Summary
다른 소뇌 영역은 뚜렷한 행동 출력에 있는 역할을 하기 위하여 연루되었습니다, 그러나 근본적인 분자 기계장치는 알려지지 않은 남아 있습니다. 이 작품은 RNA를 분리하고 유전자 발현의 차이를 테스트하여 분자 차이를 조사하기 위해 반구, 전방 및 후방 영역 및 깊은 소뇌 핵의 소뇌 피질을 재현하고 신속하게 해부하는 방법을 설명합니다.
Abstract
소뇌는 운동, 균형, 인식, 보상 및 영향을 제어하는 등 여러 가지 주요 기능에서 중요한 역할을합니다. 이미징 연구는 뚜렷한 소뇌 부위가 이러한 다른 기능에 기여한다는 것을 나타냅니다. 지역 소뇌 차이를 검사하는 분자 연구는 주로 전체 소뇌 추출물에서 수행되어 특정 소뇌 부위에 걸쳐 구별을 마스킹하기 때문에 뒤쳐지고 있습니다. 여기에서 우리는 4개의 다른 소뇌 지역: 깊은 소뇌 핵 (DCN), 전방 및 후방 버피소 피질, 그리고 반구의 소뇌 피질의 4개의 다른 소뇌 지구를 재보적으로 그리고 빨리 해부하는 기술을 기술합니다. 이러한 뚜렷한 영역을 해부하면 균형, 운동, 영향 및 인식에 대한 독특한 기여의 기초가 될 수 있는 분자 메커니즘의 탐사를 허용합니다. 이 기술은 또한 각종 마우스 질병 모형을 통해 이 특정 지역의 병리학 감수성에 있는 다름을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
소뇌는 뇌의 뉴런의 절반 이상을 포함하고 역사적으로 뇌1의모터 제어 및 균형 센터로 언급되었습니다. 최근에는 소뇌가 인지, 보상 처리,2,3,4,5에영향을 미치는 등 다양한 기능에서 핵심적인 역할을 한다는 것을입증했습니다.
소뇌는 잘 설명 된 해부학을 가지고 : 피질 영역은 과립, Purkinje, 및 분자 층으로 구성되어 있습니다. 과립 세포는 과립 세포 층을 형성하고 열등한 올리브에서 유래한 등반 섬유로부터 입력을 받는 분자 층의 Purkinje 세포 모순자로 병렬 섬유를 통해 입력을 보냅니다. Purkinje 세포는 소뇌에서 주요 출력역할을 깊은 소뇌 핵 (DCN)에서 세포에 억제 프로젝션을 보냅니다. 이러한 소뇌 회로의 출력은 골기, 스텔레이트 및 바구니세포(4)를포함하는 소뇌 피질내의 억제 중뉴런의 활성에 의해 더 변조된다. 이 소뇌 기능 단위는 소뇌 피질의 모든 소구에 걸쳐 분포된다. 소뇌에 걸쳐이 상대적으로 균일 한 회로에도 불구하고, 인간의 신경 이미징 문헌 및 환자 연구에서 증거는소뇌의기능이질성을 나타냅니다6,7.
소뇌 피질은 두 가지 주요 영역으로 나눌 수 있습니다: 중간선 정의 된 vermis, 및 측면 반구. vermis는 전방 및 후방 소구로 더 나눌 수 있습니다. 소뇌의 이 명백한 지구는 다른 행동에 기여에 연루되었습니다. 태스크 호출 또는 작업 없는 활동 패턴은 vermis의 전방 영역이 모터 기능에 더 많이 기여하는 반면 후방 vermis는 인식6,7에더 많은 기여를 한다는 것을 암시합니다. vermis는 또한 영향과 감정과 연결되어 있으며, 소뇌 반구는 집행, 시각 공간, 언어 및 기타 mnemonic 함수8에기여합니다. 또한, 해부학 연구는 기능적으로 뚜렷한 소뇌 영역이 다른 피질영역9과연결되어 있다는 증거를 제공했다. 병변 증상 매핑은 전방 비골 (소두 VI로 확장)에 영향을 미치는 뇌졸중환자가 미세 운동 작업에 대한 성능이 좋지 않은 반면, 후방 엽 영역 및 반구에 손상을 입은 환자는 소뇌 운동 증후군10의부재시 인지 적자를 나타냈다는 것을 밝혔다. 마지막으로, 질병의 지역 소뇌 병리학은 기능적으로 뚜렷한 소뇌 부위가질병(11,12)에다르게 취약하다는 것을 나타낸다.
훨씬 덜 탐구하는 동안, 예비 기록은 소뇌 피질 지구에 걸쳐 명백한 유전자 발현 서명을 보여줍니다. 제브린 II의 Purkinje 세포 발현은 후방 로두에 더 많은 제브린 II 양성 세포가 있고 전방외구(13)에서더 적은 수 있도록 vermis에서 영역 특정 패터닝을 나타낸다. 이것은 또한 Zebrin II 음성 Purkinje 세포가 Zebrin II 양성14인Purkinje 세포 보다는 강장성 발사의 더 높은 주파수를 표시하기 때문에 지역적으로 명백한 생리기능과 상관관계가 있습니다.
소뇌 피질 이외에, 소뇌는 소뇌에 대한 1 차적인 출력으로 봉사하는 깊은 소뇌 핵 (DCN)을 포함합니다. 핵은 내측 (MN), 중측 (IN), 및 측면 핵 (LN)으로 구성됩니다. 기능성 이미징 및 환자 연구는 DCN이 또한 다양한 행동에 참여하는 것으로 나타났습니다15,그러나 DCN에 있는 유전자 발현 변경을 검토하는 거의 연구 결과.
분자 기술의 어드밴스는 뇌의 지역 유전자 발현을 평가할 수 있게 되었으며 생리학적 및 질병상태(16)의다른 뇌 영역 을 가로질러 다른 뇌 영역 내에서 이질성을 발견했습니다. 이러한 연구는 소뇌가 다른 뇌 영역과 다르다는 것을 연루시합니다. 예를 들어, 신경교 세포에 대한 뉴런의 비율은 다른 뇌 영역1에비해 소뇌에서 반전된다. 정상적인 생리학적 조건에서도, 선동적인 유전자의 발현은 다른 뇌영역(17)에비해 소뇌에서 강화된다. 분자 기술은 또한 소뇌 질환의 발병에 기여하는 경로를 식별하는 데 매우 유용했습니다. 예를 들어, 전체 소뇌 추출물의 RNA 염기서열분석기는 야생형 대조군과 비교하여 퍼킨제 세포 특이적 형형 마우스 모델인 척추유발실래1(SCA1)에서 변경된 유전자를 확인하였다. 이러한 증거는 소뇌 Purkinje 세포에 있는 기체 발생의 근본적인 중요한 분자 통로를 제시하고 잠재적인 치료 표적18을확인하는 것을 도왔습니다. 그러나, 최근 연구는 소뇌 지역(11,12,19)에걸쳐 질병에 대한취약성에차이가 있음을 시사한다. 이것은 전체 소뇌 추출물로 가려지거나 발견되지 않을 수 있는 뚜렷한 소뇌 지역에서 일어나는 중요한 변경이 있다는 것을 나타낼 수 있었습니다. 따라서, 연구원이 다른 소뇌 지구에 있는 분자 단면도를 검토하는 것을 허용하는 기술을 개발할 필요가 있습니다.
여기에서 제안된 기술은 그 지구에서 RNA를 격리하고 유전자 발현에 있는 지역적 다름을 탐구하기 위하여 마우스 소뇌의 4개의 별개의 지구를 해부하는 재현가능한 방법을 기술합니다. 도 1A에서 마우스 소뇌의 회로도는 파란색의 vermis와 노란색의 반구를 강조합니다. 구체적으로, 이 기술은 4개의 영역을 격리할 수 있게 합니다: 깊은 소뇌 핵 (DCN) (도 1A에있는 빨간 점선 상자), 전방 버미스 (CCaV)의 소뇌 피질 (CCaV) (다크 블루) 도 1A에서),후방 버미스(CCpV)의 소뇌 피질(도 1A에서연한 파란색), 반구(CCH)의 소뇌 피질(도 1A에서노란색). 이 지구의 유전자 발현을 별도로 평가함으로써, 이 다른 지구의 이산 기능의 근본적인 분자 기계장치뿐만 아니라 질병에 있는 그들의 취약성에 있는 잠재적인 다름을 조사할 수 있을 것입니다.
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Protocol
1. 설정
- 참수 가위, 무딘 집게, 해부 가위, 혈관 가위, 미세 한 미세 한 마우스 뇌 매트릭스, 면도날, 200 μL 파이프 팁, 유리 페트리 접시, 유리 슬라이드 및 얼음 양동이를 포함한 필요한 장비를 수집합니다. 흡수 패드에 모든 장비를 배치합니다.
- 페트리 접시, 유리 접시, 뇌 매트릭스를 얼음 위에 놓습니다.
- 수직 각도에서 면도날을 사용하여 200 μL 파이프 팁 의 끝에서 약 5mm를 다듬습니다. 이것은 팁의 끝에 있는 개구부 크기를 약 1mm 너비로 만듭니다. 이것은 DCN을 펀치하기에 충분해야합니다. 그러나 이것은 또한 해부에 따라 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 쉽게 교체하고 조정할 수 있는 많은 팁을 준비하십시오.
- 동물 식별 및 소뇌 지역 (동물 당 4 개의 튜브)을 가진 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브를 라벨.
- 냉동 안전 용기를 액체 질소로 채우고 추출 후 조직을 플래시합니다.
2. 뇌 추출 및 해부
모든 실험은 미네소타 대학의 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.
- 5% CO2 노출을 사용하여 마우스를 안락사시합니다. 호흡이 중단되면 자궁 경부 탈구를 수행하십시오. 참수 가위로 마우스를 참수하고 적절한 소켓에서 시체를 폐기하십시오.
- 코에서 시작하여 다시 계속 머리의 내측 처진 라인을 따라 면도날로 절개를합니다. 피부를 분리하고 중간선의 양쪽으로 이별합니다. 면도날을 사용하여 양쪽의 근육을 잘라내고 외이도를 지나가세요.
- 해부 가위를 사용하여 뇌 줄기가 소뇌와 만나는 척수 영역을 다듬어 소뇌를 손상시키지 않도록주의하십시오.
- 혈관 가위 블레이드 중 하나를 뇌간과 척추 기둥 사이의 공간에 삽입하고 외이도쪽으로 잘라 내어 가위를 들어 올려 뼈를 깨끗하게 자르지만 조직에 손상을 제한합니다.
- 후각 전구쪽으로 두개골 가장자리를 따라 계속 자르고 뇌 조직의 손상을 제한하기 위해 절단하는 동안 계속 들어 올립니다.
- 무딘 집게를 사용하여 두개골 뒤쪽을 부드럽게 벗겨 내어 뇌와 소뇌의 후방 부위를 발견합니다.
- 방금 잘라낸 두개골 가장자리를 따라 무딘 집게를 사용하여 두개골의 나머지 부분을 뇌 위로 껍질을 벗깁니다. 이 단계는 두개골 모자의 대부분을 제거해야, 뇌를 공개.
- 혈관 가위와 무딘 집게로 두개골의 나머지 부분을 다듬어 뇌 의 상단에서 대부분의 두개골을 치우십시오.
- microspatula를 사용하여, 약간 두뇌를 들어 올리고 아래 를 떠서 나머지 두개골에서 후각 전구를 제거하고 광관 섬유를 분리합니다. 뇌는이 시점에서 쉽게 무료로 와야한다.
- 얼음 위에 앉아 있는 페트리 접시에 뇌를 넣고 남은 두개골이나 다른 파편을 제거합니다.
- microspatula를 사용하여, 부드럽게 등쪽 측으로 뇌 매트릭스에 뇌를 배치. 시간을 내어 행렬의 레벨이 설정되어 있는지, 특히 중간선이 행렬의 중심이 되는지 확인합니다. 이 매트릭스는 성인 마우스 뇌 조직을 위해 설계, 젊은 또는 병든 동물의 조직은 매트릭스에서 더 낮은 휴식을 취할 수 있지만 여전히 샘플에 걸쳐 재현 가능한 결과를 얻을 수 있어야합니다.
- 적중 한 미드라인을 따라 면도날 한 개를 놓고 블레이드가 매트릭스의 바닥까지 밀어넣도록한다(그림 1B).
- 첫 번째블레이드(그림 1B)의측면에 다른 면도날 1mm를 놓습니다. 두 개의 블레이드를 서로 1mm 더 놓습니다. 최종 결과는 뇌의 한쪽에 놓인 3개의 블레이드여야 하며, 모두 1mm 떨어져 있어야 합니다. 다른 쪽에서도 마찬가지입니다. 총 7개의 블레이드가 1mm 간격으로 배치됩니다(그림1C).
- 조심스럽게 면도날의 앞뒤 끝을 잡고 매트릭스에서 똑바로 들어 올립니다. 면도날 바깥쪽에 있는 조직을 폐기할 수 있습니다.
- 천천히, 다른 사람과 한 번에 하나의 면도날을 분리, 조직 섹션을 손상시키지 않도록주의.
- 조심스럽게 면도날의 조직 섹션을 밀어 마이크로 스patula와 유리 슬라이드에. 총 6개의 궁극의 뇌 단면도(그림1D)가있을 것이다.
- 4개의 가장 측면 섹션에 DCN이 표시됩니다(보라색 상자, 그림 1D). DCN을 격리하려면 다듬어진 200 μL 파이펫 팁을 DCN 을 수직으로 잡고 조직을 단단히 밀어 내고 모든 방향으로 흔들어 주변 조직에서 DCN을 완전히 해부합니다. DCN을 깨끗하게 제거하기 위해 똑바로 다시 들어 올리고 팁에 조직의 존재를 시각적으로 확인합니다.
- 한 손가락을 끝 의 상단에 놓고 아래로 밀어 내밀어 조직이 부풀어 오르게합니다. 팁을 올바르게 표지된 미세푸지 튜브에 넣고 조직 펀치가 튜브 바닥에 놓이도록 합니다. 나머지 세 섹션에 대해 2.17을 반복하여 DCN 펀치를 동일한 튜브에 배치합니다. 튜브를 액체 질소에 넣고 플래시를 고정합니다. 도 1E에서각 펀치의 크기를 표현합니다.
- DCN 추출 한 섹션은 소뇌 반구로 자격이 있습니다. 이 단면도에 있는 소뇌의 주위에 두뇌 조직의 나머지 부분을 밀어. 무딘 집게를 사용하고 부드럽게 이러한 반구 소뇌 피질 섹션을 선택하고 각각의 미세 분리 튜브에 배치합니다. 플래시 가 동결.
- 마지막 두 개의 상록 섹션 (밝은 파란색 상자, Figure1D)에대 한, 소뇌만 떠나 주변 뇌 조직을 멀리 밀어. 면도날을 사용하여 전방 소구를 후방 소반과 분리하는 절단을 합니다. 절단은 소두 6의 형성 직후이어야하며 소두(10)를포함해서는 안됩니다.
- 무딘 집게를 사용하여 전방 소뇌 피질 섹션과 후방 소뇌 피질 섹션을 각각의 미세 분리 튜브에 조심스럽게 놓고 5 분 동안 액체 질소에 튜브를 방치하여 플래시 동결하십시오. 여기에서 RNA 추출으로 전진하거나 -80°C에서 튜브를 저장할 수 있다.
3. RNA 추출
참고 : 이 프로토콜은 TRIzol20RNA추출을위한 콜드 스프링 하버 프로토콜에서 수정됩니다. TRIzol은 생물학적 물질을 용해시켜 RNA를 추출할 수 있게 합니다.
- 마이크로퍼지 튜브를 얼음에 놓고 조직이 너무 빨리 해동되지 않도록 하고, 마이크로퍼지 튜브에 150 μL의 차가운 TRIzol을 적용합니다. 살균 된 페일과 균질화하십시오. 조직이 균질화되면 용액을 위아래로 파이프하여 남은 조직이 손상되지 않도록 하십시오. 또한 인슐린 주사기로 몇 번 당겨서 작은 조직 조각을 분해하십시오.
- TRIzol의 또 다른 350 μL을 추가하고 철저하게 혼합하려면 위아래로 파이펫합니다. 5 분 동안 방 온도에 앉아 보자.
- 150μL의 클로로폼을 튜브에 넣고 힘차게 흔들어 서 2-3분간 휴식을 취하십시오. 엽록소형태는 균질화된 조직 용액을 단계(RNA, DNA 및 단백질)로 분리합니다.
- 15°C에서 12,000 x g의 원심분리기는 10분 동안 가능합니다. 모든 튜브가 동일한 방향에 있는지 확인합니다.
- 조심스럽게 튜브를 제거하고 원심 분리기의 온도를 4 ° C로 설정합니다. 불투명한 간위상(DNA)을 방해하지 않도록 주의하여 새로운 튜브(RNA)로 명확한 수성 상만 제거하십시오. 가장 낮은 단계는 빨간색이 될 것이며 단백질을 함유하고 있습니다. 튜브에 남은 솔루션을 저장하거나 버릴 수 있습니다.
- 1:2 비율로 100% 이소프로필 알코올을 추가합니다(수성 상 200ul을 제거하면 이소프로필 알코올 100 μL을 추가). 위아래로 파이프를 통해 완전히 섞으세요. 실온에서 10분간 휴식을 취하십시오. 이소프로필 알코올은 RNA를 용액에서 침전시합니다.
- 원심 분리기는 12,000 x g, 4 °C에서 10 분 동안. 펠릿을 쉽게 시각화할 수 있도록 모든 튜브를 동일한 방향으로 배치해야 합니다. 결과 펠릿은 추출된 RNA가 될 것이다.
- 조심스럽게 튜브를 제거하고, 펠릿을 방해하지 않도록주의되는 파이프로 상체를 제거합니다. 펠릿은 다소 젤과 같고 보기 어려울 수 있지만 원심분리기의 튜브 방향을 기준으로 하는 위치를 추정할 수 있어야 합니다.
- 모든 상체를 제거한 후 75% 에탄올, 소용돌이, 원심분리기 의 500 μL을 4°C에서 7500 x g로 5분간 추가합니다. 에탄올은 펠릿을 더 낭비합니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 샘플을 건조하기 위해 캡을 열어 둡니다. 이것은 일반적으로 5-10 분 걸리지만 펠릿에 남은 에탄올의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 지나치게 건조하지 마십시오.
- 건조하면 DNase 의 물에서 펠릿을 다시 놓습니다. DCN용 샘플에 20 μL을 추가하고 다른 모든 샘플에 30 μL을 추가합니다.
- 다시 중단되면 샘플을 -80 °C에 저장하거나 추가 테스트를 진행할 수 있습니다.
4. 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(RTqPCR)
- 이 단계 전에 DNase는 어떤 게놈 DNA를 제거하기 위하여 RNA를 취급하고, BioRad에서 iScript를 이용한 cDNA를 생성할 필요가 있을 것입니다. cDNA를 만들기 전에 RNA의 농도를 정상화해야합니다. 또한 qPCR용 프라이머를 최적화하는 것이 중요합니다. 이 단계21을완료하려면 여기에 설명된 메서드를 따르십시오. 아래 qPCR에 대한 간략한 설명.
- 프라이머는 모두 IDT에서 구입합니다. 전방 및 역시퀀스는 모두 동일한 샘플 튜브에 있으며 20배 농도로 저장됩니다.
Rps18 (제어 유전자):
포워드 – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
역 - 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
파르팔알린 (칼슘 결합 단백질, 억제 세포):
포워드 – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTCC-3'
역 - '5-AGCGTCTTTTTTTTTTTTTT타카그-3'
Kcng4 (칼륨 채널 하위 단위):
앞으로 – 5'-CTGTCTTTTCCTGTCAGTGA-3'
역 – 5'-GCATTGCCTCAGGTCAG-3'
알돌라제 C (제브린 II, 소뇌 피질에 걸쳐 차별화됨):
포워드 – 아가가카아가타가트GCTG-3'
역 - 5'-TCAGTAGGCATGGTTGC-3' - qPCR 조건은 다음과 같습니다. 95°C에서 5분 전 배양 기간. 증폭 기간, 50 사이클: 95°C에서 10분, 62°C에서 10분, 72°C에서 10분. 95°C에서 5초, 65°C에서 1분, 97°C의 목표 온도까지 경사로 속도를 .07°C/초로 설정합니다. 그런 다음 냉각 기간을 10분에서 40°C까지 냉각합니다. 모든 qPCR 반응은 트리플리케이트및 유전자 발현에서 수행되었다 2-ΔΔCt를 사용하여 Rs18을 사용하여 로딩 제어로서 유전자 발현을 정상화했다. 대량 소뇌 추출물은 참고로 사용되었다.
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Representative Results
이러한 실험을 위해, 41주 된 암컷 야생형 C57/Black6 마우스가 사용되었다. 한 마우스는 '대량 소뇌'라고 불리는 전체 소뇌 해부를 실시하는 데 사용되었으며 해부 된 부위의 RNA 수준을 전체 해부에 비교할 수 있었습니다. 다른 3개의 마우스는 이 프로토콜에 기재된 소뇌 해부를 수행하기 위하여 이용되었다. 3개의 마우스를 사용하여 RNA의 수준에서 검출된 동향이 마우스를 통해 재현가능한지 확인하는 것이 가능하게 합니다.
도 1A는 마우스 소뇌를 나타냅니다 - 파란색과 노란색의 반구의 vermis. vermis의 궁선 회로도 (어두운 파란색의 전방 영역, 밝은 파란색의 후방 영역) 및 반구 (노란색). DCN은 빨간색 점선 상자로 강조 표시됩니다. 성공적인 해부는 뇌의 중간선 아래로 초기 면도날 배치로 시작됩니다(그림 1B); 이것은 다음 6 개의 블레이드(그림 1C)의성공적인 배치를 안내합니다. 이렇게 하면 6개의 적발섹션(그림 1D),4개의 측면/반구 섹션(보라색으로 윤곽) 및 2개의 미드라인/버말 섹션(밝은 파란색으로 윤곽)을 남깁니다. 4개의 측면 섹션에는 DCN이 포함되어 있습니다. 그림 1E는 성공적인 DCN 펀치 해부를 묘사합니다. 중간 선 상록 섹션은 가장 가능성이 1mm 두께 섹션에 존재하는 가장 중간 DCN의 절반을 가질 것이다, 그러나 그것은 통해 모든 방법을 제시하지 않습니다 및 재현적으로 해부 할 수 없습니다. 중간선 상체 섹션은 도 1F에묘사된 전방 및 후방 소반으로 구분됩니다. 성공적인 해부는 성공을 위해 나머지 실험을 설정합니다.
실시간 질적 폴리머라제 연쇄 반응(RTqPCR) 결과는 각 개별 영역의 유전자 발현 수준을 평가하는 타당성뿐만 아니라 해부를 검증하는 역할을 합니다. 우리는 DCN에서 후방 소뇌 피질 및 농축에 전방에서 그라데이션 발현을 보여주는 유전자를 검출하는 프라이머를 사용하고 그들의 표정을 대량 소뇌 용액에 비교했습니다.
우리는 세 가지 유전자의 발현 수준을 평가: 알돌라아제 C, parvalbumin, 그리고 Kcng4. Aldolase C, 또한 제브린 II로 알려진, 소뇌를 통해 일관된 밴딩 패턴으로 표현 되는 효소. 전방 버릿보다 후방 의 버미에서 더 높게 표현된다. 반구13,14에도밴드가 있습니다. 억제 세포에서 발현되는 칼슘 결합 단백질인 파르브알부민. 알렌 브레인 아틀라스에 따라, parvalbumin 상대적으로 균일 하 게 소뇌 피 질과 DCN에서 표현 보인다 (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, 칼륨 전압 게이트 채널 하위 단위, 후방 엽에 비해 DCN 및 전방에서 농축 된 것으로 보인다 (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). 정량적 발현 분석은, 예상대로, 알돌라아제 C가 대량 소뇌 해부(그림2A)에비해 DCN 및 상반부(CCaV)의 DCN 및 전방 영역에서 더 낮은 후방 소뇌 부목(CCpV)에서 더 높게 발현되는 것으로 나타났다. Parvalbumin은 DCN, 전방 버몬트, 후방 vermis 및 반구 소뇌 코르티체에서 와 유사하게 대량 소뇌추출물(도 2B)에존재한다. Kcng4는 DCN 및 전방 버미스(CCaV)에서 현저히 농축되며 벌크추출(도 2C)에비해 후방 버미스(CCpV) 또는 반구(CCH)에서 현저히 농축되지 않는다. 이 결과는 알렌 뇌 아틀라스에서 본 패턴에 따라 예상 된 것을 다음과 같습니다. 따라서, 유전자 발현 분석은 해부 프로토콜을 검증하고 양질의 RNA가 얻어지고 시험될 수 있음을 확인한다.
소뇌 피질을 가로지르는 알돌라아제 C의 발현을 직접 비교하기 위해, 발현 수준은 가장 낮은 곳, 전방 버미스(CCaV)(도 3)와비교하였다. 알돌라아제 C의 발현 수준은 후방 버미스(CCpV)에서 상당히 높았으며, 소뇌반구(CCH)에서 더 높은 추세를 보였지만 상당히 많지는 않았다. 소뇌 반구의 이러한 경향은 반구에 알돌라아제 C의 밴드가 있기 때문에 가능성이 높으며, 해부는 알돌라아제 네거티브 및 양성 밴드를 캡처합니다.
그림 1: 소뇌 해부의 대표적인 이미지
A. 노란색의 파란색과 반구에 진실과 마우스 소뇌의 회로도. vermis와 반구 모두의 간구 소뇌 회로도. Vermis는 파란색으로, 진한 파란색은 전방 의 버미스를 표시하고, 밝은 파란색 표시 후방 vermis. 노란색의 반구. DCN은 각각 빨간색 점선 상자가 표시됩니다. B. 긴자리 마우스 뇌 매트릭스의 전체 뇌, 미드 라인 아래로 면도날을. C. 미드라인의 양쪽에 면도날 3개 1mm 를 배치합니다. D. 결과 여섯 개 궁수 뇌 섹션. 4개는 측면/반구 소뇌 섹션(보라색으로 윤곽이 있는 상위 4개 이미지)을 포함합니다. 두 가지에는 내측/vermal 소뇌 섹션이 포함되어 있습니다(아래 두 이미지는 밝은 파란색으로 설명되어 있음). E. DCN 펀치를 가진 대표적인 측면/반구 소뇌 섹션은 섹션의 오른쪽에 해부됩니다(그림 1D에분홍색으로 설명된 섹션). F. 그림 1D의 소뇌 부는 그 주위에 정사각형 점선 청록색을, 전방 및 후방 버말 소반으로 해부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 소뇌의 고립 된 특정 영역에서 상대적 유전자 발현.
알돌라아제C(2A),파르살부민(2B), Kcng4(2C)의 상대적 발현은 Rps 18(모든 세포에서 발현된 리보소말 RNA와 관련된 단백질)로 정규화하고, 대량 소뇌 추출물을 참고로 사용한다. 예상대로, 알돌라아제 C 발현은 DCN 및 전방버미스(2A)에서후방 버미스와 하부에서 더 높았다. 예상대로, 알렌 브레인 아틀라스에 기초하여, parv알부민 발현은 각 추출 된 영역에 걸쳐 균일하게 표현되고, Kcng4 발현은 DCN과 CCaV에서 현저하게 풍부하다. 투키의 포스트 호크 테스트와 편도 ANOVA. * p<.0.005, ** p<.0.0001 대량 소뇌 추출물에 대한. 히스토그램은 점으로 표시된 각 개별 마우스의 값이 있는 N=3의 평균 값을 나타냅니다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. DCN (깊은 소뇌 핵), CCaV (전방 버몬트의 소뇌 피질), CCpV (후방 버미스의 소뇌 피질), CCH (반구의 소뇌 피질). N=3 소뇌 해부 영역에 대 한 마우스. N=1 벌크 추출물. 삼중에서 수행 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 소뇌 피질을 통해 알돌라아제 C의 RTqPCR 상대 유전자 발현
소뇌 피질의 특정 영역에서 알돌라아제 C의 상대적 발현 - 전방 버미스 (CCaV), 후방 vermis (CCpV), 및 반구 (CCH). 알돌라제 C의 유전자 발현 수준은 Rps18로 정규화되고 전방 버미스에서발현 수준에 비하여 정규화되었다. 예상대로 알돌라제 C 표현은 후방 버미스에 풍부하게 되었다. 투키의 포스트 호크 테스트와 편도 ANOVA. *cCaV에 비해 p<.0.005. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. CCaV (전방 버몬트의 소뇌 피질), CCpV (후방 버미스의 소뇌 피질), CCH (반구의 소뇌 피질). N=3 마우스, 삼중에서 수행 된 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 설명된 방법은 4개의 명백한 소뇌 지역 내의 근본적인 유전자 발현 및 분자 기계장치를 평가할 수 있게 합니다 - 깊은 소뇌 핵 (DCN), vermis의 전방 소뇌 피질 (CCaV), vermis의 후방 소뇌 피질 (CCpV), 및 반구의 소뇌 피질 (CCH). 이 지역을 별도로 평가하는 능력은 특정 소뇌 지역의 이질성에 대한 우리의 지식을 확장하고 다양한 행동에 대한 기여도를 밝힐 것입니다.
전체 뇌 조직을 처진 분리하여 소뇌의 이 4개의 영역을 쉽게 시각화하고 식별할 수 있어 빠른 해부를 허용합니다. 저자의 지식의 최선을 다하여 이것은 분자 분석을 위한 완전한 소뇌 지역 해부에 대한 첫 번째 설명입니다. 최근 발표된 논문에서, 연구원은 분자 분석을 위한 소뇌의 전방 소엽 및 고개를 끄덕인 소반의 대량 해부를사용(22). 그러나 설명된 방법을 사용하면 DCN을 해부할 수도 없습니다. 300um 두께의 슬라이스를 절단하는 진동기를 사용하여 DCN 펀치를 분리하려는 시도는 일반적으로 세 가지 중요한 문제로 실행됩니다. 첫째, 세레벨라의 장착에 약간의 차이와 조직이 절단되는 각도로 인해 동물 전체에 걸쳐 동일한 영역을 재현하기가 쉽지 않습니다. 둘째, 장착 및 슬라이싱에는 시간이 걸리며, RNA 분해 가능성을 높이고 다운스트림 애플리케이션을 위한 RNA 샘플의 품질이 저하됩니다. 마지막으로, 300um 두꺼운 슬라이스에서 펀치RNA의 낮은 수율을 생성합니다.
여기에 표시된 데이터는 소뇌 부위에 걸쳐 상대적 유전자 발현을 평가하기 위해이 기술을 사용할 수 있음을 시사한다. 알돌라세 C는 CCpV. Kcng4에서 높은 조절을 받고 있으며 DCN 및 CCaV에서 높은 조절을 받고 있으며, 파르브알부민은 소뇌의 모든 지역에서 비교적 동등하게 표현된다. 이들은 단지 3개의 유전자인 동안, 이 해부 방법은 이 명백한 지구의 근본적인 분자 서명을 확인하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.
이 프로토콜 전체에 주의를 기울여야 할 몇 가지 중요한 사항이 있습니다. 매트릭스에 뇌를 배치하는 것은 중요한 단계입니다. 어떤 경우에는, 두뇌는 매트릭스또는 정확하게 미드라인에 있는 완벽하게 수준 으로 설정되지 않았을 지도 모릅니다. 이것은 각 궁수 단면도를 볼 때 명확해질 것입니다. 예를 들어, 미드라인에서 정확하게 잘라낸 경우 가장 내측 소뇌 섹션은 거의 동일하게 보이며 DCN이 표시되지 않습니다. 이러한 랜드마크는 눈으로 식별할 수 있기 때문에 vermal 또는 반구 섹션으로 자격이 되는 섹션 수를 해결할 수 있으며 동일한 미세 분리 튜브에서 함께 결합할 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 DCN의 추출입니다. 어떤 경우에는 200 μl 파이펫 팁의 상단에 손가락을 우울시키는 것은 조직 펀치를 추출하기에 충분한 압력이 아닙니다. 이 경우 바늘 코 집게로 펀치를 떠서 올바른 튜브에 펀치를 배치해야합니다. 이 프로토콜의 다음 중요한 단계는 RNA 추출입니다. 나열된 볼륨은 최대 RNA 추출에 최적화되었지만, 실험실의 개별 요구에 맞게 RNA 추출 프로토콜의 용액 양을 조정해야 할 수도 있습니다. 작업할 조직이 거의 없기 때문에 최종 RNA 제품에서 페놀 오염의 가능성이 높습니다. 이는 조직을 균질화하는 데 사용되는 TRIzol의 양을 조정하고 균질화 된 조직이 철저하게 혼합되도록함으로써 관리 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 한계는 DCN이 3개의 분리된 핵(측면, 인터포즈 및 내측)으로 나뉘지만 1mm 단면 중 각 핵을 시각화하고 재현적으로 펀치하기는 어렵고, RNA를 추출하는 충분한 조직을 가지고 있다는 것입니다. 이 제한과 함께, 가장 내측 DCN의 절반은 vermis에 나타납니다. 그러나,이 해부와 함께 시각화하고 재현하기 어렵다. 프로토콜이 현재 이기 때문에 내측 DCN및 나머지 DCN의 나머지 절반은 해부됩니다. 반구에는 10개의 개별 적인 vermal lobules 및 8개의 소운이 있습니다, 그러나 이 각각을 개별적으로 그리고 재현가능한 방식으로 해부하는 것은 어렵고 아주 낮은 RNA 사격량으로 이끌어 낼 것입니다. 이 방법은 소뇌의 영역으로 더 구체적으로 탐구할 수 있지만, 여전히 개별 소반 또는 하위 소반 단위의 수준에서 독특한 변화를 마스킹 할 수있는 그룹으로 뚜렷한 해부학 적 영역을 결합합니다.
결론적으로, 이 방법은 소뇌의 지역 분자 차이를 동시에 탐구할 수 있게 한다. 이 지역 특정 방식으로 소뇌를 평가함으로써, 그 지역을 특징짓는 근본적인 분자 기계장치 및 유전자 발현을 따로 따로 떼어놓을 수 있다. 이것은 뚜렷한 소뇌 지역이 다른 행동에서 재생하는 역할에 대한 우리의 이해를 강화하고 미래의 작업이 한 소뇌 지역에 특히 초점을 맞추고 질병 이나 표적 치료에 그 역할을 탐구 할 수 있도록 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 해부 와 RNA 추출 및 RTqPCR에서 문제 해결에 그들의 도움에 대한 Cvetanovic 실험실에서 오스틴 페로와 Juao-Guilherme 로사에 감사드립니다. 이 연구는 M. Cvetanovic에 의해 투자, R01 NS197387; HHS | 건강의 국가 학회 (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
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