Summary

Xenopus laevis Äggextraktberedning och levande avbildningsmetoder för visualisering av dynamisk cytoplasmatisk organisation

Published: June 06, 2021
doi:

Summary

Vi beskriver en metod för beredning och levande avbildning av outspädda cytoplasmatiska extrakt från Xenopus laevis ägg.

Abstract

Traditionellt används för bulkbiokemiska analyser, Xenopus laevis äggextrakt har framträtt som ett kraftfullt bildbaserat verktyg för att studera cytoplasmatiska fenomen, såsom cytokinese, mitotisk spindelbildning och montering av kärnan. Baserat på tidiga metoder som avbildade fasta extrakt som samplades vid glesa tidpunkter, avbildar de senaste tillvägagångssätten live-extrakt med hjälp av time-lapse-mikroskopi, vilket avslöjar mer dynamiska funktioner med förbättrad tidsupplösning. Dessa metoder kräver vanligtvis sofistikerade ytbehandlingar av bildkärlet. Här introducerar vi en alternativ metod för levande avbildning av äggextrakt som inte kräver någon kemisk ytbehandling. Det är enkelt att implementera och använder massproducerade laboratorieförbrukningsvaror för avbildning. Vi beskriver ett system som kan användas för både bredfälts- och konfokalmikroskopi. Den är utformad för avbildningsextrakt i ett 2-dimensionellt (2D) fält, men kan enkelt utökas till avbildning i 3D. Det är väl lämpat för att studera rumslig mönsterbildning i cytoplasman. Med representativa data demonstrerar vi den typiska dynamiska organisationen av mikrotubuli, kärnor och mitokondrier i interfasextrakt framställda med användning av denna metod. Dessa bilddata kan ge kvantitativ information om cytoplasmatisk dynamik och rumslig organisation.

Introduction

Cytoplasman utgör huvudvolymen i en cell och har en distinkt organisation. Ingredienserna i den eukaryota cytoplasman kan självmonteras i ett brett spektrum av rumsliga strukturer, såsom mikrotubule asters och Golgi-apparaten, som i sin tur är dynamiskt anordnade och vända beroende på cellens identitet och fysiologiska tillstånd. Att förstå cytoplasmans rumsliga organisation och dess koppling till cellulära funktioner är därför viktigt för att förstå hur cellen fungerar. Xenopus laevis äggextrakt har traditionellt använts för bulk biokemiska analyser 1,2,3,4,5,6,7,8, men nyligen genomförda arbeten etablerar dem som ett kraftfullt levande avbildningssystem för mekanistiska studier av cytoplasmatiska strukturer och deras cellulära funktioner 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Dessa outspädda extrakt bevarar många strukturer och funktioner hos cytoplasman, samtidigt som de tillåter direkta manipuleringar av cytoplasmatiskt innehåll som inte kan uppnås i konventionella cellbaserade modeller19,20. Detta gör dem idealiska för att karakterisera cytoplasmatiska fenomen och dissekera deras mekanistiska underlag.

Befintliga metoder för avbildningsextrakt kräver kemiska ytmodifieringar eller tillverkning av mikrofluidiska anordningar. En täckslipbaserad metod kräver polyetylenglykol (PEG) passivering av glasöverdrag21. En mikroemulsionsbaserad metod kräver ångavsättning av triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl)silan på glasytor22,23. Mikrofluidikbaserade system möjliggör exakt kontroll av volymen, geometrin och sammansättningen av extraktdroppar, men kräver specialiserade mikrofabrikationsanläggningar11,12,24.

Här introducerar vi en alternativ metod för avbildning av äggextrakt som är lätt att implementera och använder lättillgängliga, billiga material. Detta inkluderar beredning av en bildkammare med en bild och en täckskiva belagd med fluorerad etylenpropylentejp (FEP). Kammaren kan användas för avbildningsextrakt med en mängd olika mikroskopisystem, inklusive stereoskop och upprättstående och inverterade mikroskop. Denna metod kräver ingen kemisk behandling av ytor samtidigt som liknande optisk klarhet uppnås med befintliga glasbaserade metoder som diskuterats ovan. Den är utformad för att avbilda ett lager av extrakt med en enhetlig tjocklek över ett 2D-fält och kan enkelt utökas för att avbilda en 3D-volym extrakt. Den är väl lämpad för time-lapse-avbildning av kollektivt cytoplasmatiskt beteende över ett stort synfält.

Vi har använt interfas-arresterade äggextrakt för att demonstrera vår avbildningsmetod. Extraktberedningen följer protokollet för Deming och Kornbluth19. Kortfattat krossas ägg som naturligt arresteras i metafas av meios II av en låg hastighetsspinn. Denna spinn frigör cytoplasman från meiotisk arrestering och tillåter extraktet att fortsätta in i interfas. Normalt tillsätts cytochalasin B före krossspinnet för att hämma F-aktinbildning. Det kan dock utelämnas om F-aktin önskas. Cykloheximid tillsätts också före krossspinnet för att förhindra att interfasextraktet kommer in i nästa mitos. Extrakten placeras därefter i de ovan nämnda bildkamrarna och placeras på ett mikroskop. Slutligen spelas bilder in över tid med definierade intervall av en kamera ansluten till mikroskopet, vilket ger tidsfördröjningsbildserier som fångar extraktets dynamiska beteende i ett 2D-fält.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Stanford University. 1. Förberedelse av glidbanor och täckglas Applicera ett lager fluorerad etylenpropylen (FEP) tejp på en glasskiva med en rullapplikator. Klipp av överdriven tejp över kanterna med ett rent rakblad. Förbered FEP bandbelagda täckglas på samma sätt (figur 1A). Applicera en dubbelsidig klibbig bilddistans på den FEP…

Representative Results

Xenopus laevis äggextrakt kan användas för att studera cytoplasmans självorganisation under interfas. Figur 2A visar resultat från ett lyckat experiment. Vi kompletterade interfas-arresterade extrakt med demembranerade Xenopus laevis spermiekärnor 19 i en koncentration av 27 kärnor / μL och 0,38 μM renade GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (fusionsprotein bestående av glutation-S-transferas<sup class="xref"…

Discussion

Xenopus laevis äggextrakt har framstått som ett kraftfullt modellsystem för avbildningsbaserade studier av olika subcellulära strukturer 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 och cytoplasmatisk organisation i sin helhet<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar J. Kamenz, Y. Chen och W. Y. C. Huang för kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 och R35 GM131792) som tilldelades James E. Ferrell, Jr.

Materials

17 ml centrifuge tube Beckman Coulter 337986
22×22 mm square #1 cover glass Corning 284522
Aprotinin MilliporeSigma 10236624001 Protease inhibitor
Cycloheximide MilliporeSigma 01810 Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B MilliporeSigma C6762 Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs Nasco LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL488M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL670M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape CS Hyde company 23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG) MilliporeSigma CG10
Imaging spacer Electron Microscopy Sciences 70327-8S
Leupeptin MilliporeSigma 11017101001 Protease inhibitor
Microscope slides Fisher Scientific 12-518-100B
Mineral oil MilliporeSigma 330760
MitoTracker Red CMXRos Thermo Fisher Scientific M7512 For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) BioVendor RP1782725000
Roller applicator Amazon B07HMBJSP8 For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640 For removing excessive FEP tape
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-7M

References

  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
  3. Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
  4. Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
  5. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
  6. Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
  7. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
  8. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  9. Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
  10. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  11. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  12. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
  13. Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
  14. Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
  15. Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
  16. Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
  17. Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
  18. Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
  19. Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
  20. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  21. Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  22. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
  23. Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
  24. Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  25. Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
  26. Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
  27. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
  28. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  29. Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
  30. Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
  31. Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
  32. Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
  33. Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
  34. Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
  35. Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
  36. Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
  37. Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
  38. Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  39. Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).

Play Video

Cite This Article
Cheng, X., Ferrell, Jr., J. E. Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization. J. Vis. Exp. (172), e61923, doi:10.3791/61923 (2021).

View Video