Summary

Электро-поле индуцированной нейронной дифференциации клеток-предшественников в микрофлюидных устройств

Published: April 14, 2021
doi:

Summary

В этом исследовании мы представляем протокол дифференциации нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных только стимуляцией импульса прямого тока (DC) в микрофлюидной системе.

Abstract

Физиологические электрические поля (EF) играют жизненно важную роль в миграции клеток, дифференциации, деление и смерть. В этой статье описывается система микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток с использованием микроскопии. Микрофлюидная система состоит из следующих основных компонентов: оптически прозрачный электротактический чип, прозрачный иллюминатор олова (ITO), культурный медиа-заправочный насос, электроприбор, высокочастотный усилитель мощности, мультиплексер EF, программируемый моторизованный электроприбор X-Y-Я и перевернутый фазово-контрастный микроскоп, оснащенный цифровой камерой. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. Эта работа включает в себя дифференциацию нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных стимуляцией импульса прямого тока (DC). В среде обслуживания стволовых клеток, мышь NPC (mNPCs) дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты после стимуляции пульса DC. Результаты показывают, что простое лечение пульса DC может контролировать судьбу mNPCs и может быть использован для разработки терапевтических стратегий для расстройства нервной системы. Система может быть использована для клеточной культуры в нескольких каналах, для долгосрочной стимуляции EF, для клеточного морфологического наблюдения, и для автоматического приобретения изображений замедленного действия. Эта микрофлюидная система не только сокращает необходимое экспериментальное время, но и повышает точность управления микроокниронией.

Introduction

Нейронные клетки-предшественники (NPC, также известный как нервные стволовые клетки и клетки-предшественники) может быть в качестве перспективного кандидата для нейродегенеративной терапевтическойстратегии 1. Недифференцированные NPC имеют способность к самообна роуклюре, мульти-потенции и пролиферативнойспособности 2,3. Предыдущее исследование сообщило, что внеклеточная матрица и молекулярные посредники регулируют дифференциацию NPC. Эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) способствуют распространению NPC, тем самым сохраняя недифференцированноесостояние 4.

Предыдущие исследования сообщили, что электрическая стимуляция может регулировать клеточной физиологическойдеятельности, такие как разделение 5,миграция 6,7,8, дифференциация1,9,10, иклеточной смерти 11. Электрические поля (ЭФ) играют жизненно важную роль в развитии и регенерации развития центральнойнервной системы 12,13,14. С 2009 по 2019 год эта лаборатория исследовала клеточные реакции на применение ЭФ в микрофлюиднойсистеме 1,6,7,8,15,16,17. Многоканальный, оптически прозрачный, электротаксийный (MOE) чип был разработан, чтобы быть пригодным для иммунофлуоресценции окрашивания для конфокальной микроскопии. Чип имел высокую оптическую прозрачность и хорошую долговечность и позволил одновременно провести три независимых эксперимента стимуляции и несколько иммунолабилитных условий в одном исследовании. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. В настоящем документе описывается развитие системы микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток.

Protocol

1. Проектирование и изготовление чипа МЧС Нарисуйте шаблоны для отдельных слоев полиметилметилата (PMMA) и двустороннюю ленту с использованиемсоответствующего программного обеспечения (рисунок 1A, Таблица материалов). Вырезать как PMMA листов и двусторонняя ?…

Representative Results

Подробная конфигурация чипа МЧС показана на рисунке 1. Микрофлюидный чип обеспечивает полезный подход для уменьшения размера экспериментальной установки, объема выборки и объема реагентов. Чип MOE был разработан для проведения трех независимых экспер?…

Discussion

Во время изготовления чипа МЧС адаптеры прикрепляются к слою 1 чипа МЧС с быстро действующим цианоакрилатом. Клей наносится на 4 угла адаптеров, а затем равномерно наносится на адаптеры. Избыточного количества клея следует избегать, чтобы обеспечить полную полимеризацию клея. Кроме тог…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят профессора Тан К. Тан, Институт биомедицинских наук, Академия Sinica, за его помощь в обеспечении мыши нервных стволовых и прародителя клеток (mNPCs). Авторы также благодарят профессора Тан К. Тан и г-жу Ин-Шан Ли за их ценную дискуссию о дифференциации мНПЦ.

Materials

1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) BHT K2R20 Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube Protech Technology Enterprise Co., Ltd CT-15-PL-TW Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe TERUMO DVR-3413 3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5) CHI MEI Corporation ACRYPOLY PMMA Sheet Optical grade PMMA
3-way stopcock NIPRO NCN-3L Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe TERUMO DVR-3410 5 mL oral syringes, without needle
Adaptor Dong Zhong Co., Ltd. Customized PMMA adaptor
Agarose Sigma-Aldrich A9414 Agarose, low gelling temperature
Amplifier A.A. Lab Systems Ltd A-304 High voltage amplifier
AutoCAD software Autodesk Educational Version Drafting
B-27 supplement Gibco 12587-010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech AF-100-18B Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung TERUMO DVR-3413 From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich B4287 Blocking reagent 
Centrifuge HSIANGTAI CV2060 Centrifuge
CO2 laser scriber Laser Tools and Technics Corp.  ILS-II Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector IDEX Health & Science F-120X One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor IDEX Health & Science P-659 Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope Leica Microsystems TCS SP5 Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera OLYMPUS E-330 Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope Tektronix TDS2024 Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape 3M  PET 8018 Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 12400024 DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600010 DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer Asiatic Sky Co., Ltd. Customized Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue 3M  7004T Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector IDEX Health & Science P-206 Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator Agilent Technologies 33120A High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150117 Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150086 Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG – H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
ImageJ software National Institutes of Health 1.48v Analyze the fluorescent images 
Indium–tin–oxide (ITO) glass Merck 300739 For ITO heater
Inverted phase contrast microscope OLYMPUS CKX41 For cell morphology observation
K-type thermocouple Tecpel TPK-02A Temperature thermocouples
Luer adapter IDEX Health & Science P618-01 Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe TERUMO DVR-3413 For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP eBioscience 14-9892 Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody R&D Systems MAB1326 Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS) Basic Life BL2651 Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL) SIGMA P4707 Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H MARIENFELD 107242 https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage Tanlian Inc Customized Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller Toho Electronics TTM-J4-R-AB Temperature controller 
PTFE tube Professional Plastics Inc. Taiwan Branch Outer diameter 1/16 Inches White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1 Abcam ab18207 Neuron marker
Syringe pump New Era Systems Inc NE-1000 NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent FRANKLAB TFD4 Cover glass cleaner
Thermal bonder Kuan-MIN Tech Co. Customized Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner LEO LEO-300S Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. DOV-30 Vacuum drying oven
White fingertight plug IDEX Health & Science P-316 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html

References

  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

Play Video

Cite This Article
Chang, H., Chou, S., Cheng, J. Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (170), e61917, doi:10.3791/61917 (2021).

View Video