Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

सैंड फ्लाई (Phlebotomus papatasi) CRISPR के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन/

Published: November 17, 2020 doi: 10.3791/61924

Summary

इस प्रोटोकॉल में रेत मक्खियों में CRISPR/Cas9 लक्षित म्यूटागेनेसिस के कदमों का विवरण दिया गया है: भ्रूण संग्रह, इंजेक्शन, कीट पालन, और पहचान के साथ-साथ ब्याज के उत्परिवर्तनों का चयन ।

Abstract

रेत मक्खियों लीशमैनिया प्रजातियों के लिए प्राकृतिक वैक्टर हैं, प्रोटोज़ोन परजीवी कटनीस घावों से लेकर आंत विकृति तक के लक्षणों के व्यापक स्पेक्ट्रम का उत्पादन करते हैं। वेक्टर/परजीवी बातचीत की प्रकृति को समझना उनके मेजबानों को लीशमैनिया संचरण की बेहतर समझ के लिए प्राथमिक महत्व का है । रेत फ्लाई वेक्टर क्षमता (यानी रोगजनकों को ले जाने और संचारित करने की उनकी क्षमता) को नियंत्रित करने वाले मापदंडों में से, इन कीड़ों के लिए आंतरिक पैरामीटर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाए गए थे। कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, उदाहरण के लिए, लीशमैनियाके लिए रेत फ्लाई वेक्टर क्षमता को प्रभावित करती है। इन गैर-मॉडल जीवों में उपयोग के लिए अनुकूलित जीन अभिव्यक्ति संशोधन के तरीकों की कमी से ऐसे मापदंडों का अध्ययन सीमित किया गया है । छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरएनए) द्वारा जीन डाउनरेगुलेशन संभव है, लेकिन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होने के अलावा, मुंह बंद करने से केवल कार्य का आंशिक नुकसान होता है, जिसे पीढ़ी दर पीढ़ी प्रेषित नहीं किया जा सकता है। CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी द्वारा लक्षित म्यूटेगेनिसिस को हाल ही में फ्लेबोटोमस पैपटासी रेत फ्लाई के लिए अनुकूलित किया गया था । यह तकनीक विशेष रूप से चुने गए लोकस में संक्रामक उत्परिवर्तनों की पीढ़ी की ओर ले जाती है, जिससे ब्याज के जीन का अध्ययन करने की अनुमति होती है। CRISPR/Cas9 प्रणाली लक्षित डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक के शामिल होने पर निर्भर करती है, बाद में या तो गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) या होमोलॉजी ड्रिवेन रिपेयर (एचडीआर) द्वारा मरम्मत की जाती है । NHEJ को तोड़ने के एक साधारण बंद के होते है और अक्सर छोटे प्रविष्टि की ओर जाता है/ इसके विपरीत, एचडीआर मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में लक्ष्य डीएनए के साथ एक दाता डीएनए अणु साझा होमोलॉजी की उपस्थिति का उपयोग करता है। यहां, हम NHEJ का उपयोग कर CRISPR/Cas9 द्वारा लक्षित म्यूटेनेसिस के लिए एक रेत फ्लाई भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन विधि प्रस्तुत करते हैं, जो आज तक रेत फ्लाई वैक्टर के अनुकूल एकमात्र जीनोम संशोधन तकनीक है ।

Introduction

वेक्टर जनित रोग निरंतर विकास में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा हैं । विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, बहुत अलग फिलोजेनिक परिवारों (जैसे, मच्छर, टिक, फ्लीस) में फैले सैकड़ों वेक्टर प्रजातियां बड़ी संख्या में माइक्रोबियल रोगजनकों के संचरण के लिए जिम्मेदार हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक साल में 700,000 से अधिक मानव मौतें होती हैं। वेक्टर कीड़ों में, फ्लेबोटोमाइन रेत मक्खियों (डिप्टेरा, साइकोडीडी) एक विशाल समूह का गठन करते हैं, जिसमें 80 सिद्ध वेक्टर प्रजातियां विभिन्न भौगोलिक क्षेत्रों में पाई जाने वाली विशिष्ट फेनोटाइपिक लक्षण और वेक्टरल क्षमताओं का प्रदर्शन करती हैं। वे लीशमैनियाजीनस के प्रोटोज़ोन परजीवी के लिए वैक्टर हैं, जिससे लीशमैनियास के लगभग 1.3 मिलियन नए मामले होते हैं और एक साल में 20,000 और 30,000 मौतों के बीच। लीशमैनियास नैदानिक परिणाम विविध होते हैं, जिसमें आत्म-सीमित क्यूटेनियस घावों से लेकर आंत के प्रसार तक के लक्षण होते हैं जो उपचार के अभाव में घातक होते हैं।

रेत मक्खियों सख्ती से स्थलीय कीड़े हैं। उनका जीवन चक्र, अन्य डिप्टेरा की तुलना में अपेक्षाकृत लंबा, तापमान, आर्द्रता और पोषण जैसे विभिन्न मापदंडों के आधार पर तीन महीने तक रहता है। इसमें एक भ्रूणीय चरण (6 से 11 दिन), चार लार्वा चरण (कुल 23 से 25 दिनों तक चलने वाले) और एक प्यूपल चरण (9 से 10 दिन) होते हैं जिसके बाद कायापलट और फिर वयस्कता होती है। रेत मक्खियों को पालने के लिए आर्द्र और गर्म वातावरण की आवश्यकता होती है। नर और मादा दोनों शर्करा पर भोजन करते हैं, जो फूल अमृत से जंगली में प्राप्त होते हैं। केवल मादाएं रक्त-फीडर होती हैं, क्योंकि उन्हें अंडा उत्पादन के लिए रक्त भोजन से प्राप्त प्रोटीन की आवश्यकता होती है1.

अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण ध्यान वेक्टर/परजीवी बातचीत की प्रकृति की पहचान करना है जो संक्रामक संक्रमणों के विकास का कारण बनता है । अन्य वेक्टर कीड़ों के साथ, रेत मक्खियों के लिए आंतरिक मापदंडों को उनकी वेक्टर क्षमता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, जिसे उनके मेजबानों को रोगजनकों को ले जाने और संचारित करने की उनकी क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है। उदाहरण के लिए, फलेबोटोमस पैपटासी रेत फ्लाई मिडगट कोशिकाओं द्वारा गैलेक्टिन की अभिव्यक्ति, परजीवी सतह घटकों को पहचानने वाले रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करती है, सीधे लीशमैनिया प्रमुख2, 3के लिए उनकी वेक्टर क्षमता को प्रभावित कर सकती है। कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्ग, प्रतिरक्षा कमी (आईएमडी), लीशमैनिया प्रमुख4के लिए फ्लेबोटोमस पापतासी रेत फ्लाई वेक्टर क्षमता के लिए भी महत्वपूर्ण है। संक्रामक रोगजनकों के संचरण को नियंत्रित करने में वेक्टर कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्गों के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका इसीतरह एडीज एजिप्टी मच्छरों 5,6,7,tsetse फ्लाई ग्लॉसीना मोर्सिटन्स8में और एनोफेलीज गैम्बिया मच्छरों में 9,10में सूचित किया गया है ।

इन कीटों में उपयोग के लिए अनुकूलित जीन अभिव्यक्ति संशोधन विधियों की कमी से रेतफ्लाई/लीश्मेनिया इंटरैक्शन के अध्ययन सीमित हो गए हैं । हाल ही में जब तक छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) द्वारा केवल जीन डाउनरेगुलेशन11,12,13,14 किया गया था । वयस्क महिलाओं के माइक्रोइंजेक्शन से जुड़ी मृत्यु दर से सीमित तकनीक केवल कार्य के आंशिक नुकसान की ओर ले जाती है, जिसे पीढ़ी दर पीढ़ी प्रेषित नहीं किया जा सकता है।

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी ने रेत मक्खियों जैसे गैर-मॉडल जीवों में कार्यात्मक जीनोमिक अनुसंधान में क्रांति ला दी है । बैक्टीरियोफेज15, 16के खिलाफ रक्षा के लिए प्रोकैरियोट्स में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली से संशोधित, CRISPR Cas9 प्रणाली को कीड़ों सहित बेहतर यूकेरियोटिक जीवों के लिए जीनोम संपादन उपकरण के रूप में तेजी से अनुकूलित किया गया है। CRISPR/Cas9 लक्षित जीनोम संपादन का सिद्धांत एक विशिष्ट जीनोमिक लोकस के लिए एक गाइड आरएनए (sgRNA) की पूरकता पर आधारित है । Cas9 नाभिक sgRNA के लिए बांधता है और जीनोमिक डीएनए में एक डबल स्ट्रैंड डीएनए (dsDNA) तोड़ बनाता है, जहां sgRNA अपने पूरक अनुक्रम के साथ सहयोगियों । Cas9-sgRNA परिसर को चुने हुए लोकस के लिए sgRNA में 17 से 20 पूरक ठिकानों द्वारा लक्ष्य अनुक्रम के लिए निर्देशित किया जाता है, DsDNA तोड़ तो दो स्वतंत्र रास्ते द्वारा मरंमत की जा सकती है: nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) या होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (HDR)17। NHEJ मरम्मत को तोड़ने के एक साधारण बंद शामिल है, लेकिन अक्सर छोटे प्रविष्टि की ओर जाता है/ एचडीआर के माध्यम से डीएनए मरम्मत मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में लक्ष्य डीएनए के साथ एक दाता डीएनए अणु साझा होमोलॉजी का उपयोग करता है। कीड़े दोनों मशीनों के अधिकारी हैं।

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी NHEJ मरम्मत मार्ग के माध्यम से, एक चुने हुए लोकस में उत्परिवर्तन उत्पन्न कर सकते हैं; या अधिक जटिल जीनोम संपादन रणनीतियों के लिए, जैसे नॉक-इन या अभिव्यक्ति संवाददाताओं, एक उपयुक्त दाता टेम्पलेट के साथ एचडीआर मार्ग के माध्यम से। रेत मक्खियों में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कारक स्वाद के शून्य उत्परिवर्ती एलील्स Phlebotomus papatasi4में NHEJ मध्यस्थता CRISPR के माध्यम से उत्पन्न किए गए थे । रेत मक्खी भ्रूण भी एक CRISPR के साथ एक और अध्ययन में इंजेक्शन थे/Cas9 मिश्रण जीन एन्कोडिंग पीले लक्ष्यीकरण । फिर भी, उत्परिवर्तन ले जाने वाले किसी वयस्क का उत्पादन नहीं किया गया18। हम यहां NHEJ-मध्यस्थता CRISPR/Cas9 द्वारा रेत मक्खी लक्षित mutagenesis की एक विस्तृत विधि का वर्णन, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन, प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम पर एक विशेष ध्यान के साथ ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

रेत मक्खी खिला के लिए रक्त के स्रोत के रूप में चूहों का उपयोग स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार सख्त किया गया था । प्रोटोकॉल NIAID, NIH (प्रोटोकॉल संख्या एलपीडी 68E) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । अकशेरुकी NIH दिशा निर्देशों के तहत कवर नहीं कर रहे हैं ।

1. सुई की तैयारी(चित्रा 1)

  1. मेयुती और हैरेल19में वर्णित सुइयों और बेवेल को खींचें । संक्षेप में, बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं का उपयोग करके, दोहरे चरण वाले ग्लास माइक्रोपिपेट पुलर पर सुइयों को खींचें।
  2. एक अतिरिक्त ठीक पत्थर का उपयोग करके, माइक्रोपिपेट बेवेलर पर गीले बेवेलिंग द्वारा सुइयों को तेज करें।

2. भ्रूण संग्रह और माइक्रोमैनिमुलेशन(चित्रा 2)

  1. इंजेक्शन के दिन से पांच दिन पहले, रक्त फ़ीड रेत मक्खी महिलाओं के रूप में नियमित रूप से कॉलोनी रखरखाव के लिए प्रदर्शन किया । रेत मक्खी कालोनियों पालन प्रक्रियाओं और आवश्यक सामग्री के बारे में जानकारी के लिए, कृपया वकील एट अल का उल्लेख करें। 1 अपने पूरे विकास केदौरान 70% आर्द्रता और 26 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में कीड़ों को बनाए रखें।
    1. एक दिन रक्त खिलाने के बाद, एक तरफ बंदरगाह के साथ प्लास्टर बर्तन में 100-150 के समूहों द्वारा रक्त खिलाया महिलाओं पर कब्जा । महिलाओं को चीनी समाधान (30% सुक्रोज - एक छोटी सूती गेंद को भिगोने के लिए पर्याप्त मात्रा) के साथ खिलाकर बनाए रखें जो कॉलोनी रखरखाव के लिए सामान्य है।
  2. दिन में 2-3 पोस्ट रक्त-भोजन, प्लास्टर बर्तन गीला नहीं है। महिलाओं को सूखे सब्सट्रेट पर रखने से समय से पहले अंडे बिछाने से रोका जा सकेगा, क्योंकि महिलाएं नम वातावरण पर अंडे डालना पसंद करती हैं।
  3. दिन 5 पोस्ट ब्लड फीडिंग पर भ्रूण कलेक्शन, माइक्रोमैनिमुलेशन और माइक्रोइंजेक्शन करें। अंडे बिछाने वाले कक्ष में एक नम फिल्टर पेपर पेश करें। हौसले से रखी भ्रूण एक पूरी तरह से विकसित कोरियोन नहीं है और सफेद दिखाई देते हैं । सफेद भ्रूण की कल्पना की सुविधा के लिए प्रक्रिया के दौरान काले फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
  4. एक मुंह एस्पिरेटर का उपयोग करके साइड पोर्ट के माध्यम से अंडे बिछाने वाले कक्ष में प्लास्टर पॉट से महिलाओं के एक छोटे समूह को स्थानांतरित करें। नम सब्सट्रेट (फिल्टर पेपर) की उपस्थिति महिलाओं को ओविपोसिट में लाती है।
  5. 30-60 मिनट के बाद, ध्यान से कक्ष से नए रखे भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर को पुनः प्राप्त करें। फिल्टर पेपर और भ्रूण को पेट्री डिश में 3 घंटे तक रखें। इस समय के दौरान, नियमित रूप से फिल्टर पेपर के नमी स्तर का आकलन करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह नम रहता है। इस समय के दौरान, महिलाओं के नए समूहों के साथ 2.4 से 2.6 चरण दोहराएं और जितना संभव हो उतने भ्रूण एकत्र करें।
  6. इंजेक्शन के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें: मैन्युअल रूप से अंडे को एक-एक करके एक बहुत ही महीन तूलिका के साथ इकट्ठा करें और ध्यान से उन्हें एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखे नम काले फिल्टर पेपर के दूसरे टुकड़े पर स्थानांतरित करें जो ग्लास कवरस्लिप के साथ सबसे ऊपर है।
    1. फिल्टर पेपर में पानी जोड़ें, भ्रूण को नम रखने के लिए पर्याप्त है लेकिन उन्हें कवरस्लिप से दूर तैरने या कवरस्लिप के नीचे चूसा जा रहा है। कवरस्लिप के खिलाफ भ्रूण को लाइन करें। कवरस्लिप इंजेक्शन के दौरान अंडे को दूर लुढ़कने से रोकने वाले बैकस्टॉप के रूप में कार्य करता है।

3. भ्रूण इंजेक्शन(चित्रा 3)

  1. अंडे के संग्रह की शुरुआत के बाद इंजेक्शन 2.5 से 3 घंटे शुरू करें। कमरे के तापमान और परिवेश प्रयोगशाला आर्द्रता पर इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं।
  2. सुनिश्चित करें कि गठबंधन भ्रूण पर्याप्त पानी है तो वे नम रखा जाता है ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण इंजेक्शन के दौरान नम रखा जाता है । यदि इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान वे नम नहीं हैं, तो इंजेक्शन मुश्किल हो जाते हैं क्योंकि सुई भ्रूण को भेदने में परेशानी होती है। पानी की सही मात्रा वह बिंदु है जिस पर भ्रूण के चारों ओर पानी का मेनिस्कस होता है, लेकिन कवरस्लिप पानी के शीर्ष पर तैरता नहीं है जिससे भ्रूण कवरस्लिप के नीचे धकेल देता है। इंजेक्शन के दौरान भ्रूण के आसपास पानी की मात्रा की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। भ्रूण को नम रखने के लिए जरूरत के अनुसार पानी डालें।
  3. पानी के साथ एक ब्रश गीला और फिल्टर पेपर के पीछे के अंत में पानी स्थानांतरित करके ध्यान से पानी जोड़ें। इस फैशन में पानी जोड़ने से पानी को धीमी और नियंत्रित फैशन में जोड़ा जा सकता है ताकि भ्रूण को नम रखने के लिए पर्याप्त जोड़ा जा सके। बहुत ज्यादा पानी भ्रूण संरेखण से बाहर तैरने के लिए पैदा कर सकता है, यह मुश्किल भ्रूण सुई करने के लिए कर रही है ।
  4. बैक लोड इंजेक्शन माइक्रोइंजेक्शन सुई में मिलाएं। हाथ से तैयार बोरोसिलिकेट सुई भराव का उपयोग करके सुई में इंजेक्शन मिश्रण के लगभग 0.5 से 1 μL जोड़ें, जेल लोडिंग पिपेट टिप्स का भी उपयोग किया जा सकता है। इंजेक्शन मिश्रण एक या कई गाइड आरएनए (80 एनजी/μL प्रत्येक) से बना है जो वाणिज्यिक पुनर्संयोजन Cas9 प्रोटीन (300 एनजी/μL) के साथ मिश्रित एक विशिष्ट लोकस को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
  5. 30 साई में इंजेक्शन दबाव के साथ शुरू, सुई की नोक से बाहर हवा निष्कासित करने के लिए इंजेक्शन ट्रिगर प्रेस। यह इंजेक्शन मिश्रण को प्रवाहित करने की अनुमति देने वाली सुई की नोक पर इंजेक्शन मिश्रण को मजबूर करेगा। इस बिंदु पर, धीरे से पकड़ बढ़ाने/लगातार दबाव जब तक इंजेक्शन सामग्री प्रवाह शुरू होता है, तो वापस पकड़/ गेटेड सेटिंग को पर्याप्त इंजेक्शन सामग्री वितरित करनी चाहिए ताकि थोड़ी मात्रा में सामग्री भ्रूण में प्रवेश करने के लिए देखी जा सके।
    नोट: ड्रोसोफिला और मच्छरों के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य प्रोटोकॉलों के समान हेलोकार्बन तेल के तहत रेत फ्लाई भ्रूण का इंजेक्शन शुरू में परीक्षण किया गया था, हालांकि इन इंजेक्शनों के लिए जीवित रहने का प्रतिशत बहुत कम था। ऊपर वर्णित नम फिल्टर पेपर पर इंजेक्शन पर स्विच करके अस्तित्व में सुधार किया गया था।
  6. सुई को भ्रूण के पक्ष में डालें। भ्रूण के पीछे कवरस्लिप का उपयोग बैकस्टॉप के रूप में करें जो भ्रूण को छेदने के लिए सुई की सहायता करेगा। सुई को धीरे-धीरे हटाने से पहले भ्रूण में इंजेक्शन मिश्रण की एक छोटी राशि वितरित करें।
  7. सुई को हटाने के तुरंत बाद, सुई टिप से किसी भी बैकफिल सामग्री को हटाने के लिए इंजेक्टर दबाएं। इससे सुई को क्लोजिंग से रोकने में मदद मिलेगी।
  8. अगले भ्रूण के लिए आगे बढ़ें। प्रत्येक इंजेक्शन के बीच, सुनिश्चित करें कि फिल्टर पेपर नम है और सुई भरा हुआ नहीं है।
  9. एक बार सभी भ्रूण इंजेक्शन दिया गया है, इंजेक्शन भ्रूण की संख्या गिनती के लिए एक चल मिलान रखने के लिए ।
  10. फिल्टर पेपर में पानी डालकर कवरस्लिप निकालें ताकि कवरस्लिप मंगाई जा सके। इस बिंदु पर, फ़िल्टर पेपर को जगह में रखने के लिए एक जांच (लकड़ी एप्लीकेटर टिप से चिपके कीट पिन के साथ छड़ी) का उपयोग करें, जबकि एक उंगली का उपयोग इंजेक्शन भ्रूण से कवरस्लिप को दूर खींचने के लिए किया जाता है।
  11. एक बार कवरस्लिप को हटा दिए जाने के बाद फिल्टर पेपर से अतिरिक्त पानी को दूर करें।

4. इंजेक्शन के बाद पालन (जी0)(चित्रा 4)

  1. आर्द्रता बनाए रखने के लिए पेट्री डिश में रखे नम फिल्टर पेपर की कई परतों के शीर्ष पर भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर स्थानांतरित करें। भ्रूण को अन्य भ्रूणों को इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक समय के दौरान यहां रखें। भ्रूण इस तरह से अधिकतम 3 घंटे के लिए आयोजित किया जा सकता है। इंजेक्शन के बाद वे धीरे-धीरे भूरे रंग के हो जाएंगे।
  2. एक बार सभी भ्रूण इंजेक्शन दिया गया है, मैन्युअल रूप से उन्हें पहले से गीला छोटे आकार प्लास्टर बर्तन पर स्थानांतरित। प्रत्येक बर्तन में बहुत सारे भ्रूण न डालें और व्यक्तियों के बीच संभावित फंगल संदूषण से बचने के लिए उनके बीच दूरी बनाए रखें। एक स्क्रीन के साथ बर्तन को कवर करें और उन्हें स्टोर करें जैसा कि आमतौर पर रेत फ्लाई कॉलोनी अंडे के लिए किया जाएगा, जो उनके पूरे विकास के दौरान 70% आर्द्रता और 26 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में बनाए रखा जाता है।
  3. दिन 1 के बाद इंजेक्शन, एक तूलिका के साथ सभी क्षतिग्रस्त और मृत भ्रूण को हटा दें। फंगल संदूषण को सीमित करने के लिए इंजेक्शन भ्रूण युक्त प्लास्टर बर्तन पर 0.5% प्रोपियोनिक एसिड, ड्रॉप बाय ड्रॉप, 0.5% प्रोपियोनिक एसिड के 100 माइक्रोन जोड़ें। इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त भ्रूण से साइटोप्लाज्म की रिहाई विशेष रूप से फंगल विकास के अनुकूल है।
  4. हर दिन प्लास्टर के बर्तनों की जांच करें और किसी भी खराब या मृत भ्रूण को हटा दें। यदि कवक मौजूद है, तो सभी संक्रमित भ्रूण को हटा दें और 0.5% प्रोपोनिक एसिड की कुछ बूंदें जोड़ें।
  5. लार्वा दिन 8 और 12 के बाद इंजेक्शन के बीच निकलता है। दिन में दो बार, नए उभरे लार्वा को 5-10 अधिकतम के समूहों में नए प्लास्टर बर्तनों पर स्थानांतरित करें। थोड़ी मात्रा में भोजन डालें और सप्ताह में 2-3 बार भोजन की जांच करें।
    1. लार्वा भोजन की मात्रा की सावधानीपूर्वक निगरानी करें, क्योंकि बहुत अधिक फंगल संदूषण का खतरा बढ़ जाता है। रेत फ्लाई लार्वा समूहों में बेहतर जीवित रहते हैं लेकिन यदि पर्याप्त भोजन नहीं है तो वे नरभक्षी हो सकते हैं।
  6. जब लार्वा प्यूपेट करते हैं, तो महिलाओं को कुंवारी के रूप में बनाए रखने के लिए उन्हें सेक्स द्वारा अलग करें। यदि बहुत सारे बचे हैं, तो पुरुषों को त्यागें और केवल मादाओं को रखें।
    नोट: दोनों पुरुषों और महिलाओं को ले जा सकते है और उत्परिवर्तन संचारित । हालांकि, चूंकि महिलाओं को पार करने से पहले कुंवारी रखनी होती है, इसलिए सेक्स द्वारा wt कीड़े को अलग करने से बचने के लिए केवल जी0 इंजेक्शन वाली महिलाओं का उपयोग करना आसान होता है। जी0 पुरुषों एक बैकअप के रूप में रखा जा सकता है अगर वयस्क बचे की संख्या कम है और इस मामले में हल wt कुंवारी महिलाओं के साथ संभोग किया जाएगा ।

5. उत्परिवर्ती एलील्स का चयन और स्क्रीनिंग(चित्रा 5)

  1. बड़े पैमाने पर एक पिंजरे में wt पुरुषों के साथ जी0 महिलाओं को पार। रक्त-उन्हें पूरी तरह से खिलाएं, जैसा कि सामान्य कॉलोनी रखरखाव के लिए किया जाएगा।
  2. एक दिन रक्त-भोजन के बाद, प्रत्येक जी0 मादा को 2-3 डब्ल्यूटी पुरुषों के साथ मुंह के एस्पिरेटर का उपयोग करके व्यक्तिगत प्लास्टर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। हर दिन बदले हुए एक छोटे से कपास की गेंद पर चीनी के साथ मक्खियों को खिलाएं और प्लास्टर नमी को सुनिश्चित करने के लिए पानी की एक सिरिंज का उपयोग करें अंडे बिछाने के लिए उपयुक्त है।
  3. जी0 महिलाओं के बाद अंडे (जी1के अनुरूप) रखा है, व्यक्तिगत में अपने शरीर को इकट्ठा, बाद में जीनोटाइपिंग के लिए Eppendorf ट्यूबों एनोटेट । आमतौर पर wt कालोनियों के लिए किया जाता है के रूप में भ्रूण बनाए रखें।
  4. पसंद की विधि से जी0 महिलाओं से डीएनए निकालें।
  5. म्यूटेशन की उपस्थिति के लिए डीएनए स्क्रीन, उदाहरण के लिए एक पीसीआर परख डिजाइन करके अपेक्षित CRISPR कटौती के क्षेत्र के आसपास प्राइमर का उपयोग कर ।
  6. केवल जी1 जी0 परिवर्तन के सबूत दिखा महिलाओं द्वारा रखी भ्रूण रखो । जब ये जी1 भ्रूण पिल्ले में विकसित होते हैं, तो उन्हें सेक्स से अलग करें और केवल महिलाओं को रखें। जी1 महिलाओं को एक ही जी0 मादा से पुरुषों को पार करें, उन्हें रक्त-फ़ीड करें, फिर 2-3 महिलाओं और 4-5 पुरुषों के छोटे समूहों में छोटे आकार के कंटेनरों में स्थानांतरित करें।
    नोट: सभी जी1 व्यक्तियों के पास एक अद्वितीय उत्परिवर्तन ले जाने का मौका है, इसलिए यदि जीवित व्यक्तियों की संख्या बहुत अधिक नहीं है तो डब्ल्यूटी पुरुषों के साथ व्यक्तिगत रूप से जी1 महिलाओं को पार करना बेहतर है। एक ही ट्यूब में मौजूद एक अलग उत्परिवर्तन ले जाने वाली कई महिलाओं का मामला दुर्लभ है लेकिन हो सकता है। यदि जीनोटाइपिंग के बाद ऐसा मामला देखा जाता है, तो जी2 संतान महिलाओं को व्यक्तिगत रूप से पुरुषों को wt करने के लिए संभोग किया जाना चाहिए। यह संभोग योजना संतान में कई म्यूटेशन की संभावना से बचती है।
  7. अंडा बिछाने के बाद, जी1 महिला निकायों को इकट्ठा करें और उन्हें म्यूटेशन के लिए स्क्रीन करें। केवल ट्यूब रखें जहां कम से एक महिला ने उत्परिवर्तन के सबूत दिखाए।
  8. बाद की पीढ़ियों के लिए एकल जोड़ी में पार करते हैं । अंडा बिछाने के बाद, उत्परिवर्तन की उपस्थिति के लिए माता-पिता स्क्रीन करें। प्रत्येक पीढ़ी पर दोहराएं जब तक कि माता-पिता दोनों एक ही उत्परिवर्तन के लिए होमोज़िगस न हों। एक बार पहचाने जाने के बाद, वे एक होमोज़िगस उत्परिवर्ती स्टॉक के संस्थापक होंगे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

रेत मक्खी म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए यहां वर्णित CRISPR/Cas9 माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल पिछले प्रकाशन 4 मेंस्थापितकिया गया था । इस दृष्टिकोण ने अत्यधिक कुशल म्यूटेनेसिस का उत्पादन किया, क्योंकि 540 व्यक्तियों में से 11 प्रक्रिया से बच गए, जिनमें से 9 उत्परिवर्ती थे। CRISPR/Cas9 उत्परिवर्तन के लिए गाइड डिजाइन करते समय, एक महत्वपूर्ण पहला कदम क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र को लक्षित करने के लिए अनुक्रम है । अनुक्रमण के लिए टेम्पलेट उस तनाव से होना चाहिए जिसे इंजेक्शन के लिए भ्रूण के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है। गाइड डिजाइन करने के लिए केवल प्रकाशित जीनोम दृश्यों पर भरोसा करना जोखिम भरा है। प्रकाशित जीनोम और प्री-गाइड डिजाइन दृश्यों के बीच मतभेद होना असामान्य नहीं है। कुछ मामलों में, प्रकाशित जीनोम अनुक्रम से डिजाइन किए गए गाइड तब मौजूद नहीं होते हैं जब लक्ष्य जीन के आसपास का क्षेत्र अनुक्रमित होता है (हैरेल, व्यक्तिगत अवलोकन)। इसके अलावा, अनुक्रम में एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसआरपी) शामिल हो सकते हैं जिन्हें जेनोटीपिंग के दौरान वास्तविक CRISPR संपादन के रूप में गलत किया जा सकता है। इसलिए, लक्ष्य क्षेत्र के लिए अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए प्रोटोकॉल के बाकी सफल होने के लिए महत्वपूर्ण है ।

माइक्रोइंजेक्शन द्वारा कीड़ों का सफल आनुवंशिक संशोधन मुख्य रूप से दो महत्वपूर्ण पहलुओं पर निर्भर करता है: विकास में उचित समय पर सामग्री (प्रोटीन, प्लाज्मिड, या एमआरएनए) का वितरण जितना संभव हो भ्रूण को कम नुकसान के साथ; और मजबूत, स्वस्थ कीड़े का पालन करना जो प्रक्रिया से बच जाएगा और संतान पैदा करेगा। चित्रा 2में वर्णित इस प्रक्रिया का प्रारंभिक चरण, डब्ल्यूटी कॉलोनी से महिलाओं के रक्त-भोजन से शुरू होता है और पांच दिन बाद भ्रूण संग्रह और माइक्रोइंजेक्शन के लिए आगे बढ़ता है। दूसरे चरण में वयस्कता तक इंजेक्शन भ्रूण का पालन करना, उचित क्रॉस करना और ब्याज के उत्परिवर्तनों की पहचान करना और अलग करना शामिल है ।

इंजेक्शन के लिए भ्रूण 30 -60 मिनट के लिए एकत्र किए जाते हैं ताकि ऑविशन के बाद के घंटों में सापेक्ष आयु निर्धारित की जा सके। भ्रूण तो इंजेक्शन की शुरुआत से पहले 3 घंटे के लिए विकसित करने की अनुमति दी जाती है । कीट विकास की इस बार खिड़की भ्रूण इंजेक्शन जीवित रहने के लिए अनुमति देता है। इस उम्र बढ़ने की अवधि के बाद, भ्रूण एक तैयार इंजेक्शन स्लाइड पर एकत्र कर रहे है और भ्रूण एक ठीक ब्रश का उपयोग कर एक कवरस्लिप बढ़त के खिलाफ जगह में लुढ़का रहे हैं । अंतिम विन्यास चित्रा 3Aमें दिखाया गया है । फिल्टर पेपर को पर्याप्त गीला करना महत्वपूर्ण है ताकि कवरस्लिप किनारे पर एक मेनिस्कस रूपों जहां भ्रूण बैठते हैं। बहुत ज्यादा पानी और भ्रूण को कवरस्लिप एज से दूर धकेल दिया जाएगा । बहुत कम भ्रूण कवरस्लिप के तहत तैयार किया जा करने के लिए कारण होगा । भ्रूण को नम रखने की जरूरत है, अन्यथा भ्रूण झिल्ली को इंजेक्ट करना मुश्किल हो जाता है। कवरस्लिप एज बैक स्टॉप के रूप में कार्य करता है, जिससे सुई को किनारे के खिलाफ दबाए जाने पर भ्रूण में प्रवेश करने की अनुमति मिलती है। यह एक तेज सुई और एक बैकस्टॉप का संयोजन है जो सुई को सुचारू रूप से प्रवेश करने की अनुमति देता है।

सबसे सफल माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, एक अच्छा माइक्रोइंजेक्शन सुई भ्रूण इंजेक्शन के लिए अनुकूल महत्वपूर्ण है । अच्छा, तेज सुइयों को सुइयों के रूप में परिभाषित किया जाता है जो आसानी से सामग्री को इंजेक्शन से बचने की अनुमति दिए बिना भ्रूण में प्रवेश करते हैं। अच्छा प्रवेश स्पष्ट है जब सुई भ्रूण में फिसल जाता है, प्रवेश के दौरान भ्रूण झिल्ली का कोई मांगपत्र नहीं है और सुई वापस ले लिया है के बाद भ्रूण से कोई सामग्री लीक करने के लिए थोड़ा कारण है । सुई खींचने वाले सेटिंग्स का उपयोग करके अच्छी तेज सुइयों का उत्पादन किया जाता है जो एक सुई का उत्पादन करते हैं जो एक ठीक बिंदु(चित्रा 1A)पर आता है। खींची गई सुई में ऐसा टेपर नहीं होना चाहिए जो बहुत लंबा हो। अन्यथा, सुई का ल्यूमेन टेपर(चित्रा 1B)के एक बड़े हिस्से के लिए बहुत संकीर्ण हो जाता है, और इंजेक्शन दबाव को सुई के माध्यम से सामग्री को मजबूर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। इस प्रोटोकॉल में, बेवल सुई का उपयोग किया गया था। सुई खींचने और बेवेलिंग करने की प्रक्रिया का वर्णन मेयुती और हैरेल19में किया गया है । रेत मक्खी भ्रूण है कि समय की एक लंबी अवधि में विकसित के मामले में, यह विशेष रूप से तेज सुई है कि भ्रूण को नुकसान को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रकार इंजेक्शन साइट पर लीक से सामग्री को रोकने । जब भ्रूण के बाद इंजेक्शन से भ्रूण लीक होता है, तो यह सामग्री मोल्ड और फंगल विकास के लिए एक समृद्ध माध्यम है। भ्रूण में है कि समय की एक छोटी अवधि में विकसित भ्रूण विकसित कर सकते है और हैच से पहले मोल्ड एक मुद्दा बन जाता है । इंजेक्शन के बाद भ्रूणप्लाज्म लीक करने वाले किसी भी भ्रूण को हटा दिया जाना चाहिए।

इंजेक्शन के दौरान, एक ठीक तूलिका गीला और फिल्टर पेपर के लिए इसे छूने के रूप में पानी जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, जब तक पानी के meniscus सिर्फ भ्रूण के आधार पर है के रूप में आवश्यक दोहरा । इंजेक्शन दिवस पर सापेक्ष आर्द्रता पर ध्यान देने की आवश्यकता है। कम आर्द्रता वाले दिनों में, अधिक पानी को जोड़ने की आवश्यकता होगी। एक बार इंजेक्शन पूरा हो जाने के बाद, फिल्टर पेपर में थोड़ा अतिरिक्त पानी जोड़ा जाता है ताकि कवरलिप थोड़ा तैरता है, जिससे इसे हटाना आसान हो जाता है। एक बार कवरस्लिप हटा दिया गया है, इंजेक्शन भ्रूण के साथ फिल्टर कागज दाग किया जा सकता है, ताकि फिल्टर कागज बस मुश्किल से नम है । भ्रूण तो एक ठीक तूलिका का उपयोग कर हैचिंग के लिए एक नम प्लास्टर पॉट में स्थानांतरित किया जा सकता है । इस स्तर पर, भ्रूण बहुत नाजुक हैं इसलिए प्रक्रिया को बहुत सावधानीपूर्वक शुरू किया जाना चाहिए। भ्रूण को एक दूसरे को छूने से रोकने के लिए भी महत्वपूर्ण है ताकि मोल्डी भ्रूण को हटाया जा सके और फंगल संदूषण के प्रसार को सीमित किया जा सके ।

इंजेक्शन के बाद जी0 इंजेक्शन भ्रूण को सामान्य पालन प्रक्रियाओं के अनुसार प्लास्टर पॉट्स पर रखा जाता है । जब तक वे हैच, इंजेक्शन भ्रूण बर्तन एक दिन में एक बार जांच की जानी चाहिए अस्वस्थ भ्रूण को दूर करने के लिए । चित्रा 4A अंडे बिछाने और वयस्कता के लिए इंजेक्शन के दिन से जी0 व्यक्तिगत पालन की अपेक्षित समय रेखा प्रस्तुत करता है । चित्रा 4B जी0 भ्रूण के उदाहरण दिखाता है जो स्वस्थ हैं और उन्हें बनाए रखा जाना चाहिए; या क्षतिग्रस्त, कवक से दूषित, विघटित, या विकृत और त्याग दिया जाना चाहिए। जी0 इंजेक्शन व्यक्तियों माना जाता है उत्परिवर्ती alleles के लिए पच्चीकारी हैं । संभावित उत्परिवर्ती एलील्स की पहचान करने के लिए एक विधि डिजाइन की जानी चाहिए, जैसे कि अपेक्षित कटिंग साइट (एस) के आसपास के क्षेत्र की पीसीआर-परख। चित्रा 4C एक पीसीआर-परख का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है जिसमें एक मोज़ेक जी0 व्यक्ति दिखाया गया है, जो एक पीसीआर उत्पाद को अपेक्षित डब्ल्यूटीई उत्पाद के अतिरिक्त प्रदर्शित करता है, जो एक उत्परिवर्ती एलील का प्रतिनिधित्व करता है।

एक बार वयस्कों के उभरने, जी 0 जी0 इंजेक्शन भ्रूण से विकसित महिलाओंwt पुरुषों के साथ पार कर रहे हैं, अंडे डालने की अनुमति दी, और बाद में जीनोटाइप कर रहे हैं । केवल जी0 फ्लाई युक्त ट्यूबों को पसंद की जीनोटाइपिंग विधि से उत्परिवर्तन के सबूत दिखाए जाते हैं। अगली पीढ़ियों (जी1 मादाओं) से मक्खियों को या तो डब्ल्यूटी पुरुषों के साथ या व्यक्तिगत रूप से भाई बहन (जी 2 से) के बीच पार कियाजाताहै। इन क्रॉस को अंडे डालने की अनुमति है और फिर पसंद की विधि से जीनोटाइप किया जाता है। अंतिम चरण तब तक दोहराया जाता है जब तक कि होमोज़िगस उत्परिवर्ती पुरुषों और महिलाओं को प्राप्त नहीं किया जाता है, एक होमोज़िगस उत्परिवर्ती रेखा की स्थापना की जाती है। चित्र 5एमें उत्परिवर्ती रेखा स्थापित करने के लिए पार करने के उचित उत्तराधिकार का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिया गया है । चित्रा 5B एक जेनोटीपिंग पीसीआर का एक उदाहरण दिखाता है जो एक होमोज़िगस उत्परिवर्ती सहोदर क्रॉस की पहचान की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोइंजेक्शन सुई। A. अच्छी सुई। बी सुई चरम टेपर के साथ इंजेक्शन के लिए अच्छा नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण संग्रह और माइक्रोमैनिपॉलेशन का अवलोकन (यह आंकड़ा4से अनुकूलित किया गया था)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोइंजेक्शन सेटअप। माइक्रोइंजेक्शन सेट-अप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। B. माइक्रोइंजेक्शन के लिए गठबंधन भ्रूण का क्लोज-अप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पच्चीकारी जी0 वयस्क व्यक्तियों का पालन और पहचान। A. भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन से जी0 वयस्कता तक अपेक्षित समय सारणी । बी अच्छे और बुरे दिखने वाले भ्रूण के बाद इंजेक्शन के उदाहरण । C. पीसीआर एक बदल जी0 पच्चीकारी व्यक्ति की genotyping । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: पहचान और ब्याज के उत्परिवर्तन के अलगाव । ए उत्परिवर्ती alleles अलग और होमोज़िगस उत्परिवर्ती स्टॉक (4से आंकड़ा) स्थापित करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । रंग विषम (गुलाबी) या होमोज़िगस (लाल) राज्य में उत्परिवर्ती एलील्स ले जाने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। B. रेत मक्खियों के व्यक्तिगत सिब्लिंग क्रॉस को जीनोटाइपिंग करने के लिए पीसीआर स्क्रीनिंग रणनीति का उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम यहां फूलबोटोमस पैपटासी रेत मक्खियों में CRISPR/Cas9 द्वारा लक्षित म्यूटेनेसिस के लिए हाल ही में विकसित भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन विधि पेश करते हैं । कीट आनुवंशिक संशोधन के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन 1980 के दशक के मध्य में ड्रोसोफिला में विकसित किया गया था और अब नियमित रूप से कीड़ों की एक विस्तृत विविधता में प्रयोग कियाजाता है । कीड़ों में उपयोग के लिए आनुवंशिक संशोधन सामग्रियों के वितरण के अन्य तरीके विकसित किए गए हैं, जैसे रेमोट20,21,22,23 और इलेक्ट्रोपाउरेशन23। हालांकि, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन वर्तमान में इन सामग्रियों के वितरण के लिए सबसे बहुमुखी और कुशल तरीका है। ReMOT एक वितरण विधि के रूप में बेहद आशाजनक है और भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में वयस्क इंजेक्शन की सापेक्ष आसानी के कारण, रेत मक्खियों में उपयोग के लिए पता लगाया जाना चाहिए। हालांकि, इस प्रकार अभी तक ReMot सफलतापूर्वक CRISPR/Cas9 HDR या ट्रांसपोसन ट्रांसजेनेसिस के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है । यद्यपि कीड़ों में भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए तकनीक मूल रूप से शुरू में विकसित समान है, तकनीकों के प्रत्येक नई प्रजातियों के शोधन की आवश्यकता हो सकती है। इन प्रजातियों के मतभेदों में भ्रूण के विकास, भ्रूण संरचना और पर्यावरण की अवधि और उस वातावरण में शामिल है जिसमें भ्रूण सामान्य रूप से विकसित होता है। रेत मक्खी भ्रूण विशेष रूप से छोटे हैं (0.3-0.5 मिमी लंबे और 0.1-0.15 मिमी चौड़े, ड्रोसोफिला अंडे 1 के आकार के लगभग1/3का प्रतिनिधित्व करते हैं)। यह कम आकार अंडों को बिना नुकसान पहुंचाए संभालने की कठिनाई बढ़ा देता है। प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में नमी के स्तर पर बहुत सावधानी से नजर रखी जानी चाहिए, क्योंकि रेत मक्खी भ्रूण विशेष रूप से desiccation के प्रति संवेदनशील हैं । हालांकि, वे जलीय नहीं हैं और अगर पूरी तरह से एक विस्तारित अवधि के लिए पानी में डूबे मर जाएंगे। ड्रोसोफिला भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन भ्रूण के पीछे के छोर पर इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। रेत मक्खी भ्रूण के निकट सममित आकार के कारण, भ्रूण ध्रुवीकरण का निर्धारण मुश्किल है । अंत में, जबकि रेत मक्खी भ्रूण विकास ड्रोसोफिलाके समान आय, यह बहुत धीमी दर पर ऐसा करता है । अकेले भ्रूणजीन 6 से 11 दिनों के बीच रहता है, रेत मक्खी प्रजातियों के आधार पर, जबकि ड्रोसोफिला अंडे केवल एक दिन अंडे बिछाने के बाद हैच । ड्रोसोफिला अंडा सेलुलराइजेशन ओविपोजिशन के लगभग 2 घंटे बाद होता है, जबकि रेत फ्लाई भ्रूण ओविपोजिशन के बाद 9 घंटे की दूरी पर इस स्तर तक पहुंचते हैं। विकास के समय में इस अंतर को देखते हुए, इंजेक्शन इस धारणा पर विकासशील रेत मक्खी भ्रूण के केंद्र के लिए लक्षित कर रहे है कि सिंक्विटी भ्रूण में नाभिक विकसित विकास के इस प्रारंभिक चरण में विकासशील भ्रूण के केंद्र के पास स्थित हैं, इस प्रकार भ्रूण ध्रुवता भेद करने की जरूरत का निराकरण ।

CRISPR/Cas9 एक चुना जीनोमिक लोकस पर dsDNA टूटता बनाता है । इन डबल स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत सेल में या तो एनएचईजे या एचडीआर द्वारा की जाती है । हम यहां जो विधि पेश करते हैं, उसका उपयोग पहले केवल एनएचईजे-आधारित म्यूटेगेनिसिस के लिए किया जाता था, जिसने छोटे सम्मिलन/विलोपन की घटनाओं, इनडेल्स उत्पन्न किए, जिससे जीन दृश्यों में एक फ्रेमशिफ्ट होता है, जिसके परिणामस्वरूप समय से पहले स्टॉप कोडन और प्रोटीन में सभी कार्यात्मक डोमेन4की कमी होती है। कीड़ों के पास एचडीआर के माध्यम से डीएसडीएनए ब्रेक रिपेयर के लिए सेलुलर मशीनरी भी होती है, जिसे तब अधिक जटिल जीनोम संपादन रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए रीरूट किया जा सकता है। एचडीआर आधारित CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन अभी भी रेत मक्खियों में उपयोग के लिए स्थापित करने की जरूरत है, और अभिव्यक्ति और सशर्त अभिव्यक्ति म्यूटेंट के संवाददाताओं के विकास की अनुमति चाहिए, अंय निर्माण के बीच ।

इस माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल का विकास अब अन्य जीनोम संशोधन विधियों का उपयोग करने के लिए दरवाजा खोलता है, जैसे CRISPR/Cas9 HDR, ट्रांसपोसन ट्रांसजेनेसिस, बाइनरी एक्सप्रेशन सिस्टम जैसे यूएएस/Gal4, और साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन phiC31 याCre/loxद्वारा । इन अन्य तरीकों के विकास से अधिक जटिल जीनोमिक हेरफेर की अनुमति देकर रेत फ्लाई जीन अभिव्यक्ति संशोधन के लिए टूलबॉक्स का विस्तार होगा। हालांकि, इससे पहले कि इन अन्य तरीकों को नियोजित किया जा सकता है, रेत मक्खियों में डाले गए जीन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए नियामक तत्वों की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए काम करने की आवश्यकता होगी, साथ ही इन तरीकों के सम्मिलन और अन्य घटकों के मार्कर, जैसे कि प्रमोटरों को ट्रांसपोसेस और रिकॉम्बेन्नेस की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए ।

अंत में, गैर-मॉडल कीड़ों में जीनोम संपादन अब एक संभावना बन गया है, विशेष रूप से CRISPR/Cas9 खोज और अनुकूलन15,16की क्रांति के लिए धन्यवाद । कीड़ों में, अधिकांश जीनोम संपादन तकनीक, नव विकसित रेमोट तकनीक के उल्लेखनीय अपवाद के लिए, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन की आवश्यकता होती है, जो महत्वपूर्ण और तकनीकी रूप से मांग दोनों कदम है। हमें उम्मीद है कि यह प्रकाशन रेत मक्खियों के अनुकूल जीन अभिव्यक्ति संशोधन तकनीकों की सीमा का विस्तार करने में मदद करेगा, और उनके जीव विज्ञान के साथ-साथ लीशमैनिया परजीवी के लिए वेक्टर क्षमता पर नई खोजों का नेतृत्व करेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए वैनेसा मेल्डेनर-हैरेल का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black Filter Paper 4.25CM PK100 VWR 28342-012 Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.
Coverslips Fisher Scientific 12-543A
Dissecting Microscope Any brand For aligning embryos
Glass slides Fisher Scientific 12-550-A3 Base layer of the microinjection set up Figure 2A
Insect cage custom made or several commercial options polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Larval food custom made a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml Drummond 1-000-1000 Used to back fill microinjection needles
Mouth aspirator John W. Hock Company Model 612 mouth aspirator with HEPA filter
Olympus SZX12 Olympus Life Sciences Microinjection microscope
Ovipots Nalge company ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Paint Brush 6-0 Any Art Supply Company n/a Used for aligning embryos
Propionic acid Sigma-Aldrich 402907 antifungal agent
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-3 Used for making microinjection needles
Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator Sutter Instruments Microinjection Controller and Micromanipulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
  2. Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
  3. Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
  4. Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
  5. Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
  6. Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
  7. Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
  8. Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
  9. Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
  10. Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
  11. Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
  12. Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
  13. Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
  14. Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
  15. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  16. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  17. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  18. Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
  19. Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
  20. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
  21. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
  22. Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
  23. Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).

Tags

JoVE में इस महीने अंक १६५ कीट जीनोम संपादन भ्रूण इंजेक्शन
सैंड फ्लाई (Phlebotomus papatasi) CRISPR के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन/
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., More

Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L., Aluvihare, C., Harrell II, R. A. Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis. J. Vis. Exp. (165), e61924, doi:10.3791/61924 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter