID и при необходимости приобретите изображение сфероидов для первоначальной точки времени.
- Повторите шаги 2.10-2.16, если используется несколько СИД.
3. Флуоресценция маркировки сфероидов
- Изображения в реальном времени (длительность 6-7 дней)
ПРИМЕЧАНИЕ: Если имеется клеточная линия, выражаюющая цитоплазмический и/или ядерный флуоресцентный белок, следуйте шагам, описанным в разделе 2. В качестве альтернативы для цитоплазмической маркировки предлагается следующий протокол.- Следуйте шагам 2.1-2.5 протокола, описанного в разделе 2.
- Разбавить цитоплазмический краситель до 25 МКМ в 200 МКЛ без сыворотки среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как красный цитоплазмический краситель используется в этом эксперименте, любой другой доступный цвет должен быть подходящим. Раковые клетки были помечены внутри сфероидов с использованием ядерных красителей, разбавленных до 20 МКм в 200 МКЛ без сыворотки среды (см. Таблицу материалов). - После окончательной стирки, resuspend сфероидов в цитоплазмы или раствора ядерного красителя и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, защищенных от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: При этом подходе маркировка клеток в сфероидной центре не будет эффективной. Для достижения маркировки всех клеток, инкубация может быть продлена на ночь, поставив блюдо на рокер. Альтернативы описаны в обсуждении. - Вымойте сфероиды 3 раза в полной среде.
- Приступайте к шагам 2.6-2.17 протокола, описанным в разделе 2.
- Изображение сфероидов с помощью замедленной визуализации каждые 10 минут в течение 24-72ч (рисунок 2), или с помощью продольной визуализации, ежедневно, на срок до 7 дней(рисунок 3). Используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, 10-х воздушную цель (0,4 численное отверстие и 3,1 мм рабочего расстояния), 1024 х 1024 пикселей, время экспозиции 8 мк/пиксель, пинхол 90 мкм, 6 х 15 мкм z-шагов и 3 поля зрения, содержащие один сфероид.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки времени изображения, использовать минимальную мощность лазера и оборудовать микроскоп с экологической камерой с температурой, влажностью и контролем газа. Культура встроенных сфероидов при 37 градусов по Цельсию для 8 ч или на ночь до изображения, чтобы свести к минимуму время на микроскоп.
- Иммунофлуоресценция окрашивания сфероидов (длительность 2 дня)
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь процедура адаптирована и оптимизирована из ранее опубликованныхпротоколов 8,9. Этот метод может быть использован после протокола, изложенного в разделах 2 и 3.1.- Свежеприготовь следующие решения.
- Решение для фиксации: 1x PBS, содержащий 4% PFA (vol/vol), добавить 5 мл 16% (vol/vol) PFA до 15 мл 1x PBS.
- Исправление и пермеабилизация раствора: 1x PBS, содержащий 4% PFA (vol/vol) и 0,5% Triton X-100 (vol/vol) (например, добавить 50 мл Triton X-100 до 10 мл фиксируя раствора).
- Блокирующий раствор: 1x PBS, содержащий 1% FBS (vol/vol) и 1% BSA (wt/vol) (например, растворить 100 мг BSA в 10 мл 1x PBS, затем добавить 100 л FBS).
- Стиральное решение: 1x PBS, содержащий 0,05% Tween 20 (vol/vol) (например, добавить 25 мл Tween 20 до 50 мл 1x PBS).
- Удалите культурную среду из SID (ы) и мыть один раз с теплым 1x PBS.
- Добавьте 2 мл крепления и проницаемого раствора на СИД и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Удалите решение для фиксации и пермеабилизации и добавьте 2 мл раствора фиксации на СИД и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут.
- Вымойте 3 раза с стиральный раствор.
- Добавьте 2 мл блокирующего раствора на СИД и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 24 ч с легкой тряской.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, образцы могут быть инкубированы при 4 градусов по Цельсию, в выходные дни. Обратите внимание, что более длительное время блокировки может помешать процедуре маркировки иммунофлюоресценции. - Разбавить первичные антитела в блокирующий раствор.
- Добавьте 150 МКЛ блокирующего раствора с первичными антителами/хорошо в пластине из 48 колодец.
- Используя тонкие пинцеты, тщательно отсоедините вилку коллагена, содержащую сфероид, и перенесите в колодец. Повторите, если помечены несколько сфероидов. Протрите любую жидкость, которая может оставаться на пинцете при работе с различными антителами, чтобы предотвратить загрязнение.
- Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию с легкой тряской.
- Добавьте 300 мкл стирального раствора в пустые и полные колодцы.
- Тщательно перенесите вилку коллагена, содержащего сфероид, в «мытье» хорошо.
- Вымойте 3 раза раствором для мытья в течение 2 ч, при комнатной температуре и с легкой тряской.
ПРИМЕЧАНИЕ: Передача пробки коллагена я, содержащий сфероид, вместо того, чтобы аспирировать решения, может помочь уменьшить потерю образца и повреждения образца. - Разбавить вторичные антитела, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и/или фаллоидин в блокирующего растворе.
- Добавьте 150 МКЛ блокирующего раствора со вторичными антителами, DAPI и/или фаллоидином на колодец.
- Используя пинцет, тщательно перенесите коллагеновую вилку, содержащую сфероиды, в колодец. Повторите, если помечены несколько сфероидов.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч с легкой тряской.
- Повторите шаги 3.2.11 и 3.2.12.
- Вымойте 3 раза раствором для мытья в течение 30 минут, при комнатной температуре с легкой тряской.
- Используя лезвие бритвы, разрежьте 3-луночное PDMS вставку на три части, так что каждая часть содержит отверстие.
- Поместите два куска PDMS на слайд микроскопа.
- Добавьте каплю монтажа раствора с помощью наконечника P200 с отрезанием конца. Предотвратить образование пузырьков.
- Тщательно перенесите коллаген, который я подключаю к каждому отверстию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сфероид был расположен в верхней части коллагена штепсельной вилки, инвертировать коллагена плагин так, что сфероид заканчивается ближе к стеклянной крышкой. - Поместите крышку сверху и печать с помощью ленты.
- Пусть образец высохнет при комнатной температуре в течение 10 минут, защищенный от света.
- Храните образцы при 4 градусах Цельсия, защищенных от света до визуализации.
- Свежеприготовь следующие решения.
4. Обработка изображений для анализа вторжения рака с течением времени
ПРИМЕЧАНИЕ: Формат, необходимый для этого макроса, является одноканалю x,y,t изображение, сохраненное в .tiff файла.
- Если было приобретено несколько z-ломтиков(т.е. изображение x,y,z,t), откройте изображение на Фиджи и выберите изображение | Стеки | Проект. Рекомендуется использовать опцию Max Intensity. Кроме того, для запуска макроса можно использовать один z-срез. Сохраните изображение в качестве .tiff файла.
- Создайте отдельную папку «Обработка» на рабочем столе.
- Выберите файл | Сохранить как | Последовательность изображений. Используйте формат TIFF, обновьте число цифр в зависимости от количества кадров, проверьте поле, чтобы использовать метку среза в качестве имени файла и выберите Ok. Выберите папку "Обработка", созданную в шаге 2.
- Откройте одно изображение из папки "Обработка". Это должно быть изображение x,y, соответствующее одной точке времени.
- Выберите изображение | Отрегулируйте | Авто Порог. В меню высадки выберите метод Попробуйте все и проверьте поле на наличие белых объектов на черном фоне.
- Появляется монтажное изображение, показывающее результат для каждого автоматизированного метода порогового значения.
- Определите лучший автоматизированный метод порогового значения, например RenyIEntropy.
- Чтобы подтвердить выбор для автоматизированного метода порогового значения, откройте любое другое изображение из папки "Обработка" и проверьте выбранный метод порогового значения с помощью image | Отрегулируйте | Авто порог.
- Закройте все изображения.
- Скачать макрос SpheroidAreaTime(Дополнительный файл 2).
- Откройте макрос Фиджи путем перетаскивания и падения.
- В строке 58 при необходимости обновить автоматизированный метод порогового значения.
- В строке 62 обновим диапазон размеров в зависимости от размеров ячейки.
- Выберите Run.
- Выберите папку "Обработка" и ввемите в папку "Обработка" в качестве родительской папки, а затем выберите Ok.
- После того, как запуск закончен, сохраните таблицу "Summary". В первом столбце указано название изображения; третья колонна указывает на область сфероидов; шестая, седьмая и восемь колонн определяют параметры эллипса, установленного на сфероиде.
- Папка "Обработка" теперь содержит обработанное изображение для каждой точки времени с расширением _SpheroidArea.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сфероидный центр тусклый, заполните его белым с помощью инструментов отбора, для всех точек времени, а затем перейти к шагу 3. Аналогичным образом, пространство вокруг сфероида может быть заполнено черным, чтобы "очистить" изображение. Если изображение чистое, прокомментируете строку 61, чтобы ускорить запуск.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Благодаря своей биосовместимости, PDMS широко используется для микрофабрики ограниченных скважин, марок и форм, которые произвели революцию в микропаттернации и микрофлюидных устройств. В описанной здесь методике он используется для создания СИД, настраиваемых скважин, которые оптимизируют встраивание сфероидов и процедуру визуализации. На рисунке 1 иллюстрируются основные компоненты, используемые при изготовлении СИД. Чтобы бросить форму PDMS, 1-мм толщиной спейсер 3D печатных(рисунок 1A,B), расположенный между двумя стеклянными пластинами, запечатанные с большими клипами. Заливка и выпечка PDMS в пространстве между пластинами образует 1-мм лист PDMS. Схема SID (рисунок1C) указывает на размеры оптимального устройства, однако небольшие изменения происходят в расстоянии отверстия, из-за ручного штамповки отверстий с помощью биопсии ударов (Рисунок 1D). Рисунок 1D, F указывают на чистые круговые разрезы с равномерно разместавленных отверстий в вставке PDMS.
Использование СИД облегчает эффективное встраивание, и, следовательно, запись вторжения раковых клеток внутри коллагена I с использованиемпромежуток времени (рисунок 2, Видео 1) или продольной (Рисунок 3) изображения. Несмотря на использование тех же частот инверсии для всех СИД во время полимеризации коллагена I, сфероидные позиции внутри коллагеновой пробки будут немного отличаться. Поэтому важно использовать цель с большой рабочей дистанцией (1 мм). В противном случае фокусировка и визуализация могут быть трудными для сфероидов, расположенных близко к верхней части коллагеновой пробки. В отличие от этого, сфероиды расположены близко к нижней части коллагена штепсельной вилки, будет иметь клетки, которые движутся к поверхности стекла и мигрировать на стекло, вместо вторжения в коллагена Я матрицы. Видео таких сфероидов должны быть отброшены. Толщина коллагеновой вилки, здесь около 800 мкм, контролируется объемом, распределяемым в каждом отверстии СИД и приспособленным к нашествию расстояния сфероидов, выставленных в этом протоколе. Толщина коллагена штепсельная вилка может быть снижена путем дозирования меньшего объема коллагена I в каждом отверстии SID, при использовании небольших или менее инвазивных сфероидов.
Для надлежащего анализа вторжения с использованием макроса Фиджи крайне важно, чтобы раковые клетки были должным образом помечены в ходе сеанса визуализации. Как отмечается в шаге 4.17., этап обработки изображения позволяет коррекции изображения, если маркировка является неоптимальным. Хотя мы иллюстрирующие продольные изображения в течение 6 дней(рисунок 3), который требует стабильного выражения цитоплазмического и / или ядерного флуоресцентного белка, аналогичные продольные изображения могут быть выполнены в течение более короткого времени с использованием маркировки красителями.
После живой визуализации, мы представляем некоторые результаты от иммунолабеля процедуры эпителиального кадерин (E-кадерин), кортактин и F-актин(рисунок 4). В этих примерах мы использовали линии ячеек 4T1 и 67NR. На рисунке 5 пошаговая иллюстрация процедуры обработки изображений с использованием макроса Фиджи для измерения площади сфероида с течением времени.
Рисунок 1: Изготовление СИД. (A)Схематического представления верхнего вида космического пространства. (B)3D печатный промеец. (C)Схема представления верхнего вида SID. 3-луночный PDMS вставки (D) привязан к стеклянному дну блюдо (E), создавая окончательный SID (F). Размеры в миллиметрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Живое изображение сфероидов. Представитель 20 ч и 40 ч точек времени от видео 1, максимальная проекция 4T1 сфероида. Клетки 4T1 были помечены с помощью цитоплазмического красителя. Шкала бар, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Продольное изображение сфероидов. Репрезентативные микрографы (максимальная проекция) смешанного сфероида 4T1/67NR, изображенные ежедневно. Клетки 4T1 и 67NR стабилико выражают цитоплазмический mScarlet и зеленый флуоресцентный белок (GFP), соответственно. Шкала бар, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Иммунофлуоресценция изображения сфероидов. Были помечены репрезентативные микрографы (максимальная проекция) сфероида 4T1, зафиксированные через 2 дня после встраивания в коллаген I. E-кадерин (циан, A), кортактин (желтый, B) и F-актин (магента, А и В). Шкала бар, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ обработки изображений. Пошаговая иллюстрация процедуры обработки изображений с использованиеммакроса Фиджи (A)для измерения области сфероида с течением времени(B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Репрезентативное видео сфероида 4T1, изображенного каждые 10 минут в течение 46 ч и 10 мин. 4T1 клетки были помечены с помощью цитоплазмического красителя. Масштаб бар, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный файл 1: 3D-модель спейсера (файл STL). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: макрос SpheroidAreaTime. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D печатный спейсер был разработан для создания 1-мм толщиной листов PDMS, которые затем могут быть использованы для легкого создания различных форм PDMS, как того требуют экспериментальные приложения. Благодаря простоте его изготовления и свободе изменять конструкцию, этот метод литья PDMS был выбран для первоначального проектирования SID. Если требуется большой объем СИД, производство может быть более эффективным путем создания 3D-печатной формы, которая уже содержит диски PDMS с тремя одинаково рас распечатанными отверстиями, и сокращения процесса до одного шага. Это позволит устранить необходимость вы пробивать каждый диск, наряду с последующими тремя отверстиями, и уменьшить общее время подготовки.
В то время как 3-луночный пунш разработан для использования с 35 мм стеклянной нижней посуды, другие размеры доступны, которые позволяют больше отверстий и, следовательно, больше сфероидов, которые будут изображены параллельно. Кроме того, на заказ размер крышки стекла также коммерчески доступны, которые, в сочетании с 3D печатных держателей, может позволить для высокой пропускной способности сфероидных анализов. При таком подходе ограничивающим фактором является скорость сбора данных - например, в нашей многоцветной конфокальную визуализацию замедленного действия, приобретение 3D-стека одного сфероида требует примерно 2,5 минут. Таким образом, приобретение 3D стеков для 3 сфероидов в SID требует приблизительно 8 минут. В результате, чтобы поддерживать нашу предпочтительную частоту изображения на уровне 10 минут на стек, мы не можем увеличить количество отверстий в СИД.
Для записи и количественной оценки вторжения живых раковых клеток в 3D-модели сфероидов, ярко-полевой визуализации могут быть использованы5. Тем не менее, флуоресцентная микроскопия является предпочтительным, так как она обеспечивает повышенный контраст, и легкость и точность в обработке изображений. Если генерация клеточной линии, выражаюной цитоплазмический и/или ядерный флуоресцентный белок, невозможна, мы предлагаем использовать цитоплазмические красители. Поскольку время хранения цитоплазмических красителей внутри клеток составляет три дня в наших условиях визуализации, клетки должны быть помечены после 3-дневного периода в повешении капли, и непосредственно перед встраиванием. Маркировка клеток после встраивания может не конкретно маркировать коллаген и уменьшать маркировку клеток. Изображение в течение более 3 дней после встраивания требует использования различных сфероидов посева протокола10 или клеточных линий, стабилически выражают флуоресцентный белок (ы).
Мы успешно сформировали и изумили сфероиды, содержащие от 60 до 5000 клеток/капли. Малые сфероиды идеально подходят для записи вторжения в течение нескольких дней, так как вся их область вторжения может легко вписаться в одно поле зрения более высоких целей увеличения (20x-30x). Кроме того, они могут быть легко помечены во всем с цитоплазмой или ядерных красителей. Наконец, из-за уменьшенного рассеяния, каждая клетка в сфероиде может быть визуализирована и сегментирована. Тем не менее, небольшие сфероиды едва видны невооруженным глазом и может потребовать дополнительной маркировки маркерами тканей. В отличие от этого, большие сфероиды легче в обращении, но более восприимчивы к погружения в нижней части блюда, из-за их веса. Кроме того, клетки в сфероидный центр не всегда помечены при использовании красителей, или видимые с помощью конфокальная микроскопия, которая имеет глубину проникновения около 100 микрометров. Для визуализации всех раковых клеток во всех крупных сфероидах с помощью замедленной визуализации можно использовать многофотонную микроскопию, предлагая дополнительное преимущество визуализации коллагеновых волокон вторым гармоническим поколением (SHG) без необходимости маркировки. Кроме того, визуализация может быть сделано с помощью световоголиста микроскопии 8,11,12 , обеспечивая сокращение времени получения изображения и, следовательно, позволяет высокой пропускной способности сфероидных анализов, но и требует большехранения данныхи расширенной обработки изображений. Если покадровые видео не требуются, наша процедура маркировки для фиксированных 3D сфероидов может быть дополнительно объединена с оптическойочисткой 8,10. Кроме того, криозирование встроенных сфероидов может устранить проблемы с проникновением красителя или антитела во время маркировки, а также проникновением света во время визуализации. В наших руках, однако, успешное криозирование было ограничено на ранних стадиях вторжения и неинвазивных клеток, из-за технических проблем в сохранении длинных и хрупких инвазивных нитей.
Наш протокол также совместим с использованием ядерных красителей, для обозначения раковых клеток внутри сфероидов, что позволяет одноклеточной отслеживания данных замедленного действия. Плагин Fiji TrackMate13 может быть использован для автоматизации отслеживания клеток и извлечения параметров подвижности отдельных ячеек, таких как скорость, мгновенная скорость и настойчивость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов Temple Bioengineering за ценные дискуссии. Мы благодарим Дэвида Амброуза в центре цитометрии потока (Школа медицины Льюиса Каца) за помощь в сортировке клеток и Тони Бёма из IdeaS Hub (Колледж инженерии, Университет Темпл) за помощь в 3D-печати. Мы также благодарим наши ресурсы финансирования: Американское онкологическое общество научно-исследовательский грант 134415-RSG-20-034-01-CSM, Победить рак сейчас / Молодые следователи премии, Национальные институты здравоохранения, R00 CA172360 и R01 CA230777, все для BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
