Vi beskriver en metod för beredning och levande avbildning av outspädda cytoplasmatiska extrakt från Xenopus laevis ägg.
Traditionellt används för bulkbiokemiska analyser, Xenopus laevis äggextrakt har framträtt som ett kraftfullt bildbaserat verktyg för att studera cytoplasmatiska fenomen, såsom cytokinese, mitotisk spindelbildning och montering av kärnan. Baserat på tidiga metoder som avbildade fasta extrakt som samplades vid glesa tidpunkter, avbildar de senaste tillvägagångssätten live-extrakt med hjälp av time-lapse-mikroskopi, vilket avslöjar mer dynamiska funktioner med förbättrad tidsupplösning. Dessa metoder kräver vanligtvis sofistikerade ytbehandlingar av bildkärlet. Här introducerar vi en alternativ metod för levande avbildning av äggextrakt som inte kräver någon kemisk ytbehandling. Det är enkelt att implementera och använder massproducerade laboratorieförbrukningsvaror för avbildning. Vi beskriver ett system som kan användas för både bredfälts- och konfokalmikroskopi. Den är utformad för avbildningsextrakt i ett 2-dimensionellt (2D) fält, men kan enkelt utökas till avbildning i 3D. Det är väl lämpat för att studera rumslig mönsterbildning i cytoplasman. Med representativa data demonstrerar vi den typiska dynamiska organisationen av mikrotubuli, kärnor och mitokondrier i interfasextrakt framställda med användning av denna metod. Dessa bilddata kan ge kvantitativ information om cytoplasmatisk dynamik och rumslig organisation.
Cytoplasman utgör huvudvolymen i en cell och har en distinkt organisation. Ingredienserna i den eukaryota cytoplasman kan självmonteras i ett brett spektrum av rumsliga strukturer, såsom mikrotubule asters och Golgi-apparaten, som i sin tur är dynamiskt anordnade och vända beroende på cellens identitet och fysiologiska tillstånd. Att förstå cytoplasmans rumsliga organisation och dess koppling till cellulära funktioner är därför viktigt för att förstå hur cellen fungerar. Xenopus laevis äggextrakt har traditionellt använts för bulk biokemiska analyser 1,2,3,4,5,6,7,8, men nyligen genomförda arbeten etablerar dem som ett kraftfullt levande avbildningssystem för mekanistiska studier av cytoplasmatiska strukturer och deras cellulära funktioner 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Dessa outspädda extrakt bevarar många strukturer och funktioner hos cytoplasman, samtidigt som de tillåter direkta manipuleringar av cytoplasmatiskt innehåll som inte kan uppnås i konventionella cellbaserade modeller19,20. Detta gör dem idealiska för att karakterisera cytoplasmatiska fenomen och dissekera deras mekanistiska underlag.
Befintliga metoder för avbildningsextrakt kräver kemiska ytmodifieringar eller tillverkning av mikrofluidiska anordningar. En täckslipbaserad metod kräver polyetylenglykol (PEG) passivering av glasöverdrag21. En mikroemulsionsbaserad metod kräver ångavsättning av triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl)silan på glasytor22,23. Mikrofluidikbaserade system möjliggör exakt kontroll av volymen, geometrin och sammansättningen av extraktdroppar, men kräver specialiserade mikrofabrikationsanläggningar11,12,24.
Här introducerar vi en alternativ metod för avbildning av äggextrakt som är lätt att implementera och använder lättillgängliga, billiga material. Detta inkluderar beredning av en bildkammare med en bild och en täckskiva belagd med fluorerad etylenpropylentejp (FEP). Kammaren kan användas för avbildningsextrakt med en mängd olika mikroskopisystem, inklusive stereoskop och upprättstående och inverterade mikroskop. Denna metod kräver ingen kemisk behandling av ytor samtidigt som liknande optisk klarhet uppnås med befintliga glasbaserade metoder som diskuterats ovan. Den är utformad för att avbilda ett lager av extrakt med en enhetlig tjocklek över ett 2D-fält och kan enkelt utökas för att avbilda en 3D-volym extrakt. Den är väl lämpad för time-lapse-avbildning av kollektivt cytoplasmatiskt beteende över ett stort synfält.
Vi har använt interfas-arresterade äggextrakt för att demonstrera vår avbildningsmetod. Extraktberedningen följer protokollet för Deming och Kornbluth19. Kortfattat krossas ägg som naturligt arresteras i metafas av meios II av en låg hastighetsspinn. Denna spinn frigör cytoplasman från meiotisk arrestering och tillåter extraktet att fortsätta in i interfas. Normalt tillsätts cytochalasin B före krossspinnet för att hämma F-aktinbildning. Det kan dock utelämnas om F-aktin önskas. Cykloheximid tillsätts också före krossspinnet för att förhindra att interfasextraktet kommer in i nästa mitos. Extrakten placeras därefter i de ovan nämnda bildkamrarna och placeras på ett mikroskop. Slutligen spelas bilder in över tid med definierade intervall av en kamera ansluten till mikroskopet, vilket ger tidsfördröjningsbildserier som fångar extraktets dynamiska beteende i ett 2D-fält.
Xenopus laevis äggextrakt har framstått som ett kraftfullt modellsystem för avbildningsbaserade studier av olika subcellulära strukturer 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 och cytoplasmatisk organisation i sin helhet<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar J. Kamenz, Y. Chen och W. Y. C. Huang för kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 och R35 GM131792) som tilldelades James E. Ferrell, Jr.
17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |