Denne protokol isolerer total RNA af høj kvalitet fra fækale prøver af dyr og mennesker. Et kommercielt miRNA-isolationssæt bruges med betydelig tilpasning til at isolere rent RNA med optimeret mængde og kvalitet. RNA-isolaterne er gode til de fleste downstream RNA-assays såsom sekventering, mikroarray og RT-PCR.
Det bliver klart, at RNA findes i tarmens lumen og afføring hos dyr og mennesker. Protokollen beskrevet nedenfor isolerer total RNA inklusive mikroRNA’er fra fækale prøver af dyr og mennesker. Målet er at isolere total RNA med høj renhed og mængde til downstream-analyser såsom RNA-sekventering, RT-PCR og mikroarray. Fordelene ved denne optimerede protokol i miRNA-isoleringen er muligheder for at isolere højt oprensede RNA-produkter med yderligere vasketrin beskrevet, øget mængde RNA opnået med en forbedret metode til resuspension af prøve og vigtige tip til dekontaminering. En begrænsning er manglende evne til at behandle og rense større prøve på mere end 200 mg, da disse prøvestørrelser ville forårsage vanskeligheder med den klare dannelse af interfasen. Følgelig kan den store prøvestørrelse forurene den vandige fase, der skal ekstraheres som beskrevet i protokollen med organiske stoffer, der påvirker kvaliteten af RNA isoleret i sidste ende. RNA-isolater fra en prøve på op til 200 mg er imidlertid tilstrækkelige til de fleste downstream-analyser.
Ekstracellulært RNA bliver anerkendt som en væsentlig faktor, der formidler mange biologiske processer1. Ekstracellulært RNA i afføring blev først rapporteret i 2008 som en markør for tyktarmskræft og aktiv ulcerøs colitis2, og det blev for nylig afsløret som en normal komponent i tarmens lumen og afføring og medierer værtsmikrobekommunikation 3,4,5. Formålet med denne RNA-isolationsprotokol er at ekstracellulære RNA af høj kvalitet fra fækale prøver indsamlet fra dyr og mennesker. Protokollen blev tilpasset fra et kommercielt miRNA-isolationssæt. Det erhvervede RNA bruges til downstream-analyser såsom RNA-sekventering, RT-PCR og mikroarray. Protokollen indeholder flere vigtige og nyttige tips til at maksimere mængden og kvaliteten af RNA, der findes i afføring fra dyr og mennesker. Årsagen til at udvikle og optimere denne metode til RNA (herunder microRNA) isolering er at reducere mikrobielt RNA i afføringen, begrænse variablerne i forskningsundersøgelserne og analysere RNA-sammensætningen i tarmen uden at redegøre for forskellige forvirrende faktorer og forureningskilder. Bemærk, at denne RNA-isolering minimerer frigivelsen af RNA fra levende celler og levende mikrober (cellulært RNA). Det fokuserer på ekstracellulære RNA’er, der er blevet frigivet af tarmceller eller er blevet erhvervet via fødeindtagelse. Principielt er denne metode ikke egnet til undersøgelser, hvor det mikrobielle transkriptom undersøges.
Det er vigtigt at bruge RNase-fri teknik for at forhindre RNase-forurening under isoleringen7. Efter centrifugering og dannelsen af en kompakt interfase er det nøglen til at undgå, at interfasen, den nedre fase og partikelforureningen flyder på toppen af den vandige fase, når man genvinder den vandige fase. Derudover tilføjes to vasketrin med 500 μL og 250 μL vaskeopløsning 2/3 for at eliminere forurenende stoffer i filtermembranen for optimeret kvalitet. Desuden anbefales et startprøvema…
The authors have nothing to disclose.
Vi modtog teknisk assistance fra Biopolymers Facility på Harvard Medical School til bioanalysator. Dette arbejde blev støttet af National Multiple Sclerosis Society forskningsbevilling RG-1707-28516 (H.L.W. og S.L.).
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
Gloves | |||
Microcentrifuge | |||
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
Vortex Shaker |