Denne protokol viser brugen af en fænotype microarray (PM) teknologi platform til at definere metaboliske krav til Chlamydomonas reinhardtii, en grøn mikroalger, og forfine en eksisterende metabolisk netværk model.
Metaboliske modeller rekonstrueres baseret på en organismes tilgængelige genomanmærkning og giver prædiktive værktøjer til at studere metaboliske processer på systemniveau. Genom-skala metaboliske modeller kan omfatte huller samt reaktioner, der er ubekræftede eksperimentelt. Rekonstruerede modeller af nyligt isolerede mikroalgale arter vil resultere i svagheder på grund af disse huller, da der normalt er sparsom biokemisk dokumentation til rådighed for metabolismen af sådanne isolater. Fænotypen microarray (PM) teknologi er en effektiv, high-throughput metode, der funktionelt bestemmer cellulære metaboliske aktiviteter som reaktion på en bred vifte af indrejse metabolitter. Kombinere den høje gennemløb fænotypiske assays med metabolisk modellering kan gøre det muligt eksisterende metaboliske netværk modeller, der hurtigt rekonstrueres eller optimeres ved at give biokemiske beviser til at støtte og udvide genomisk dokumentation. Dette arbejde vil vise brugen af PM assays til undersøgelse af mikroalger ved hjælp af den grønne mikroalgal model arter Chlamydomonas reinhardtii som et eksempel. Eksperimentel dokumentation for over 254 reaktioner opnået ved PM blev brugt i denne undersøgelse til at udvide og forfine en genom-skala C. reinhardtii metaboliske netværk model, iRC1080, med ca 25 procent. Protokollen skabt her kan bruges som grundlag for funktionelt profilering af stofskiftet af andre mikroalger, herunder kendte mikroalger mutanter og nye isolater.
Optimering af algemetabolisme til forbedret og stabil produktion af målrettede metabolitter kræver udvikling af komplekse metaboliske tekniske strategier gennem system-niveau analyser af metaboliske netværk. Metaboliske netværksmodeller kan vejlede de rationelle design til hurtig udvikling af optimeringsstrategier1,2,3,4. Selv om ca. 160 mikroalgal arter er blevet sekventeret5, der er, så vidt vi ved, kun 44 alge metaboliske modeller til rådighed4,6,7. På grund af vanskeligheden ved at opnå høj-throughput metaboliske fænotypiske data til eksperimentel validering af genomisk information, genopbygningen af høj kvalitet netværk modeller halter bagefter den hurtige udvikling af alge genom sekventering.
C. reinhardtii er et attraktivt modelsystem til algebaserede studier. Denne art kan vokse fotoautotrophically eller heterotrophically og har været meget udbredt som en model organisme i grundforskning og anvendt forskning. Dens genomsekvens blev offentliggjort i 20078, med genomskala metaboliske modeller efterfølgende rekonstrueret for arten9,10,11. Genomskalamodellen for C. reinhardtii (iRC1080) blev rekonstrueret af Chang et al. 10 baseret på genomisk dokumentation og litteratur evidens (med ~ 250 kilder). Det har 1.706 metabolitter med 2.190 reaktioner10; Modellens fuldstændighed kunne imidlertid ikke verificeres ud over de foreliggende offentliggjorte eksperimentelle beviser på det tidspunkt.
Den fænotype microarrays (PMs) teknologi er en høj-throughput platform, der kan give metabolisk profilering oplysninger for heterotrofiske mikroorganismer samt væv-kultur celler. Det kan især bruges til at afhjælpe fænotype-til-genotype videngabløften i mikroalger, som først rapporteret for Chlamydomonas reinhardtii12 og efterfølgende for en art af Chloroidium13 og Chlorella14. Ved at studere celleresponser på tusindvis af metabolitter, signalmolekyler, osmolytter og effektormolekyler kan PM-analyserne give funktionel metabolisk profilering og give indsigt i funktionen, stofskiftet og miljøfølsomheden15,16,17. Specifikt PM assays opdage celler metabolit udnyttelse i 96-brønd mikroplader med forskellige næringsstoffer, metabolitter, eller osmolytter indeholdt i hver brønd. Desuden er det også muligt at analysere bioaktive molekyler, såsom antibiotika og hormoner. Som bestemt af intensiteten af farveproduktionen ved NADH-reduktionen af et tetrazoliumbaseret redoxfarvestof evalueres den metaboliske udnyttelse af substrater i form af celle respiration15,16,17. Forsøgene i 96-brønd mikroplader kan overvåges og bestemmes automatisk over tid med fænotypen microarray instrument (PMI) platform. Tyve 96-brønd mikroplader er designet til at repræsentere de fælles sæt metabolitter til at studere cellulære fænotyper til at udnytte kulstof, kvælstof, svovl, og fosfor kilder, sammen med forskellige osmotiske / ion og pH effekter. PM-teknologien er med succes blevet brugt til opdatering og opgradering af en række eksisterende genomskala metaboliske modeller for mikroorganismer15,16,17,18.
Protokollen og data vist her er baseret på tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12 Det præsenterede arbejde beskriver brugen af PM assay metode til at karakterisere metaboliske fænotyper af mikroalger og til at udvide en eksisterende alge metaboliske model af C. reinhardtii samt at guide genopbygningen af nye metaboliske modeller.
Metabolisk phenotyping af den grønne mikroalga, C. reinhardtii, blev beskrevet her ved hjælp af høj gennemløb PM assay plader og en uændret PMI. Analyserne blev udnyttet til i alt 190 kulstofkilder (PM01 og PM02), 95 kvælstofkilder (PM03), 59 fosforkilder og 35 svovlkilder (PM04) sammen med peptid nitrogenkilder (PM06-08). Positiv respiration blev observeret for 148 næringsstoffer (en positiv analyse for C-source udnyttelse, fire positive analyser for hver S-kilde og P-source udnyttelser, og 139 positive analyser for N-kildeudnyttelse). Mediets substrater eller næringsstoffer (kulstof,kvælstof, fosfor eller svovl) må ikke tilsættes til det definerede medium, når de påføres de relevante PM-mikroplader, der tester for hver af disse kilder.
Den metode, der vises her, er effektiv til at karakterisere metaboliske mikroalger fænotyper, der kan bruges til at udvide eksisterende metaboliske netværk modeller eller direkte genopbygningen af nye modeller. Da de ernæringsmæssige krav i de fleste mikroalger ikke er kendt, kan denne platform bruges til at definere disse hurtigt. Nelson et al. 43 havde med succes anvendt disse metoder til at identificere nye forbindelser, der understøtter væksten af mikroalgeren Chloroidium sp. UTEX 3007 og brugte de opnåede oplysninger til at definere arternes indgangsmet metabolitter, som i modsætning til klamydomonaer omfatter 40 forskellige kulstofkilder.
En væsentlig begrænsning af PM til profilering af mikroalger er, at PMI ikke har nogen belysning i inkubationskammeret, og mikroalgeren skal være i stand til at udføre heterotrofisk metabolisme. Fraværet af lys kan påvirke fortolkningen af modeller, der inkorporerer lys til at beregne metaboliske fluxer. Genpar med koordinerende funktioner har udviklet sig til at udgøre metaboliske netværkshubs, og sondringen mellem fotosyntetiske og ikke-fotosyntetiske netværkshubs kan foretages44. Generelt ville fotosyntetiske netværkshubs (dvs. stærkt tilsluttede noder i modellen) blive udeladt af heterotrofiske modeller. I praksis bør modellering af heterotrofi i mixotrofiske arter udelade reaktioner, der vides at være drevet af lys, og tage højde for energibalanceforskellene mellem forholdene. Således modellering lys-afhængige og lys-uafhængige stofskifte er standard praksis i Chlamydomonas metabolisk modellering6,45.
Nogle grønne mikroalger, som Trebouxiophytes, er kendt for at assimilere en række kulstofmolekyler til vækst, og dette menes at være opstået fra deres lange evolutionære historie som medlemmer af lav46. Mens klorofytter som Chlamydomonas kan bruge acetat til vækst, kan den brune marine mikroalga Tisochrysis lutea, der er kendt for sit potentiale til kommercielt at producere meget langkædede flerumættede fedtsyrer (VLC-PUFAs), ikke bruge acetat, men kan bruge glycerol til vækst47. Biomassekoncentrationen på mere end 100 g l−1 tørcellevægt er opnået med Chlorella med optimeret tilsætning af organiske kulstofkilder i en fed batch-tilstand48. Desuden kan tilsætning af sukker til Chlorellavulgaris forhøje bindingen af CO2og dermed give en additiv fordel under fotosyntetisk vækst49. De fleste heterotrofiske mikroalger kan også vokse mixotrophically, men klorofyt Chromochloris zofingiensis har vist sig at slukke fotosyntese ved tilsætning af sukker50.
Diatomer, der tilhører divisionen Bacillariophyta, er en stor gruppe af fytoplankton. Selv om de fleste af diatomerne kun kan vokse fotoautotrophically, nogle af dem kan dyrkes mixotrophically eller heterotrophically51. For eksempel blev glycerol fundet at støtte væksten i lyset i mangel af CO2 i nogle diatomer, herunder modelarten Phaeodactylum tricornutum52. Også nogle bentiske diatomer som Nitzschia linearis kan vokse på kulhydrater i den mørke53. Det er sandsynligt, at udvide PM assays til diatomer og andre algegrupper ved at supplere egnede organiske kulstofkilder til at gøre det muligt for cellerne at vokse heterotrofisk, og en mixotrophy strategi kan også potentielt anvendes til den obligatoriske autotrofiske mikroalger giver en minimalt krævede lysforsyning.
For at vurdere dataenes reproducerbarhed anbefales det stærkt at udføre dublerede analyser for alle plader. En analyse kan kun betragtes som positiv, hvis absorbansen (PMI-værdien) efter fratrækning fra den negative kontrol og de respektive blankbjætter er positiv. Denne beskrivelse, i nærværelse af den testede forbindelse, er en afspejling af farvestoffets abiotiske reaktion med mediet.
The authors have nothing to disclose.
Stor støtte til dette arbejde blev ydet af NYUAD Center for Genomforskning og Systems Biology (CGSB), finansieret af Tamkeen under New York University Abu Dhabi Research Institute tilskud (73 71210 CGSB9) og NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. blev desuden støttet af Hundred Talents Program af Zhejiang University. Vi takker Ashish Jaiswal for hjælp til at optage videoen. Vi takker Hong Cai for at generere metaboliske fænotype data.
Ampicillin | VWR | 97062-796 | |
Biolog assay plates [ PM01-08] | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Biolog Omnilog Instrument | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 | Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. | Regents of the University of Minnesota | |
Kanamycin | VWR | 0408-EU-10G | |
Tetrazolium Violet Dye “D” | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Timentin | GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd | 42010012-2 |