Summary
Différentes régions cérébelleuses ont été impliquées pour jouer un rôle dans des résultats comportementaux distincts, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Ce travail décrit une méthode pour disséquer de manière reproductible et rapide le cortex cérébelleux des hémisphères, les régions antérieures et postérieures du vermis et les noyaux cérébelleux profonds afin de sonder les différences moléculaires en isolant l’ARN et en testant les différences dans l’expression des gènes.
Abstract
Le cervelet joue un rôle important dans plusieurs fonctions clés, notamment le contrôle du mouvement, de l’équilibre, de la cognition, de la récompense et de l’affect. Les études d’imagerie indiquent que des régions cérébelleuses distinctes contribuent à ces différentes fonctions. Les études moléculaires examinant les différences cérébelleuses régionales sont à la traîne car elles sont principalement effectuées sur des extraits cérébelleux entiers, masquant ainsi toute distinction entre des régions cérébelleuses spécifiques. Nous décrivons ici une technique permettant de disséquer de manière reproductible et rapide quatre régions cérébelleuses différentes : les noyaux cérébelleux profonds (DCN), le cortex cérébelleux vermal antérieur et postérieur et le cortex cérébelleux des hémisphères. La dissection de ces régions distinctes permet d’explorer les mécanismes moléculaires qui peuvent sous-tendre leurs contributions uniques à l’équilibre, au mouvement, à l’affect et à la cognition. Cette technique peut également être utilisée pour explorer les différences de susceptibilité pathologique de ces régions spécifiques à travers divers modèles de maladies de souris.
Introduction
Le cervelet contient plus de la moitié des neurones dans le cerveau et a toujours été appelé un centre de contrôle moteur et d’équilibre dans le cerveau1. Plus récemment, des études ont démontré que le cervelet joue un rôle clé dans diverses autres fonctions, y compris la cognition, le traitement de la récompense etl’affect2,3,4,5.
Le cervelet a une anatomie bien décrite: la région du cortex est composée de granules, de Purkinje et de couches moléculaires. Les cellules granulaires forment la couche cellulaire granulaire et envoient des entrées via des fibres parallèles aux dendrites cellulaires de Purkinje de la couche moléculaire qui reçoivent également l’entrée des fibres grimpantes provenant de l’olive inférieure. Les cellules de Purkinje envoient des projections inhibitrices aux cellules des noyaux cérébelleux profonds (DCN), qui servent de sortie principale du cervelet. La sortie de ce circuit cérébelleux est en outre modulée par l’activité des interneurones inhibiteurs dans le cortex cérébelleux, y compris les cellules de Golgi, stellaires etpaniers 4. Cette unité fonctionnelle cérébelleuse est répartie dans tous les lobules du cortex cérébelleux. Malgré ce circuit relativement uniforme à travers le cervelet, les preuves de la littérature de neuroimagerie humaine et des études de patients indiquent une hétérogénéité fonctionnelle du cervelet6,7.
Le cortex cérébelleux peut être divisé en deux régions principales: le vermis défini par la ligne médiane et les hémisphères latéraux. Le vermis peut être divisé en lobules antérieurs et postérieurs. Ces régions distinctes du cervelet ont été impliquées dans la contribution à différents comportements. Les modèles d’activité évoqués par une tâche ou sans tâche impliquaient que les régions antérieures du vermis contribuent davantage à la fonction motrice tandis que le vermis postérieur contribue davantage à la cognition6,7. Le vermis est également lié à l’affect et aux émotions, tandis que les hémisphères cérébelleux contribuent aux fonctions exécutives, visuelles-spatiales, langagiriques et autres fonctions mnémoniques8. En outre, des études anatomiques ont fourni des preuves que des régions cérébelleuses fonctionnellement distinctes sont liées à différentes régions corticales9. La cartographie des lésions-symptômes a révélé que les patients ayant subi un AVC affectant les lobules antérieurs (s’étendant jusqu’au lobule VI) avaient de moins bonnes performances sur les tâches motrices fines, tandis que les patients présentant des lésions des régions du lobe postérieur et des hémisphères présentaient des déficits cognitifs en l’absence de syndrome moteur cérébelleux10. Enfin, la pathologie cérébelleuse régionale dans la maladie indique que les régions cérébelleuses fonctionnellement distinctes sont également différemment sensibles à la maladie11,12.
Bien que beaucoup moins explorées, les preuves préliminaires démontrent des signatures d’expression génique distinctes dans les régions corticales cérébelleuses. L’expression cellulaire de Purkinje de Zebrin II montre un motif spécifique à la région dans le vermis tel qu’il y a plus de cellules positives de Zebrin II dans les lobules postérieurs et moins dans les lobules antérieurs13. Ceci est également en corrélation avec la fonction physiologique régionalement distincte car les cellules de Purkinje négatives de Zebrin II présentent une fréquence de déclenchement tonique plus élevée que les cellules de Purkinje qui sont Zebrin II positives14.
En plus du cortex cérébelleux, le cervelet comprend les noyaux cérébelleux profonds (DCN) qui servent de sortie primaire pour le cervelet. Les noyaux sont constitués des noyaux médiaux (MN), interposés (IN) et latéraux (LN). L’imagerie fonctionnelle et les études sur les patients ont démontré que le DCN participe également à divers comportements15, mais très peu d’études examinent le changement d’expression génique dans le DCN.
Les progrès des techniques moléculaires ont permis d’évaluer l’expression génique régionale dans le cerveau et ont révélé une hétérogénéité entre et au sein de différentes régions du cerveau dans les états physiologiques et pathologiques16. De telles études impliquent que le cervelet est différent des autres régions du cerveau. Par exemple, le rapport des neurones aux cellules gliales est inversé dans le cervelet par rapport à d’autres régions du cerveau1. Même dans des conditions physiologiques normales, l’expression des gènes pro-inflammatoires est régulée à la hausse dans le cervelet par rapport aux autres régions du cerveau17. Les techniques moléculaires ont également été très utiles pour identifier les voies qui contribuent à la pathogenèse des maladies cérébelleuses. Par exemple, le séquençage de l’ARN de l’ensemble des extraits cérébelleux a identifié des gènes modifiés dans un modèle murin transgénique spécifique à la cellule de Purkinje de l’ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) par rapport à leurs témoins de type sauvage. De telles preuves ont révélé des voies moléculaires clés sous-jacentes à la pathogenèse dans les cellules cérébelleuses de Purkinje et ont aidé à identifier des cibles thérapeutiques potentielles18. Cependant, des études récentes suggèrent qu’il existe des différences dans la vulnérabilité aux maladies dans les régions cérébelleuses11,12,19. Cela pourrait indiquer qu’il y a des changements clés qui se produisent dans des régions cérébelleuses distinctes, qui peuvent être masquées ou non détectées avec des extraits cérébelleux entiers. Il est donc nécessaire de développer des techniques qui permettent aux chercheurs d’examiner les profils moléculaires dans différentes régions cérébelleuses.
La technique proposée ici décrit une méthode reproductible pour disséquer quatre régions distinctes du cervelet de la souris afin d’isoler l’ARN de ces régions et d’explorer les différences régionales dans l’expression des gènes. Le schéma du cervelet de la souris sur la figure 1A met en évidence le vermis en bleu et les hémisphères en jaune. Concrètement, cette technique permet d’isoler quatre régions : les noyaux cérébelleux profonds (DCN) (cases pointillées rouges sur la figure 1A),le cortex cérébelleux du vermis antérieur (CCaV) (bleu foncé sur la figure 1A),le cortex cérébelleux du vermis postérieur (CCpV) (bleu clair sur la figure 1A),et le cortex cérébelleux des hémisphères (CCH) (jaune sur la figure 1A). En évaluant séparément l’expression génique de ces régions, il sera possible d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux fonctions discrètes de ces différentes régions ainsi que les différences potentielles dans leur vulnérabilité à la maladie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Configuration
- Rassemblez l’équipement nécessaire, y compris les ciseaux de décapitation, les pinces contondantes, les ciseaux à dissection, les ciseaux vasculaires, les microspatules, la matrice cérébrale de souris sagittale, les lames de rasoir, les embouts de pipet de 200 μL, la boîte de Pétri en verre, la glissière en verre et le seau à glace. Placez tout l’équipement sur un tampon absorbant.
- Placez la boîte de Pétri, la plaque de verre et la matrice cérébrale sur la glace.
- À l’aide d’une lame de rasoir à un angle perpendiculaire, couper environ 5 mm de la pointe d’une pointe de pipette de 200 μL. Cela rend la taille de l’ouverture à l’extrémité de la pointe d’environ 1 mm de large. Cela devrait suffire à frapper le DCN. Mais cela peut également être ajusté au besoin en fonction de la dissection. Ayez de nombreux conseils prêts pour un remplacement et un ajustement faciles.
- Étiqueter les tubes de microfuge de 1,5 mL avec identification animale et région cérébelleuse (quatre tubes par animal).
- Remplissez le récipient cryosécure avec de l’azote liquide pour flash geler les tissus après l’extraction.
2. Extraction et dissection du cerveau
Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives des comités de soins aux animaux de l’Université du Minnesota.
- Euthanasier la souris en utilisant une exposition au CO2 de 5%. Une fois que la respiration a cessé, effectuez une luxation cervicale. Décapitez la souris avec les ciseaux de décapitation et jetez la carcasse dans le récipient approprié.
- Faites une incision avec une lame de rasoir le long de la ligne sagittale médiale de la tête en commençant par le nez et en continuant jusqu’en arrière. Séparez la peau en la séparant de chaque côté de la ligne médiane. Utilisez la lame de rasoir pour couper le muscle de chaque côté, en coupant au-delà des conduits auditifs.
- À l’aide de ciseaux disséquants, coupez toutes les régions de la moelle épinière, jusqu’à l’endroit où le tronc cérébral rencontre le cervelet, en prenant soin de ne pas endommager le cervelet.
- Insérez l’une des lames de ciseaux vasculaires dans l’espace entre le tronc cérébral et la colonne vertébrale et coupez vers le conduit auditif, en soulevant les ciseaux pour couper proprement l’os mais limiter les dommages aux tissus.
- Continuez à couper le long du bord du crâne vers les bulbes olfactifs, en continuant à soulever tout en coupant pour limiter les dommages au tissu cérébral.
- À l’aide de la pince émoussée, décollez doucement l’arrière du crâne en découvrant la région postérieure du cerveau et du cervelet.
- À l’aide de la pince émoussée le long du bord du crâne qui vient d’être coupé, pelez le reste du crâne vers le haut et sur le cerveau. Cette étape devrait enlever la majorité de la calotte crânienne, révélant le cerveau.
- Coupez le reste du crâne avec les ciseaux vasculaires et les pinces contondantes, en dégageant la majeure partie du crâne du haut du cerveau.
- À l’aide de la microsicule, soulevez légèrement le cerveau et enlevez et glissez vers le haut pour retirer les ampoules olfactives du crâne restant et déconnecter les fibres du tractus optique. Le cerveau devrait se libérer facilement à ce stade.
- Placez le cerveau dans la boîte de Pétri assis sur de la glace et retirez tout crâne restant ou d’autres débris.
- À l’aide du microspatule, placez doucement le cerveau dans la matrice cérébrale avec la face dorsale vers le haut. Prenez le temps de vous assurer qu’il est défini au niveau dans la matrice, en particulier que la ligne médiane tombe au centre de la matrice. Cette matrice est conçue pour le tissu cérébral de souris adultes, les tissus d’animaux plus jeunes ou malades peuvent reposer plus bas dans la matrice, mais il devrait toujours être possible d’obtenir des résultats reproductibles sur les échantillons.
- Placez une lame de rasoir le long de la ligne médiane sagittale, en vous assurant que la lame pousse jusqu’au bas de la matrice(Figure 1B).
- Placez une autre lame de rasoir de 1 mm sur le côté de la première lame(Figure 1B). Placez deux autres lames à 1 mm l’une de l’autre. Le résultat final devrait être trois lames placées d’un côté du cerveau, toutes espacées de 1 mm. Faites la même chose de l’autre côté. Au total, 7 pales seront placées à 1 mm l’une de l’autre(Figure 1C).
- Saisissez soigneusement les extrémités avant et arrière des lames de rasoir et soulevez-les directement hors de la matrice. Le tissu à l’extérieur des lames de rasoir peut être jeté.
- Lentement, séparez une lame de rasoir à la fois des autres, en veillant à ne pas endommager les sections de tissu.
- Faites glisser délicatement la section de tissu de la lame de rasoir et sur la lame de verre avec le microspatule. Au total, il y aura six sections cérébrales sagnitales(Figure 1D).
- Les 4 sections les plus latérales auront DCN visible (encadré violet, Figure 1D). Pour isoler le DCN, maintenez l’embout de pipette coupé de 200 μL perpendiculairement au-dessus du DCN et poussez fermement à travers le tissu, en se balançant dans toutes les directions pour disséquer complètement le DCN des tissus environnants. Soulevez tout droit pour retirer proprement le DCN et confirmez visuellement la présence du tissu dans la pointe.
- Placez un doigt en haut de la pointe et appuyez vers le bas, ce qui fait gonfler le tissu. Placez la pointe dans un tube de microfuge correctement étiqueté et assurez-vous que le poinçon de tissu est placé dans le fond du tube. Répétez 2.17 pour les trois sections restantes, en plaçant les poinçons DCN dans le même tube. Placez le tube dans de l’azote liquide pour geler. Représentation de la taille de chaque poinçon dans la Figure 1E.
- Les sections dont le DCN a été extrait sont considérées comme de l’hémisphère cérébelleux. Repoussez le reste du tissu cérébral autour du cervelet dans ces sections. Utilisez des pinces contondantes et ramassez doucement ces sections du cortex cérébelleux de l’hémisphère et placez-les dans le tube microfuge respectif. Gel du flash.
- Pour les deux dernières sections vermales (boîte bleu clair, Figure1D),repoussez le tissu cérébral environnant en ne laissant que le cervelet. À l’aide d’une lame de rasoir, faites une coupe séparant les lobules antérieurs des lobules postérieurs. La coupe doit être juste après la formation du lobule 6 et ne doit pas inclure le lobule 10(Figure 1F).
- À l’aide de pinces contondantes, placez soigneusement les sections du cortex cérébelleux antérieur et les sections postérieures du cortex cérébelleux dans leurs tubes de microfuge respectifs et gelez en laissant les tubes dans de l’azote liquide pendant 5 minutes. De là, passez à l’extraction de l’ARN, ou peut stocker les tubes à -80 ° C.
3. Extraction de l’ARN
REMARQUE: Ce protocole est modifié à partir du protocole Cold Spring Harbor pour l’extraction d’ARN avec TRIzol20. TRIzol solubilise le matériel biologique, ce qui permet d’extraire l’ARN.
- Placez les tubes de microfuge dans de la glace pour empêcher le tissu de décongeler trop rapidement, appliquez 150 μL de TRIzol froid dans le tube de microfuge. Homogénéiser avec un pilon stérilisé. Une fois le tissu homogénéisé, pipetez la solution de haut en bas pour vous assurer qu’il n’y a pas de tissu restant intact. Briser davantage les petits morceaux de tissu en les tirant dans une seringue à insuline plusieurs fois.
- Ajouter encore 350 μL de TRIzol et pipet de haut en bas pour bien mélanger. Laisser reposer à température ambiante pendant 5 minutes.
- Ajouter 150 μL de chloroforme dans le tube et agiter vigoureusement, puis laisser reposer pendant 2-3 minutes. Le chloroforme sépare la solution tissulaire homogénéisée en phases (ARN, ADN et protéine).
- Centrifuger à 12 000 x g, à 15 °C, pendant 10 minutes. Assurez-vous que tous les tubes sont à la même orientation.
- Retirez soigneusement les tubes et réglez la température de la centrifugeuse à 4°C. Enlevez uniquement la phase aqueuse claire dans un nouveau tube (c’est l’ARN), en prenant soin de ne pas perturber l’interphase opaque (l’ADN). La phase la plus basse sera rouge et contiendra des protéines. La solution restante dans les tubes peut être conservée ou jetée.
- Ajouter 100% d’alcool isopropylique à un rapport de 1:2 (si on enlève 200 ul de phase aqueuse, ajouter 100 μL d’alcool isopropylique). Bien mélanger en pipetant de haut en bas. Laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes. L’alcool isopropylique précipite l’ARN hors de la solution.
- Centrifuger à 12 000 x g, à 4 °C, pendant 10 minutes. Assurez-vous de placer tous les tubes à la même orientation pour faciliter la visualisation de la pastille. La pastille résultante sera l’ARN extrait.
- Retirez soigneusement les tubes, retirez le surnageant avec une pipette en veillant à ne pas perturber la pastille. La pastille ressemble un peu à du gel et sera difficile à voir, mais devrait pouvoir estimer où elle se trouve en fonction de l’orientation des tubes dans la centrifugeuse.
- Après avoir retiré tout le surnageant, ajouter 500 μL d’éthanol à 75%, vortex brièvement, et centrifuger à 7500 x g, à 4 °C, pendant 5 minutes. L’éthanol lave davantage le granulé.
- Retirez le surnageant avec précaution, sans perturber la pastille. Laissez les bouchons ouverts pour sécher l’échantillon. Cela prend généralement de 5 à 10 minutes, mais peut varier en fonction de la quantité d’éthanol restante sur le granulé. Ne pas trop sécher.
- Une fois sec, ressuspendez le granulé dans de l’eau sans DNase. Ajouter 20 μL aux échantillons pour le DCN et 30 μL pour tous les autres.
- Une fois réinsaisis, les échantillons peuvent être conservés à -80 °C ou procéder à d’autres tests.
4. Réaction en chaîne quantitative par polymérase en temps réel (RTqPCR)
- Avant cette étape, il sera nécessaire de traiter l’ARN par DNase pour éliminer tout ADN génomique et générer de l’ADNc en utilisant iScript de BioRad. Assurez-vous de normaliser la concentration d’ARN avant de fabriquer l’ADNc. De plus, il est important d’optimiser les amorces pour la qPCR. Suivez les méthodes décrites ici pour effectuer cette étape21. Brève description de la qPCR ci-dessous.
- Les amorces sont toutes achetées auprès d’IDT. Les séquences avant et arrière sont toutes deux dans le même tube d’échantillonnage et stockées à une concentration de 20x.
Rps18 (gène témoin) :
Avant – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
Inverse – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumine (protéine de liaison au calcium, cellules inhibitrices):
En avant – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Inverse – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (sous-unité du canal potassique):
Avant – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Inverse – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Aldolase C (Zebrin II, exprimée différentiellement à travers le cortex cérébelleux) :
Avant – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Inverse – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3' - Les conditions de la qPCR étaient les suivantes. Période de pré-incubation, 5 minutes, à 95°C. Période d’amplification, 50 cycles : 10 minutes à 95°C, 10 minutes à 62°C et 10 minutes à 72°C. Période de courbe de fusion, 5 secondes à 95 °C, une minute à 65 °C, et régler la vitesse de rampe à 0,07 °C/seconde jusqu’à la température cible de 97 °C. Puis période de refroidissement de 10 minutes à 40°C. Toutes les réactions qPCR ont été réalisées en trois exemplaires et l’expression des gènes a été analysée en utilisant 2- ΔΔCt avec Rps18 comme contrôle de charge pour normaliser l’expression des gènes. L’extrait cérébelleux en vrac a été utilisé comme référence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour ces expériences, quatre souris sauvages femelles de type C57/Black6 âgées de onze semaines ont été utilisées. Une souris a été utilisée pour effectuer une dissection cérébelleuse complète appelée « cervelet en vrac » et a permis de comparer les niveaux d’ARN dans les régions disséquées à une dissection complète. Les trois autres souris ont été utilisées pour effectuer la dissection cérébelleuse décrite dans ce protocole. L’utilisation de trois souris permet de s’assurer que les tendances détectées dans les niveaux d’ARN sont reproductibles chez les souris.
La figure 1A représente le cervelet de la souris - vermis en bleu et hémisphères en jaune. Schémas sagnitaux du vermis (régions antérieures en bleu foncé, régions postérieures en bleu clair) et de l’hémisphère (en jaune). Les DCN sont surlignés dans des cases pointillées rouges. Une dissection réussie commencera par le placement initial de la lame de rasoir le long de la ligne médiane du cerveau(Figure 1B); cela guide le placement réussi des six lames suivantes (Figure 1C). Cela laisse six sections sagnitales(figure 1D),quatre sections latérales/hémisphères (soulignées en violet) et deux sections médianes/vermales (soulignées en bleu clair). Les 4 sections latérales contiennent le DCN; La figure 1E illustre une dissection réussie du poinçon DCN. Les sections vermales médianes auront très probablement la moitié de la DCN la plus médiale présente dans la section de 1 mm d’épaisseur, mais elle ne sera pas présente tout au long et n’est pas possible de disséquer de manière reproductible. Les sections vermales médianes sont séparées en lobules antérieurs et postérieurs représentés à la figure 1F. Une dissection réussie met en place le reste des expériences pour réussir.
Les résultats qualitatifs en temps réel de la réaction en chaîne par polymérase (RTqPCR) démontrent la faisabilité d’évaluer les niveaux d’expression génique de chaque région individuelle et servent à valider les dissections. Nous avons utilisé des amorces détectant les gènes qui montrent l’expression du gradient du cortex cérébelleux antérieur à postérieur et l’enrichissement dans le DCN et comparé leur expression aux lysates cérébelleux en vrac.
Nous avons évalué les niveaux d’expression de trois gènes: aldolase C, parvalbumine et Kcng4. Aldolase C, également connue sous le nom de zebrin II, est une enzyme qui est exprimée selon un schéma de bandes cohérent à travers le cervelet. Il s’exprime plus fortement dans le vermis postérieur que dans le vermis antérieur. Il y a aussi des bandes dans les hémisphères13,14. La parvalbumine qui est une protéine de liaison au calcium qui est exprimée dans les cellules inhibitrices. D’après l’Atlas cérébral d’Allen, la parvalbumine semble s’exprimer de manière relativement uniforme dans tout le cortex cérébelleux et dans le DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, une sous-unité de canal à tension fermée de potassium, semble être enrichie dans le DCN et dans l’antérieur par rapport aux lobes postérieurs (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). L’analyse quantitative de l’expression a montré que, comme prévu, l’aldolase C est plus fortement exprimée dans le vermis cérébelleux postérieur (CCpV) mais plus faible dans le DCN et la région antérieure du vermis (CCaV) par rapport à la dissection cérébelleuse en vrac(Figure 2A). La parvalbumine est également présente dans le DCN, le vermis antérieur, le vermis postérieur et les cortex cérébelleux de l’hémisphère que dans les extraits cérébelleux en vrac (Figure 2B). Kcng4 est significativement enrichi dans le DCN et le vermis antérieur (CCaV) et il n’est pas significativement enrichi dans le vermis postérieur (CCpV) ou les hémisphères (CCH) par rapport à l’extraction en vrac(Figure 2C). Ce résultat suit ce qui était attendu sur la base du modèle observé dans l’Atlas du cerveau Allen. Ainsi, l’analyse de l’expression génique valide le protocole de dissection et confirme qu’un ARN de bonne qualité peut être obtenu et testé.
Pour comparer directement l’expression de l’aldolase C à travers le cortex cérébelleux, les niveaux d’expression ont été comparés à l’endroit où il est censé être le plus bas, le vermis antérieur (CCaV)(Figure 3). Le niveau d’expression de l’aldolase C était significativement plus élevé dans le vermis postérieur (CCpV), et tendance à la hausse dans les hémisphères cérébelleux (CCH), mais pas tout à fait significativement. Cette tendance dans les hémisphères cérébelleux est probable parce qu’il y a des bandes d’aldolase C dans les hémisphères, et la dissection capture les bandes négatives et positives de l’aldolase.
Figure 1: Images représentatives de la dissection cérébelleuse
A. Schéma du cervelet de souris avec vermis en bleu et hémisphères en jaune. Schémas cérébelleux sagnitaux du vermis et de l’hémisphère. Vermis est en bleu, avec bleu foncé marquant le vermis antérieur, et bleu clair marquant le vermis postérieur. Hémisphère en jaune. Les DCN sont marqués dans chacun d’eux avec des cases pointillées rouges. B. Cerveau complet dans la matrice cérébrale de souris sagittale, avec lame de rasoir en milieu de ligne. C. Placement de trois lames de rasoir espacées de 1 mm de chaque côté de la ligne médiane. D. Les six sections cérébrales sagnitales qui en résultent. Quatre contiennent des sections cérébelleuses latérales/hémisphères (les quatre premières images soulignées en violet). Deux contiennent des sections cérébelleuses médiales/vermales (deux images du bas, soulignées en bleu clair). E. Section cérébelleuse latérale/hémisphère représentative avec poinçon DCN disséqué à droite de la section (section soulignée en rose sur la figure 1D). F. Section cérébelleuse de la figure 1D avec des turquois carrés en pointillés autour d’elle, disséqués en lobules vermaux antérieurs et postérieurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Expression relative des gènes dans des régions spécifiques isolées du cervelet.
Expression relative de l’aldolase C (2A), de la parvalbumine (2B) et de Kcng4 (2C) normalisée à Rps 18 (protéine associée à l’ARN ribosomique exprimé dans toutes les cellules), et en utilisant l’extrait cérébelleux en vrac comme référence. Comme prévu, l’expression de l’aldolase C était plus élevée dans le vermis postérieur et plus faible dans le DCN et le vermis antérieur (2A). Comme prévu, selon Allen Brain Atlas, l’expression de la parvalbumine est exprimée uniformément dans chaque région extraite, tandis que l’expression de Kcng4 est significativement enrichie dans le DCN et le CCaV. ANOVA unidirectionnelle, avec un test post-hoc de Tukey. *p<.0.005, ** p<.0.0001 par rapport à l’extrait cérébelleux en vrac. Les histogrammes représentent les valeurs moyennes pour N=3 avec les valeurs de chaque souris affichées sous forme de points. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne. DCN (noyaux cérébelleux profonds), CCaV (cortex cérébelleux du vermis antérieur), CCpV (cortex cérébelleux du vermis postérieur) et CCH (cortex cérébelleux des hémisphères). N = 3 souris pour les régions de dissection cérébelleuse. N=1 extrait en vrac. Expérience réalisée en trois exemplaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: RTqPCR Expression génique relative de l’aldolase C dans le cortex cérébelleux
Expression relative de l’aldolase C dans des régions spécifiques du cortex cérébelleux - vermis antérieur (CCaV), vermis postérieur (CCpV) et hémisphères (CCH). Le niveau d’expression génique de l’aldolase C a été normalisé à Rps18 et comparé au niveau d’expression dans le vermis antérieur. Comme prévu, l’expression de l’aldolase C s’est enrichie dans le vermis postérieur. ANOVA unidirectionnelle, avec un test post-hoc de Tukey. *p<.0.005 par rapport au CCaV. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne. CCaV (le cortex cérébelleux du vermis antérieur), CCpV (le cortex cérébelleux du vermis postérieur) et CCH (le cortex cérébelleux des hémisphères). N = 3 souris, expérience réalisée en trois exemplaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La méthode décrite ici permet d’évaluer l’expression génique sous-jacente et les mécanismes moléculaires au sein de quatre régions cérébelleuses distinctes – les noyaux cérébelleux profonds (DCN), le cortex cérébelleux antérieur du vermis (CCaV), le cortex cérébelleux postérieur du vermis (CCpV) et le cortex cérébelleux des hémisphères (CCH). La capacité d’évaluer ces régions séparément élargira nos connaissances sur l’hétérogénéité de régions cérébelleuses spécifiques et peut-être éclairera leur contribution à divers comportements.
En sectionnant le tissu cérébral complet sagittally, il est possible de visualiser et d’identifier facilement ces quatre régions du cervelet, ce qui permet une dissection rapide. À la connaissance de l’auteur, il s’agit de la première description de la dissection régionale cérébelleuse complète pour l’analyse moléculaire. Dans un article récemment publié, les chercheurs ont utilisé la dissection en vrac des lobules antérieurs du cervelet et du lobule nodulaire du cervelet pour l’analyse moléculaire22. Cependant, avec la méthode décrite, ils ne seraient pas en mesure de disséquer également le DCN. Les tentatives d’isoler les poinçons DCN à l’aide d’un vibratome pour couper des tranches de 300um d’épaisseur se heurtent généralement à trois problèmes critiques. Tout d’abord, en raison de légères différences dans le montage du cervelet et l’angle de coupe du tissu, il n’est pas facile d’isoler de manière reproductible les mêmes régions chez les animaux. Deuxièmement, le montage et le tranchage prennent du temps, ce qui augmente les risques de dégradation de l’ARN et diminue la qualité de l’échantillon d’ARN pour les applications en aval. Enfin, les poinçons de tranches de 300um d’épaisseur produisent un faible rendement en ARN.
Les données présentées ici suggèrent qu’il est possible d’utiliser cette technique pour évaluer l’expression relative des gènes dans les régions cérébelleuses. L’aldolase C est fortement régulée à la hausse dans le CCpV. Kcng4 est fortement régulée dans le DCN et le CCaV, et la parvalbumine est exprimée de manière relativement égale dans toutes les régions du cervelet. Bien qu’il ne s’agisse que de trois gènes, ces résultats démontrent que cette méthode de dissection peut être utilisée pour identifier les signatures moléculaires sous-jacentes de ces régions distinctes.
Il y a quelques points critiques à prendre en compte tout au long de ce protocole. Positionner le cerveau dans la matrice est une étape importante. Dans certains cas, le cerveau peut ne pas avoir été réglé parfaitement au niveau de la matrice ou exactement sur la ligne médiane. Cela deviendrait clair en regardant chacune des sections sagnitales. Par exemple, si elles sont coupées exactement à la ligne médiane, les sections cérébelleuses les plus médiale seront presque identiques et n’auront pas de DCN visible. Parce que ces points de repère sont identifiables à l’œil, il est possible de dépanner combien de sections sont qualifiées de sections vermales ou d’hémisphères, et elles peuvent être combinées ensemble dans le même tube de microfuge. Une autre étape critique est l’extraction du DCN. Dans certains cas, enfoncer un doigt au sommet de la pointe de pipette de 200 μl n’est pas une pression suffisante pour extraire le poinçon tissulaire. Si tel est le cas, il sera nécessaire de prélassez le poinçon avec une pince à aiguille et de placer le poinçon dans le bon tube. La prochaine étape critique de ce protocole est l’extraction de l’ARN. Bien que les volumes énumérés aient été optimisés pour une extraction maximale de l’ARN, il peut également être nécessaire d’ajuster les quantités de solution dans le protocole d’extraction de l’ARN pour répondre aux besoins individuels du laboratoire. Parce qu’il y a peu de tissu avec lequel travailler, il y a un risque plus élevé de contamination par le phénol dans le produit ARN final. Cela peut être géré en ajustant la quantité de TRIzol utilisée pour homogénéiser le tissu et en veillant à ce que le tissu homogénéisé soit bien mélangé.
Les limites de ce protocole sont que, bien que les DCN soient divisés en trois noyaux distincts (latéraux, interposés et médiaux), il est difficile de visualiser et de frapper de manière reproductible chacune de ces sections de 1 mm, et encore moins d’avoir suffisamment de tissu pour extraire l’ARN. Parallèlement à cette limitation, la moitié des DCN les plus médiaux apparaissent dans le vermis; cependant, avec cette dissection, il est difficile de visualiser et de disséquer de manière reproductible. Comme le protocole l’est actuellement, l’autre moitié du DCN médial et le DCN restant sont disséqués. Il existe également dix lobules vermaux individuels et huit lobules dans les hémisphères, mais disséquer chacun d’eux individuellement et de manière reproductible serait difficile et conduirait à de très faibles rendements de concentration d’ARN. Bien que cette méthode permette de se plonger plus spécifiquement dans les régions du cervelet, elle combine toujours des régions anatomiques distinctes en groupes qui pourraient masquer des changements uniques au niveau des lobules individuels ou des unités sous-lobules.
En conclusion, cette méthode permet d’explorer simultanément les différences moléculaires régionales de quatre régions spécifiques du cervelet. En évaluant le cervelet de cette manière spécifique à la région, il est possible de distinguer les mécanismes moléculaires sous-jacents et l’expression des gènes qui caractérisent ces régions. Cela nous permettra de mieux comprendre le rôle que jouent les régions cérébelleuses distinctes dans différents comportements et de permettre aux travaux futurs de se concentrer spécifiquement sur une région cérébelleuse et d’explorer son rôle dans la maladie ou le traitement ciblé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Austin Ferro et Juao-Guilherme Rosa du laboratoire Cvetanovic pour leur aide dans le dépannage des dissections et dans l’extraction de l’ARN et la RTqPCR. Cette recherche est financée par M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
