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Neuroscience

आणविक विश्लेषण के लिए सेरिबेलर क्षेत्रीय विच्छेदन

Published: December 5, 2020 doi: 10.3791/61922

Summary

विभिन्न सेरिबेलर क्षेत्रों को अलग व्यवहार आउटपुट में भूमिका निभाने के लिए फंसाया गया है, फिर भी अंतर्निहित आणविक तंत्र अज्ञात रहते हैं। यह काम एक विधि का वर्णन करता है जो गोलार्द्धों, पूर्वकाल और पीछे के क्षेत्रों के सेरिबेलर कॉर्टेक्स को पुन: उत्पन्न और जल्दी से विच्छेदन करने के लिए, और गहरी सेरिबेलर नाभिक आरएनए को अलग करके आणविक मतभेदों की जांच करने और जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों के लिए परीक्षण के लिए।

Abstract

सेरिबैलम आंदोलन, संतुलन, अनुभूति, इनाम और प्रभावित के नियंत्रण सहित कई महत्वपूर्ण कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इमेजिंग अध्ययनों से संकेत मिलता है कि अलग सेरिबेलर क्षेत्र इन विभिन्न कार्यों में योगदान देते हैं। क्षेत्रीय सेरिबेलर मतभेदों की जांच करने वाले आणविक अध्ययन पिछड़ रहे हैं क्योंकि वे ज्यादातर पूरे सेरिबेलर अर्क पर किए जाते हैं जिससे विशिष्ट सेरिबेलर क्षेत्रों में किसी भी भेद को मास्किंग किया जाता है। यहां हम चार अलग-अलग सेरिबेलर क्षेत्रों को पुन: उत्पन्न और जल्दी से विच्छेदन करने की तकनीक का वर्णन करते हैं: डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन), पूर्वकाल और पीछे वर्मेल सेरिबेलर कॉर्टेक्स, और गोलार्द्धों के सेरिबेलर कॉर्टेक्स। इन विशिष्ट क्षेत्रों को विच्छेदन आणविक तंत्र की खोज के लिए अनुमति देता है जो संतुलन, आंदोलन, प्रभाव और अनुभूति के लिए उनके अद्वितीय योगदान को रेखांकित कर सकता है। इस तकनीक का उपयोग विभिन्न माउस रोग मॉडलों में इन विशिष्ट क्षेत्रों के रोग संवेदनशीलता में अंतर का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

सेरिबैलम में मस्तिष्क में आधे से अधिक न्यूरॉन्स होते हैं और ऐतिहासिक रूप से मस्तिष्क में एक मोटर नियंत्रण और संतुलन केंद्र के रूप में संदर्भित किया गया है1. हाल ही में, अध्ययनों से पता चला है कि सेरिबैलम अनुभूति, इनाम प्रसंस्करण सहित विभिन्न अन्य कार्यों मेंमहत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और2,3,4,5को प्रभावित करता है।

सेरिबैलम में शरीर रचना विज्ञान का अच्छी तरह से वर्णन किया गया है: कॉर्टेक्स क्षेत्र कणिका, पुरकिंजे और आणविक परतों से बना है। कणिका कोशिकाएं कणिका कोशिका परत बनाती हैं और आणविक परत के पुरकिंजे सेल डेंड्राइट्स को समानांतर फाइबर के माध्यम से इनपुट भेजती हैं जो अवर जैतून में उत्पन्न होने वाले फाइबर पर चढ़ने से इनपुट भी प्राप्त करती हैं। पुरकिंजे कोशिकाएं गहरे सेरिबेलर नाभिक (डीसीएन) में कोशिकाओं को निरोधात्मक अनुमान भेजती हैं, जो सेरिबैलम से मुख्य उत्पादन के रूप में कार्य करती है। इस सेरिबेलर सर्किट का आउटपुट गोलगी, स्टेलेट और बास्केट सेल4सहित सेरिबेलर कॉर्टेक्स में निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स की गतिविधि से और अधिक संग्राहक है। यह सेरिबेलर कार्यात्मक इकाई सेरिबेलर कॉर्टेक्स के सभी लॉबुल्स में वितरित की जाती है। सेरिबैलम में इस अपेक्षाकृत समान सर्किटरी के बावजूद, मानव न्यूरोइमेजिंग साहित्य और रोगी अध्ययनों के साक्ष्य सेरिबैलम6,7की कार्यात्मक विषमता को इंगित करते हैं।

सेरिबेलर कॉर्टेक्स को दो मुख्य क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: मिडलाइन-परिभाषित वर्मिस, और पार्श्व गोलार्द्ध। वर्मिस को आगे पूर्वकाल और पीछे के लोबुल्स में विभाजित किया जा सकता है। सेरिबैलम के इन अलग क्षेत्रों को विभिन्न व्यवहारों में योगदान देने में फंसाया गया है। कार्य-पैदा या कार्य मुक्त गतिविधि पैटर्न ने फंसाया कि वर्मिस के पूर्वकाल क्षेत्र मोटर फ़ंक्शन में अधिक योगदान देते हैं जबकि पीछे की वर्मिस अनुभूति6,7में अधिक योगदान देती है। वर्मिस को प्रभावित और भावनाओं से भी जोड़ा जाता है, जबकि सेरिबेलर गोलार्द्ध कार्यकारी, दृश्य-स्थानिक, भाषा और अन्य स्नेमोनिक कार्यों में योगदान देते हैं8। इसके अलावा, शारीरिक अध्ययनों ने इस बात के सबूत दिए कि कार्यात्मक रूप से अलग सेरिबेलर क्षेत्र विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों से जुड़े हुए हैं9। घाव-लक्षण मानचित्रण से पता चला है कि पूर्वकाल lobules को प्रभावित स्ट्रोक के साथ रोगियों (lobule छठी में विस्तार) ठीक मोटर कार्यों पर गरीब प्रदर्शन किया था, जबकि पीछे पालि क्षेत्रों और गोलार्द्धों को नुकसान के साथ रोगियों को सेरिबेलर मोटर सिंड्रोम10के अभाव में संज्ञानात्मक घाटे का प्रदर्शन किया । अंत में , रोग में क्षेत्रीय सेरिबेलर विकृति इंगित करती है कि कार्यात्मक रूप से अलग सेरिबेलर क्षेत्र भी रोग के लिए अलग तरह से अतिसंवेदनशीलहोतेहैं11,12.

जबकि बहुत कम पता लगाया, प्रारंभिक सबूत सेरिबेलर कॉर्टिकल क्षेत्रों में अलग जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर दर्शाता है । ज़ेब्रिन II की पुरकिंजे कोशिका अभिव्यक्ति क्षेत्र को वर्मिस में विशिष्ट पैटर्न दिखाती है जैसे कि पीछे के लोबुल्स में अधिक ज़ेब्रिन II सकारात्मक कोशिकाएं हैं और पूर्वकाल लोबुल्स13में कम हैं। यह क्षेत्रीय रूप से अलग शारीरिक कार्य से भी संबंधित है क्योंकि जेबरिन II नकारात्मक पुरकिंजे कोशिकाएं पुरकिंजे कोशिकाओं की तुलना में टॉनिक फायरिंग की उच्च आवृत्ति प्रदर्शित करती हैं जो ज़ेब्रिन II सकारात्मक14हैं।

सेरिबेलर कॉर्टेक्स के अलावा, सेरिबैलम में डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन) शामिल है जो सेरिबैलम के लिए प्राथमिक उत्पादन के रूप में काम करता है। नाभिक मध्यवर्ती (एमएन), इंटरपोस्ड (आईएन), और पार्श्व नाभिक (एलएन) से बने होते हैं। कार्यात्मक इमेजिंग और रोगी अध्ययनों से पता चला है कि डीसीएन विभिन्न व्यवहारों में भी भाग लेता है15,लेकिन बहुत कम अध्ययन डीसीएन में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच करते हैं।

आणविक तकनीकों में प्रगति ने मस्तिष्क में क्षेत्रीय जीन अभिव्यक्ति का आकलन करना संभव बना दिया है और शारीरिक और रोग दोनोंराज्योंमें विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में विषमता का पर्दाफाश किया है । इस तरह के अध्ययनों से यह फंसाता है कि सेरिबैलम अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से अलग है। उदाहरण के लिए, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में सेरिबैलम में ग्लियल कोशिकाओं में न्यूरॉन्स का अनुपात उलटा होता है1. सामान्य शारीरिक परिस्थितियों में भी, प्रोइनफ्लेमेटरी जीन की अभिव्यक्ति अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में सेरिबैलम में अपृत किया जाता है17। सेरिबेलर रोगों के रोगजनन में योगदान देने वाले रास्तों की पहचान करने में आणविक तकनीक भी बहुत उपयोगी रही है। उदाहरण के लिए, पूरे सेरिबेलर अर्क के आरएनए अनुक्रमण ने अपने जंगली प्रकार के नियंत्रणों की तुलना में स्पिनोसेरेबेलर एटैक्सिया टाइप 1 (एससीए1) के पुरकिंजे सेल विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में परिवर्तित जीन की पहचान की। इस तरह के साक्ष्यों से सेरिबेलर पुरकिंजे कोशिकाओं में रोगजनकता अंतर्निहित प्रमुख आणविक मार्गों का पता चला है और इससे संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने में मदद मिली है18। हालांकि , हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सेरिबेलर क्षेत्रों में बीमारियों के प्रति संवेदनशीलता में अंतर हैं11,12,19. यह इंगित कर सकता है कि अलग-अलग सेरिबेलर क्षेत्रों में होने वाले महत्वपूर्ण परिवर्तन हैं, जो पूरे सेरिबेलर अर्क के साथ नकाबपोश या पता नहीं लगाया जा सकता है। इस प्रकार, ऐसी तकनीकों को विकसित करने की आवश्यकता है जो शोधकर्ताओं को विभिन्न सेरिबेलर क्षेत्रों में आणविक प्रोफाइल की जांच करने की अनुमति देती है।

यहां प्रस्तावित तकनीक उन क्षेत्रों से आरएनए को अलग करने और जीन अभिव्यक्ति में क्षेत्रीय मतभेदों का पता लगाने के लिए माउस सेरिबैलम के चार अलग-अलग क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए एक प्रजनन विधि का वर्णन करती है। चित्रा 1A में माउस सेरिबैलम की योजनाबद्ध नीले रंग में वर्मिस और पीले रंग में गोलार्द्धों पर प्रकाश डाला गया है। विशेष रूप से, इस तकनीक से चार क्षेत्रों को अलग करना संभव हो जाता है: डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन) (चित्रा 1 एमें लाल-बिंदीदार बक्से), पूर्वकाल वर्मिस (सीसीएवी) (गहरे नीले रंग में) का सेरिबेलर कॉर्टेक्स चित्रा 1A),पीछे के वर्मिस (सीसीपीवी) (चित्रा 1 एमें हल्का नीला), और गोलार्द्धों के सेरिबेलर कॉर्टेक्स (चित्रा 1 एमें पीला) का सेरिबेलर कॉर्टेक्स। इन क्षेत्रों की जीन अभिव्यक्ति का अलग से आकलन करके, इन विभिन्न क्षेत्रों के असतत कार्यों के साथ-साथ रोग में उनकी असुरक्षा में संभावित मतभेदों को अंतर्निहित आणविक तंत्रों की जांच करना संभव होगा ।

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Protocol

1. सेटअप

  1. डेपुटेशन कैंची, कुंद संदंश, विच्छेदन कैंची, संवहनी कैंची, माइक्रोस्पटुला, धनु माउस मस्तिष्क मैट्रिक्स, रेजर ब्लेड, 200 माइक्रोल पिपेट टिप्स, ग्लास पेट्री डिश, ग्लास स्लाइड, और आइस बकेट सहित आवश्यक उपकरण इकट्ठा करें। एक शोषक पैड पर सभी उपकरण बाहर रखना।
  2. बर्फ पर पेट्री डिश, ग्लास प्लेट और ब्रेन मैट्रिक्स रखें।
  3. लंबवत कोण पर एक रेजर ब्लेड का उपयोग करना, एक 200 माइक्रोल पिपेट टिप की नोक से लगभग 5 मिमी ट्रिम करें। यह टिप के अंत में खोलने का आकार लगभग 1 मिमी चौड़ा बनाता है। यह डीसीएन को पंच करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। लेकिन यह भी विच्छेदन के आधार पर जरूरत के रूप में समायोजित किया जा सकता है । आसान प्रतिस्थापन और समायोजन के लिए कई सुझाव तैयार करें।
  4. जानवरों की पहचान और सेरिबेलर क्षेत्र (प्रति पशु चार ट्यूब) के साथ 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब लेबल करें।
  5. निष्कर्षण के बाद ऊतक को फ्लैश करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ क्रायोसेफ कंटेनर भरें।

2. मस्तिष्क निष्कर्षण और विच्छेदन

सभी प्रयोग मिनेसोटा विश्वविद्यालय की पशु देखभाल समितियों के दिशा-निर्देशों के अनुसार किए गए थे ।

  1. माउस को 5% सीओ2 एक्सपोजर का उपयोग करके इच्छामृत्यु दें। एक बार सांस लेना बंद हो जाने के बाद सर्वाइकल अपभ्रंश करें। माउस को डेपुटेशन कैंची से हटा दें और शव को उचित पात्र में छोड़ दें।
  2. नाक पर शुरू सिर के मध्यीय sagittal लाइन के साथ एक उस्तरा ब्लेड के साथ एक चीरा बनाओ और सभी तरह वापस जारी है । त्वचा को अलग करें, मिडलाइन के दोनों ओर बिदाई करें। प्रत्येक तरफ मांसपेशियों को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें, कान नहरों के पिछले काटने।
  3. विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, किसी भी रीढ़ की हड्डी के क्षेत्रों को ट्रिम करें, जहां मस्तिष्क स्टेम सेरिबैलम से मिलता है, सेरिबैलम को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए सावधान।
  4. ब्रेनस्टेम और कशेरुका स्तंभ के बीच अंतरिक्ष में संवहनी कैंची ब्लेड में से एक डालें और कान नहर की ओर कटौती, कैंची पर उठाने के लिए सफाई से हड्डी में कटौती लेकिन ऊतक को नुकसान सीमा ।
  5. खोपड़ी के किनारे के साथ घ्राण बल्ब की ओर कटौती जारी रखें, जबकि मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान को सीमित करने के लिए काटने के लिए उठा जारी है ।
  6. कुंद संदंश का उपयोग करना, धीरे से मस्तिष्क और सेरिबैलम के पीछे के क्षेत्र को उजागर खोपड़ी के पीछे छील ।
  7. खोपड़ी के किनारे के साथ कुंद संदंश का उपयोग करना जो अभी काटा गया था, खोपड़ी के बाकी हिस्सों को और मस्तिष्क पर छील दें। इस चरण को खोपड़ी टोपी के बहुमत को हटा देना चाहिए, मस्तिष्क का खुलासा करना चाहिए।
  8. खोपड़ी के बाकी को संवहनी कैंची और कुंद संदंश के साथ ट्रिम करें, मस्तिष्क के ऊपर से अधिकांश खोपड़ी को साफ़ करें।
  9. माइक्रोस्पटुला का उपयोग करके, मस्तिष्क को थोड़ा उठाएं और शेष खोपड़ी से घ्राण बल्ब को हटाने और ऑप्टिक ट्रैक्ट फाइबर डिस्कनेक्ट करने के लिए स्लाइड करें। मस्तिष्क को इस बिंदु पर आसानी से मुक्त आना चाहिए।
  10. मस्तिष्क को बर्फ पर बैठे पेट्री डिश में रखें और किसी भी शेष खोपड़ी या अन्य मलबे को हटा दें।
  11. माइक्रोस्पटुला का उपयोग करके, धीरे-धीरे मस्तिष्क मैट्रिक्स में मस्तिष्क मैट्रिक्स में पृष्ठीय पक्ष के साथ रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए समय निकालें कि यह मैट्रिक्स में स्तर निर्धारित है, खासकर कि मिडलाइन मैट्रिक्स में केंद्र गिरता है। यह मैट्रिक्स वयस्क माउस मस्तिष्क ऊतक के लिए डिज़ाइन किया गया है, छोटे या रोगग्रस्त जानवरों से ऊतक मैट्रिक्स में कम आराम कर सकते हैं लेकिन नमूनों में प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करना अभी भी संभव होना चाहिए।
  12. एक रेजर ब्लेड को सागिटल मिडलाइन के साथ रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि ब्लेड मैट्रिक्स(चित्रा 1B)के नीचे सभी तरह से धक्का देता है।
  13. पहले ब्लेड(चित्रा 1B)के किनारे पर एक और रेजर ब्लेड 1 मिमी रखें। एक दूसरे के अलावा दो और ब्लेड 1 मिमी रखें। अंतिम परिणाम तीन ब्लेड मस्तिष्क के एक तरफ रखा जाना चाहिए, सभी 1mm के अलावा । दूसरी तरफ भी ऐसा ही करें। कुल मिलाकर, 7 ब्लेड 1mm के अलावा रखा जाएगा(चित्रा 1C)
  14. ध्यान से, रेजर ब्लेड के सामने और पीछे के सिरों को पकड़ें और सीधे मैट्रिक्स से बाहर उठाएं। रेजर ब्लेड के बाहर के ऊतकों को छोड़ दिया जा सकता है।
  15. धीरे-धीरे, दूसरों से एक समय में एक रेजर ब्लेड अलग करें, ऊतक वर्गों को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
  16. ध्यान से टिश्यू सेक्शन को रेजर ब्लेड से दूर और माइक्रोस्पटुला के साथ ग्लास स्लाइड पर स्लाइड करें। कुल मिलाकर छह सैगिटल ब्रेन सेक्शन(चित्रा 1D)होंगे ।
  17. 4 सबसे पार्श्व वर्गों में DCN दृश्यमान (बैंगनी बॉक्स, चित्रा 1D)होगा। DCN को अलग करने के लिए, छंटनी की गई 200 माइक्रोल पिपेट टिप को डीसीएन पर लंबवत रखें और ऊतक के माध्यम से दृढ़ता से नीचे धकेलें, सभी दिशाओं में कमाल करके डीसीएन को आसपास के ऊतकों से पूरी तरह से विच्छेदन करें। सीधे वापस ऊपर लिफ्ट सफाई से DCN को हटाने के लिए, और नेत्रहीन टिप में ऊतक की उपस्थिति की पुष्टि करें ।
  18. टिप के शीर्ष पर एक उंगली रखें और नीचे धक्का, ऊतक बाहर उभार के कारण । टिप को सही ढंग से लेबल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में रखें और सुनिश्चित करें कि ऊतक पंच ट्यूब के नीचे रखा गया है। शेष तीन वर्गों के लिए 2.17 दोहराएं, एक ही ट्यूब में डीसीएन घूंसे रखें। फ्लैश फ्रीज करने के लिए ट्यूब को तरल नाइट्रोजन में रखें। चित्रा 1Eमें प्रत्येक पंच के आकार का प्रतिनिधित्व ।
  19. जिन वर्गों में डीसीएन निकाले गए थे, वे सेरिबेलर गोलार्द्ध के रूप में अर्हता प्राप्त करते हैं। इन वर्गों में सेरिबैलम के चारों ओर मस्तिष्क के ऊतकों के बाकी हिस्सों को दूर रखें। कुंद संदंश का उपयोग करें और धीरे से इन गोलार्द्ध सेरिबेलर प्रांतस्था वर्गों को लेने और संबंधित माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जगह है । फ्लैश फ्रीज।
  20. पिछले दो वर्माल वर्गों (हल्के नीले बॉक्स, चित्रा 1D) केलिए, केवल सेरिबैलम छोड़ने वाले मस्तिष्क ऊतक के आसपास को धक्का दें। एक रेजर ब्लेड का उपयोग करना, पीछे के लोबुल से पूर्वकाल लोबुल को अलग करने के लिए एक कट बनाएं। कट लोबुल 6 के गठन के ठीक बाद होना चाहिए और इसमें लोबुल 10(चित्रा 1F)शामिल नहीं होना चाहिए।
  21. कुंद संदंश का उपयोग करके, ध्यान से पूर्वकाल सेरिबेलर कॉर्टेक्स वर्गों और पीछे के सेरिबेलर कॉर्टेक्स वर्गों को उनके संबंधित माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में रखें और 5 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों को छोड़कर फ्लैश फ्रीज करें। यहां से आरएनए निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें, या ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर सकते हैं।

3. आरएनए निष्कर्षण

नोट: इस प्रोटोकॉल TRIzol20के साथ आरएनए निष्कर्षण के लिए कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है । TRIzol जैविक सामग्री को घुलनशील बनाता है, जिससे आरएनए निकालना संभव हो जाता है।

  1. बर्फ में माइक्रोफ्यूज ट्यूब रखें टिश्यू को बहुत जल्दी विगलन से रखने के लिए माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 150 माइक्रोल कोल्ड ट्राइजोल लगाएं। एक निष्फल मूसल के साथ समरूप। एक बार ऊतक समरूप है, समाधान ऊपर और नीचे पाइप को सुनिश्चित करने के लिए वहां कोई शेष ऊतक बरकरार है । इसके अलावा किसी भी छोटे ऊतक टुकड़े को एक इंसुलिन सिरिंज में कई बार खींच कर तोड़ ।
  2. TRIzol के एक और 350 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप। 5 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर बैठो।
  3. ट्यूब में क्लोरोफॉर्म के 150 माइक्रोन जोड़ें और सख्ती से हिलाएं और फिर 2-3 मिनट के लिए आराम करें। क्लोरोफॉर्म समरूप ऊतक समाधान को चरणों (आरएनए, डीएनए और प्रोटीन) में अलग करता है।
  4. 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, 15 डिग्री सेल्सियस पर, 10 मिनट के लिए। सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूब एक ही अभिविन्यास पर हैं।
  5. ध्यान से ट्यूबों को हटा दें और अपकेंद्रित्र के तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। एक नई ट्यूब में केवल स्पष्ट जलीय चरण निकालें (यह आरएनए है), अपारदर्शी इंटरफेज (डीएनए) को बाधित न करने के लिए सावधान रहें।  सबसे कम चरण लाल होगा और इसमें प्रोटीन होगा। ट्यूबों में शेष समाधान को बचाया या छोड़ा जा सकता है।
  6. 1:2 अनुपात में 100% आइसोप्रोपिल अल्कोहल जोड़ें (यदि जलीय चरण के 200 उल को हटा दिया जाता है, तो आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 100 माइक्रोन जोड़ें)। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आराम करते हैं। आइसोप्रोपिल अल्कोहल आरएनए को समाधान से बाहर निकालता है।
  7. 10 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर, 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सभी ट्यूबों को एक ही अभिविन्यास पर रखना सुनिश्चित करें ताकि गोली की कल्पना करना आसान हो सके। परिणामस्वरूप गोली निकाला आरएनए होगा।
  8. ध्यान से ट्यूबों को हटा दें, एक पिपेट के साथ सुपरनैंट को हटा दें जो सावधानी बरतें कि गोली को बाधित न करें। गोली कुछ हद तक जेल की तरह है और देखने के लिए मुश्किल हो जाएगा, लेकिन अनुमान लगाने में सक्षम होना चाहिए, जहां यह अपकेंद्रित्र में ट्यूबों के अभिविन्यास पर आधारित है ।
  9. सभी सुपरनेट को हटाने के बाद, 5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल, भंवर संक्षेप में, और 7500 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र जोड़ें। इथेनॉल आगे गोली धोता है।
  10. गोली को बाधित किए बिना, सुपरनेट को ध्यान से हटा दें। नमूना सूखने के लिए टोपियां खुली छोड़ दें। यह आमतौर पर 5-10 मिनट लेता है, लेकिन कितना इथेनॉल गोली पर छोड़ दिया गया था पर निर्भर करता है भिंन हो सकते हैं । अधिक सूखी मत करो।
  11. एक बार सूखने के बाद, गोली को DNase मुक्त पानी में फिर से खर्च करें। डीसीएन के लिए नमूनों में 20 माइक्रोन जोड़ें, और अन्य सभी के लिए 30 माइक्रोन जोड़ें।
  12. एक बार फिर से निलंबित होने के बाद, नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या आगे परीक्षण के लिए आगे बढ़ना हो सकता है।

4. रियल टाइम क्वांटिटेटिव पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटीक्यूपीसीआर)

  1. इस कदम से पहले किसी भी जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए आरएनए का इलाज करना आवश्यक होगा, और बायोराड से आईस्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए सीडीएनए उत्पन्न करना होगा। सीडीएनए बनाने से पहले आरएनए की एकाग्रता को सामान्य करना सुनिश्चित करें। इसके अलावा, क्यूपीसीआर के लिए प्राइमर को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। इस चरण21को पूरा करने के लिए यहां वर्णित तरीकों का पालन करें । नीचे दिए गए क्यूपीसीआर का संक्षिप्त विवरण।
  2. प्राइमर सभी आईडीटी से खरीदे जाते हैं। आगे और रिवर्स दृश्यों दोनों एक ही नमूना ट्यूब में हैं, और 20x एकाग्रता पर संग्रहीत ।
    Rps18 (नियंत्रण जीन):
    फॉरवर्ड - 5'-सीसीटीगागॉटसीसीसीएकैट-3'
    रिवर्स - 5'-ACACCACATGAGCATATCC-3'
    परवलबुमिन (कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन, निरोधात्मक कोशिकाएं):
    फॉरवर्ड - '5-ATGAGGAGAAGAGGTTTCCCC-3'
    रिवर्स - '5-AGCGTCTTTTTTTTAGCAG-3'
    Kcng4 (पोटेशियम चैनल सबयूनिट):
    फॉरवर्ड - 5'-CTGTCTTTTTTTCCCTCAGTGA-3'
    रिवर्स - 5'-GCATTGCCTCACTGTCAG-3'
    एल्डोलेज सी (ज़ेब्रिन II, अलग-अलग सेरिबेलर कॉर्टेक्स में व्यक्त किया गया):
    फॉरवर्ड - 5'-AGAGGAGAAGAAGAATAATATGCTG-3'
    रिवर्स - 5'-TCAGTAGGCATGGGGC-3'
  3. क्यूपीसीआर की स्थितियां इस प्रकार थीं। पूर्व इनक्यूबेशन अवधि, 5 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर। प्रवर्धन अवधि, 50 चक्र: 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 62 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट। पिघलने वक्र अवधि, 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 सेकंड, 65 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट, और 97 डिग्री सेल्सियस के लक्ष्य अस्थायी तक .07 डिग्री सेल्सियस/सेकंड के लिए रैंप दर निर्धारित की है । फिर 10 मिनट से 40 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा अवधि।  सभी क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं को ट्रिपलीकेट में किया गया था और जीन अभिव्यक्ति को सामान्य बनाने के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में आरपीएस 18 के साथ 2- ΤΤCt का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। थोक सेरिबेलर अर्क का उपयोग संदर्भ के रूप में किया जाता था।

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Representative Results

इन प्रयोगों के लिए चार ग्यारह सप्ताह पुरानी मादा वाइल्ड टाइप C57/Black6 चूहों का इस्तेमाल किया गया । एक माउस का उपयोग पूर्ण सेरिबेलर विच्छेदन का संचालन करने के लिए किया जाता था जिसे 'थोक सेरिबैलम' के रूप में जाना जाता है और विच्छेदन क्षेत्रों में आरएनए स्तरों की तुलना पूर्ण विच्छेदन के लिए अनुमति दी जाती है। अन्य तीन चूहों का उपयोग इस प्रोटोकॉल में वर्णित सेरिबेलर विच्छेदन का संचालन करने के लिए किया गया था। तीन चूहों का उपयोग करने से यह सुनिश्चित करना संभव हो जाता है कि आरएनए के स्तर में पाए गए रुझान चूहों में प्रजनन योग्य हैं।

चित्रा 1A माउस सेरिबैलम का प्रतिनिधित्व करता है - नीले रंग में वर्मिस और पीले रंग में गोलार्द्ध। वर्मिस (गहरे नीले रंग में पूर्वकाल क्षेत्र, हल्के नीले रंग में पीछे के क्षेत्र) और गोलार्द्ध (पीले रंग में) के धनु योजनाबद्धताएं। डीसीएन को लाल बिंदीदार बक्से में हाइलाइट किया गया है। एक सफल विच्छेदन मस्तिष्क के मिडलाइन(चित्रा 1B)के नीचे प्रारंभिक रेजर ब्लेड प्लेसमेंट के साथ शुरू होगा; यह निम्नलिखित छह ब्लेड(चित्रा 1C)के सफल प्लेसमेंट का मार्गदर्शन करता है। यह छह sagittal वर्गों(चित्रा 1D),चार पार्श्व/गोलार्द्ध वर्गों (बैंगनी में उल्लिखित) और दो मिडलाइन/vermal वर्गों (हल्के नीले रंग में उल्लिखित) छोड़ देता है । 4 पार्श्व खंडों में डीसीएन होता है; चित्रा 1E एक सफल डीसीएन पंच विच्छेदन दर्शाया गया है। मिडलाइन वर्माल अनुभागों में सबसे अधिक मध्याह्न डीसीएन का आधा हिस्सा होगा जो 1 मिमी मोटी अनुभाग में मौजूद है, हालांकि यह सभी तरह से मौजूद नहीं होगा और पुन: पेश करने के लिए संभव नहीं है। मिडलाइन वर्ल वर्गों को चित्रा 1Fमें दर्शाए गए पूर्वकाल और पीछे के लोबुलों में अलग किया जाता है। एक सफल विच्छेदन सफलता के लिए बाकी प्रयोगों को सेट करता है।

वास्तविक समय गुणात्मक पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (RTqPCR) परिणाम प्रत्येक क्षेत्र के जीन अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं और साथ ही विच्छेदन को मान्य करने की सेवा करते हैं। हमने ऐसे जीन का पता लगाने वाले प्राइमर का उपयोग किया जो डीसीएन में पूर्वकाल से पीछे के सेरिबेलर कॉर्टेक्स और संवर्धन तक ढाल अभिव्यक्ति दिखाते हैं और उनकी अभिव्यक्ति की तुलना थोक सेरिबेलर लिसेट्स से करते हैं।

हमने तीन जीनों के अभिव्यक्ति स्तर का आकलन किया: एल्डोलेज सी, परवलबुमिन और केकांग4। एल्डोलेज सी, जिसे ज़ेब्रिन II के नाम से भी जाना जाता है, एक एंजाइम है जिसे सेरिबैलम के माध्यम से लगातार बैंडिंग पैटर्न में व्यक्त किया जाता है। यह पूर्वकाल वर्मिस की तुलना में पीछे के वर्मिस में अधिक व्यक्त किया जाता है। 13 , 14गोलार्द्धों में बैंड भी हैं . परवलबुमिन जो कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन होता है जो निरोधात्मक कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। एलन ब्रेन एटलस के आधार पर, पैरालबुमिन अपेक्षाकृत समान रूप से सेरिबेलर प्रांतस्था में और डीसीएन (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056) में व्यक्त किया गया लगता है। Kcng4, एक पोटेशियम वोल्टेज gated चैनल सबयूनिट, डीसीएन में और पूर्वकाल में पीछे पालि (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576) की तुलना में समृद्ध प्रतीत होता है । मात्रात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला है कि, जैसा कि उम्मीद थी, एल्डोलेज सी को पीछे के सेरिबेलर वर्मिस (सीसीपीवी) में अधिक व्यक्त किया जाता है, लेकिन थोक सेरिबेलर विच्छेदन(चित्रा 2 ए)की तुलना में डीसीएन और वर्मिस (सीसीएवी) के पूर्ववर्ती क्षेत्र में कम होता है। परवलबुमिन इसी तरह डीसीएन, पूर्वकाल वर्मिस, पीछे के वर्मिस और गोलार्द्ध सेरिबेलर कॉर्टिस में मौजूद है जैसा कि थोक सेरिबेलर अर्क(चित्रा 2B)में होता है। Kcng4 काफी DCN और पूर्वकाल vermis (CCaV) में समृद्ध है और यह काफी पीछे vermis (CCpV) या गोलार्द्धों (CCH) में समृद्ध नहीं है जब थोक निष्कर्षण(चित्रा 2C)की तुलना में । यह परिणाम एलन ब्रेन एटलस में देखे गए पैटर्न के आधार पर क्या उम्मीद की गई थी। इस प्रकार, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण विच्छेदन प्रोटोकॉल को मान्य करता है और पुष्टि करता है कि अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए को प्राप्त और परीक्षण किया जा सकता है।

सीधे सेरिबेलर प्रांतस्था भर में एल्डोलेज सी की अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए, अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना की गई जहां इसे सबसे कम माना जाता है, पूर्वकाल वर्मिस (सीसीएवी)(चित्रा 3)। एल्डोलेज सी का अभिव्यक्ति स्तर पीछे के वर्मिस (सीसीपीवी) में काफी अधिक था, और सेरिबेलर गोलार्द्धों (सीसीएच) में अधिक रुझान था, हालांकि काफी महत्वपूर्ण नहीं था। सेरिबेलर गोलार्द्धों में यह प्रवृत्ति होने की संभावना है क्योंकि गोलार्द्धों में एल्डोलेज सी के बैंड हैं, और विच्छेदन एल्डोलेज नकारात्मक और सकारात्मक बैंड को कैप्चर करता है।

Figure 1
चित्रा 1:सेरिबेलर विच्छेदन के प्रतिनिधि चित्र 
A. पीले रंग में नीले और गोलार्द्धों में वर्मिस के साथ माउस सेरिबैलम का योजनाबद्ध। वर्मिस और गोलार्द्ध दोनों के धनु सेरिबेलर योजनाएं। Vermis नीले रंग में है, गहरे नीले रंग के साथ पूर्वकाल vermis अंकन, और हल्के नीले अंकन पीछे vermis । पीले रंग में गोलार्द्ध। डीसीएन को लाल-बिंदीदार बक्से के साथ प्रत्येक में चिह्नित किया जाता है। B. सागिटल माउस ब्रेन मैट्रिक्स में पूर्ण मस्तिष्क, मिडलाइन नीचे रेजर ब्लेड के साथ। सी. मिडलाइन के दोनों ओर तीन रेजर ब्लेड 1 मिमी अलग का प्लेसमेंट। डी. जिसके परिणामस्वरूप छह sagittal मस्तिष्क वर्गों। चार पार्श्व/गोलार्द्ध सेरिबेलर वर्गों (शीर्ष चार बैंगनी में उल्लिखित छवियों) होते हैं । दो मध्याख्वाद/वरमाल सेरिबेलर वर्गों (नीचे दो छवियों, हल्के नीले रंग में उल्लिखित) होते हैं । ई. डीसीएन पंच के साथ प्रतिनिधि पार्श्व/गोलार्द्ध सेरिबेलर अनुभाग अनुभाग के दाईं ओर विच्छेदित (चित्र 1 डीमें गुलाबी रंग में उल्लिखित अनुभाग)। एफ.  चित्रा 1डी में सेरिबेलर अनुभाग इसके चारों ओर स्क्वायर बिंदीदार फ़िरोइस के साथ, पूर्वकाल और पीछे के वर्माल लोबुल में विच्छेदित हो गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:सेरिबैलम के अलग-अलग विशिष्ट क्षेत्रों में सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति।
एल्डोलेज सी(2 ए),परवलबुमिन(2बी)और केसीएनजी4 (2सी)की सापेक्ष अभिव्यक्ति आरपीएस 18 (सभी कोशिकाओं में व्यक्त रिबोसोमल आरएनए से जुड़े प्रोटीन) को सामान्य बनाया गया है, और एक संदर्भ के रूप में थोक सेरिबेलर अर्क का उपयोग करना। जैसा कि अपेक्षित था, पीछे के वर्मिस में एल्डोलेज सी अभिव्यक्ति अधिक थी और डीसीएन और पूर्वकाल वर्मिस(2 ए)में कम थी। जैसा कि उम्मीद थी, एलन ब्रेन एटलस के आधार पर, प्रत्येक निकाले गए क्षेत्र में पैरालबुमिन अभिव्यक्ति समान रूप से व्यक्त की जाती है, जबकि केसीएन 4 अभिव्यक्ति डीसीएन और सीसीएवी में काफी समृद्ध है। एक तरह से ANOVA, एक Tukey पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ । * पी<.0.005, ** पी<.0.0001 थोक सेरिबेलर निकालने के सापेक्ष। हिस्टोग्राम डॉट्स के रूप में दिखाए गए प्रत्येक व्यक्तिगत माउस के लिए मूल्यों के साथ एन = 3 के लिए औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । डीसीएन (डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी), सीसीएवी (पूर्वकाल वर्मिस का सेरिबेलर कॉर्टेक्स), सीसीपीवी (पीछे के वर्मिस का सेरिबेलर कॉर्टेक्स), और सीसीएच (गोलार्द्धों का सेरिबेलर कॉर्टेक्स)। सेरिबेलर विच्छेदन क्षेत्रों के लिए एन = 3 चूहे। N= 1 थोक निकालने। ट्रिपलकेट में किया गया प्रयोग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:सेरिबेलर कॉर्टेक्स में एल्डोलेज सी की RTqPCR सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति
सेरिबेलर कॉर्टेक्स के विशिष्ट क्षेत्रों में एल्डोलेज सी की सापेक्ष अभिव्यक्ति - पूर्वकाल वर्मिस (सीसीएवी), पीछे वर्मिस (सीसीपीवी), और गोलार्द्ध (सीसीएच)। एल्डोलेज सी के जीन अभिव्यक्ति स्तर को आरपीएस 18 में सामान्यीकृत किया गया था और पूर्वकाल वर्मिस में अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में। जैसा कि उम्मीद की गई एल्डोलेज सी अभिव्यक्ति पीछे के वर्मिस में समृद्ध थी। एक तरह से ANOVA, एक Tukey पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ । * पी<.0.005 CCaV के सापेक्ष। त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । सीसीएवी (पूर्वकाल वर्मिस का सेरिबेलर कॉर्टेक्स), सीसीपीवी (पीछे के वर्मिस का सेरिबेलर कॉर्टेक्स), और सीसीएच (गोलार्द्धों का सेरिबेलर कॉर्टेक्स)। N = 3 चूहों, प्रयोग ट्रिपलिकेट में किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित विधि चार अलग-अलग सेरिबेलर क्षेत्रों के भीतर अंतर्निहित जीन अभिव्यक्ति और आणविक तंत्र का आकलन करना संभव बनाती है - डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन), वर्मिस (सीसीएवी) के पूर्वकाल सेरिबेलर कॉर्टेक्स, वर्मिस (सीसीपीवी) के पीछे के सेरिबेलर कॉर्टेक्स, और गोलार्द्धों (सीसीएच) के सेरिबेलर कॉर्टेक्स। इन क्षेत्रों का अलग से आकलन करने की क्षमता विशिष्ट सेरिबेलर क्षेत्रों की विषमता के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार करेगी और संभवतः विभिन्न व्यवहारों में उनके योगदान पर प्रकाश डाला जाएगा ।

पूर्ण मस्तिष्क ऊतक sagittally खंडित करके यह आसानी से कल्पना और सेरिबैलम के इन चार क्षेत्रों की पहचान करने के लिए संभव है, एक त्वरित विच्छेदन के लिए अनुमति देता है । लेखक के ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए यह आणविक विश्लेषण के लिए पूर्ण सेरिबेलर क्षेत्रीय विच्छेदन का पहला वर्णन है। हाल ही में प्रकाशित एक पत्र में, शोधकर्ताओं ने सेरिबैलम के पूर्वकाल लोबुल और आणविक विश्लेषण22के लिए सेरिबैलम के नोड्यूलर लोबुल के थोक विच्छेदन का उपयोग किया। हालांकि, वर्णित विधि के साथ वे डीसीएन को भी विच्छेदन नहीं कर पाएंगे। 300um मोटी स्लाइस में कटौती करने के लिए एक कंपन का उपयोग कर DCN घूंसे अलग करने के प्रयास आमतौर पर तीन महत्वपूर्ण समस्याओं में चलाते हैं । सबसे पहले, सेरेबेला के बढ़ते और जिस कोण पर ऊतक काटा जाता है, में मामूली अंतर के कारण, जानवरों में एक ही क्षेत्रों को पुन: उत्पन्न करना आसान नहीं है। दूसरा, बढ़ते और टुकड़ा करने की क्रिया में समय लगता है, आरएनए क्षरण की संभावना बढ़ रही है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आरएनए नमूने की गुणवत्ता कम हो रही है । अंत में, 300um मोटी स्लाइस से घूंसे आरएनए की कम उपज का उत्पादन ।

यहां दिखाए गए आंकड़ों से पता चलता है कि सेरिबेलर क्षेत्रों में सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करना संभव है । एल्डोलेज सी को सीसीपीवी में अत्यधिक उपनियमित किया जाता है। Kcng4 डीसीएन और सीसीएवी में अत्यधिक उपविनियमित है, और सेरिबैलम में सभी क्षेत्रों में पैराल्बुमिन अपेक्षाकृत समान रूप से व्यक्त किया जाता है। हालांकि ये केवल तीन जीन हैं, इन परिणामों से पता चलता है कि इस विच्छेदन विधि का उपयोग इन विशिष्ट क्षेत्रों के अंतर्निहित आणविक हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के दौरान ध्यान देने के लिए कुछ महत्वपूर्ण चीजें हैं। मैट्रिक्स में मस्तिष्क की स्थिति एक महत्वपूर्ण कदम है। कुछ मामलों में, मस्तिष्क मैट्रिक्स में या बिल्कुल मिडलाइन पर पूरी तरह से स्तर निर्धारित नहीं किया गया हो सकता है। यह स्पष्ट हो जाएगा जब प्रत्येक sagittal वर्गों को देख रहे हैं । उदाहरण के लिए, यदि मिडलाइन पर बिल्कुल कटौती की जाए, तो सबसे मध्यावधि सेरिबेलर अनुभाग लगभग समान दिखेंगे और इसमें कोई डीसीएन दिखाई नहीं देगा। क्योंकि इन स्थलों आंख से पहचाने जाते हैं यह समस्या निवारण करने के लिए कितने वर्गों vermal या गोलार्द्ध वर्गों के रूप में अर्हता प्राप्त करने के लिए संभव है, और वे एक ही माइक्रोफेज ट्यूब में एक साथ जोड़ा जा सकता है । एक और महत्वपूर्ण कदम डीसीएन की निकासी है । कुछ उदाहरणों में, 200 माइक्रोल पिपेट टिप के शीर्ष पर उंगली को निराशाजनक ऊतक पंच निकालने के लिए पर्याप्त दबाव नहीं है। यदि यह स्थिति है, तो सुई नाक संदंश के साथ पंच को स्कूप करना और पंच को सही ट्यूब में रखना आवश्यक होगा। इस प्रोटोकॉल का अगला महत्वपूर्ण कदम आरएनए निष्कर्षण है। जबकि सूचीबद्ध वॉल्यूम को अधिकतम आरएनए निष्कर्षण के लिए अनुकूलित किया गया है, प्रयोगशाला की व्यक्तिगत जरूरतों को पूरा करने के लिए आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल में समाधान की मात्रा को समायोजित करना भी आवश्यक हो सकता है। क्योंकि वहां थोड़ा ऊतक के साथ काम करने के लिए है, वहां अंतिम आरएनए उत्पाद में फिनोल संदूषण की एक उच्च संभावना है । यह ऊतक समरूप करने के लिए इस्तेमाल किया TRIzol की मात्रा को समायोजित करने और यह सुनिश्चित करना है कि समरूप ऊतक अच्छी तरह से मिलाया जाता है द्वारा प्रबंधित किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं कि जबकि डीसीएन को तीन अलग-अलग नाभिक (पार्श्व, इंटरपोस्ड और मध्यवर्ती) में विभाजित किया जाता है, 1 मिमी वर्गों में से प्रत्येक को कल्पना करना और पुन: पेश करना मुश्किल है, अकेले पर्याप्त ऊतक हैं जिनसे आरएनए निकालने के लिए। इस सीमा के साथ, सबसे मध्य एसएल डीसीएन का आधा वर्मिस में दिखाई देता है; हालांकि, इस विच्छेदन के साथ कल्पना करना और पुन: उत्पन्न करना मुश्किल है। जैसा कि प्रोटोकॉल वर्तमान में है, मध्याह्न डीसीएन के अन्य आधे और शेष डीसीएन को विच्छेदित किया जाता है। गोलार्द्धों में दस व्यक्तिगत वर्ल लोबुल और आठ लोबुल भी हैं, लेकिन इनमें से प्रत्येक को व्यक्तिगत रूप से और प्रजनन तरीके से विच्छेदन करना मुश्किल होगा और बहुत कम आरएनए एकाग्रता पैदावार का कारण बनेगा। हालांकि यह विधि सेरिबैलम के क्षेत्रों में अधिक विशेष रूप से तल्लीन करना संभव बनाती है, यह अभी भी अलग-अलग शारीरिक क्षेत्रों को समूहों में जोड़ती है जो व्यक्तिगत लोबुल या उप-lobule इकाइयों के स्तर पर अद्वितीय परिवर्तनों को मास्किंग कर सकते हैं।

अंत में, यह विधि एक साथ क्षेत्रीय आणविक मतभेदों को सेरिबैलम के चार विशिष्ट क्षेत्रों का पता लगाना संभव बनाती है। इस क्षेत्र-विशिष्ट तरीके से सेरिबैलम का आकलन करके, अंतर्निहित आणविक तंत्र और जीन अभिव्यक्ति को अलग करना संभव है जो उन क्षेत्रों की विशेषता है । यह आगे की भूमिका है कि अलग cerebellar क्षेत्रों अलग व्यवहार में खेलते है और भविष्य के काम के लिए एक cerebellar क्षेत्र में विशेष रूप से ध्यान केंद्रित करने और रोग या लक्ष्य उपचार में अपनी भूमिका का पता लगाने के लिए अनुमति देते है की हमारी समझ होगी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम ऑस्टिन फेरो और Juao-Guilherme रोजा के लिए Cvetanovic प्रयोगशाला में उनकी मदद के लिए विच्छेदन और आरएनए निष्कर्षण और RTqPCR में उनकी मदद के लिए आभारी हैं । इस शोध को एम Cvetanovic, R01 NS197387 द्वारा वित्त पोषित किया जाता है; एचएचएस | राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 Microcentrifuge tubes ThermoScietific 3456
100% Isopropyl Alcohol VWR Life sciences 1106C361
200 ul Pipet tips GeneMate P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal Kent Scientific Corporation RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform Macron 220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol Pharmco 111000200
Glass Slide (for electrophoresis) BIORAD
Homogenizer Kimble 6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml) BD 329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR BIORAD 1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C IDT Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4 IDT Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin IDT Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18  IDT Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles FisherScientific 12141364
TRIzol Reagent Ambion by Life technologies 15596018
Vascular Scissors

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References

  1. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  2. Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
  3. Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
  4. Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
  5. Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
  6. King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
  7. Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
  8. Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
  9. Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
  10. Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
  11. Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
  12. Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
  13. Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
  14. Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
  15. Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
  16. Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
  17. Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
  18. Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
  19. Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
  20. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  21. Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
  22. Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).

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न्यूरोसाइंस अंक 166 सेरिबैलम क्षेत्रीयकरण डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी सेरिबेलर कॉर्टेक्स आरएनए आरटीक्यूपीसीआर
आणविक विश्लेषण के लिए सेरिबेलर क्षेत्रीय विच्छेदन
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Hamel, K. A., Cvetanovic, M.More

Hamel, K. A., Cvetanovic, M. Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis. J. Vis. Exp. (166), e61922, doi:10.3791/61922 (2020).

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