В этом исследовании мы представляем протокол дифференциации нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных только стимуляцией импульса прямого тока (DC) в микрофлюидной системе.
Физиологические электрические поля (EF) играют жизненно важную роль в миграции клеток, дифференциации, деление и смерть. В этой статье описывается система микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток с использованием микроскопии. Микрофлюидная система состоит из следующих основных компонентов: оптически прозрачный электротактический чип, прозрачный иллюминатор олова (ITO), культурный медиа-заправочный насос, электроприбор, высокочастотный усилитель мощности, мультиплексер EF, программируемый моторизованный электроприбор X-Y-Я и перевернутый фазово-контрастный микроскоп, оснащенный цифровой камерой. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. Эта работа включает в себя дифференциацию нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных стимуляцией импульса прямого тока (DC). В среде обслуживания стволовых клеток, мышь NPC (mNPCs) дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты после стимуляции пульса DC. Результаты показывают, что простое лечение пульса DC может контролировать судьбу mNPCs и может быть использован для разработки терапевтических стратегий для расстройства нервной системы. Система может быть использована для клеточной культуры в нескольких каналах, для долгосрочной стимуляции EF, для клеточного морфологического наблюдения, и для автоматического приобретения изображений замедленного действия. Эта микрофлюидная система не только сокращает необходимое экспериментальное время, но и повышает точность управления микроокниронией.
Нейронные клетки-предшественники (NPC, также известный как нервные стволовые клетки и клетки-предшественники) может быть в качестве перспективного кандидата для нейродегенеративной терапевтическойстратегии 1. Недифференцированные NPC имеют способность к самообна роуклюре, мульти-потенции и пролиферативнойспособности 2,3. Предыдущее исследование сообщило, что внеклеточная матрица и молекулярные посредники регулируют дифференциацию NPC. Эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) способствуют распространению NPC, тем самым сохраняя недифференцированноесостояние 4.
Предыдущие исследования сообщили, что электрическая стимуляция может регулировать клеточной физиологическойдеятельности, такие как разделение 5,миграция 6,7,8, дифференциация1,9,10, иклеточной смерти 11. Электрические поля (ЭФ) играют жизненно важную роль в развитии и регенерации развития центральнойнервной системы 12,13,14. С 2009 по 2019 год эта лаборатория исследовала клеточные реакции на применение ЭФ в микрофлюиднойсистеме 1,6,7,8,15,16,17. Многоканальный, оптически прозрачный, электротаксийный (MOE) чип был разработан, чтобы быть пригодным для иммунофлуоресценции окрашивания для конфокальной микроскопии. Чип имел высокую оптическую прозрачность и хорошую долговечность и позволил одновременно провести три независимых эксперимента стимуляции и несколько иммунолабилитных условий в одном исследовании. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. В настоящем документе описывается развитие системы микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток.
Во время изготовления чипа МЧС адаптеры прикрепляются к слою 1 чипа МЧС с быстро действующим цианоакрилатом. Клей наносится на 4 угла адаптеров, а затем равномерно наносится на адаптеры. Избыточного количества клея следует избегать, чтобы обеспечить полную полимеризацию клея. Кроме тог…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят профессора Тан К. Тан, Институт биомедицинских наук, Академия Sinica, за его помощь в обеспечении мыши нервных стволовых и прародителя клеток (mNPCs). Авторы также благодарят профессора Тан К. Тан и г-жу Ин-Шан Ли за их ценную дискуссию о дифференциации мНПЦ.
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG – H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |