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Bioengineering

शांत मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल को बनाए रखने के लिए एक संस्कृति विधि

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/61938
Automatic Translation
1, 1
1Department of Stem Cell Biology, Research Institute, National Center for Global Health and Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड, कोलेस्ट्रॉल, साइटोकिन्स की कम सांद्रता और हाइपोक्सिया का उपयोग करके बोन मैरो माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करके विट्रो में शांत मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव में सक्षम बनाता है।

Abstract

अन्य स्तनधारी एचएससी की तरह मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी), अस्थि मज्जा में आजीवन हेमेटोपोसिस बनाए रखते हैं। एचएससी अधिक विभेदित जनकों के विपरीत वीवो में शांत रहते हैं, और बोन मैरो इंजरी या इन विट्रो कल्चर के इलाज के लिए कीमोथेरेपी या विकिरण के बाद तेजी से सेल चक्र में प्रवेश करते हैं। प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड, कोलेस्ट्रॉल, साइटोकिन्स की कम एकाग्रता, और हाइपोक्सिया की उपस्थिति में बोन मैरो माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करके, मानव एचएससी विट्रो में क्विसेंस बनाए रखते हैं। यहां, विट्रो में शांत राज्य में कार्यात्मक एचएससी को बनाए रखने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस विधि शारीरिक परिस्थितियों में मानव HSCs के व्यवहार के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा।

Introduction

हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) और मल्टीपॉटेंट जनक कोशिकाएं (एमपीपी) मनुष्यों में जीवन भर हेमेटोपोइसिस को बनाए रखने के लिए विभेदित कोशिकाओं की निरंतर भरपाई के लिए एक जलाशय बनाती हैं1। सेल चक्र क्विसेंस एचएससी की एक प्रमुख विशेषता है, जो उन्हें एमपीपीएस2से अलग करती है। परंपरागत रूप से, एचएससी को हेमेटोपोइटिक सिस्टम के पदानुक्रम के शीर्ष पर रहने के लिए सोचा जाता है, जो सभी विभेदित रक्त कोशिकाओं का उत्पादन करता है। इस पदानुक्रमित मॉडल को ज्यादातर प्रत्यारोपण प्रयोगों से कम किया गया था3. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्रत्यारोपण प्रयोगों में उन लोगों की तुलना में वीवो में एचएससी की गतिशीलता भिन्न है4,5,6,7. कई बार्कोडिंग सिस्टम का उपयोग करके वंश ट्रेसिंग प्रयोगों से पता चला है कि फेनोटाइपिक मुरीन एचएससी एक अद्वितीय सेल प्रकार नहीं है जो स्थिर-राज्य हेमेटोपोसिस में योगदान देता है, और एमपीपी, जो प्रत्यारोपण सेटिंग्स पर सीमित आत्म-नवीकरण गतिविधि प्रदर्शित करता है, लगातार परिपक्व रक्त कोशिकाओं की आपूर्ति4,5,8। इसके विपरीत, बोन मैरो इंजरी 4 के बाद परिपक्व कोशिकाओं में एचएसएससी का योगदान बढ़ायाजाताहै । यह अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण सहित अस्थि मज्जा एब्लेशन के बाद माइक्रोएनवायरमेंट में भारी परिवर्तन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हालांकि मानव कोशिकाओं के लिए मुरीन कोशिकाओं के वंश का पता लगाने को लागू करना मुश्किल है, एकल कोशिका-व्युत्पन्न कॉलोनी अलगाव और पूरे जीनोम अनुक्रमण के संयोजन से फिलोजेनेटिक विश्लेषण ने हेमेटोपोइटिक सिस्टम की एक समान संपत्ति का पता चला, जिसमें एचएससी और एमपीपी दोनों परिपक्व कोशिकाओं के दैनिक उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं7। इस प्रकार, हालांकि प्रत्यारोपण मुरीन या मानव एचएससी गतिविधि की जांच के लिए आवश्यक है, शारीरिक परिस्थितियों में एचएससी के व्यवहार को समझने के लिए अन्य प्रयोगात्मक मॉडलों की आवश्यकता होती है।

एचएससी के लिए खेती के तरीकों का विस्तार से अध्ययन किया गया है ताकि उनके नैदानिक अनुप्रयोगों और विशेषताओं को समझा जा सके। मानव एचएससी को साइटोकिन्स के संयोजन, बाह्य-मित्रिफियों के पुनर्गठन, स्व-नवीकरण विरोधी को हटाने, मेसेंचिमल या एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति, एल्बुमिन या इसके प्रतिस्थापन के अलावा, आत्म-नवीकरण प्रतिलेखन कारकों के लेनदेन, और छोटे अणु यौगिकों के अलावा9,10के संयोजन का उपयोग करके विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है। इनमें से कुछ तरीकों, जिनमें छोटे यौगिकों को जोड़ दिया गयाएसआर1 11 और यूएम17112,नैदानिक परीक्षणों में आशाजनक परिणाम9के साथ परीक्षण किया गया है। वीवो में एचएससी की शांत प्रकृति को ध्यान में रखते हुए, न्यूनतम सेल साइकिलिंग के साथ एचएससी को बनाए रखना विट्रो में एचएससी व्यवहार को फिर से काटना महत्वपूर्ण है। ल्यूसेंट और प्रसार एचएससी अंतर कोशिका चक्र प्रविष्टि13, मेटाबोलिक स्थिति14और कई तनावों के खिलाफ सहिष्णुता का प्रदर्शन करते हैं15 . विट्रो में मानव एचएससी की quiescence बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों सीमित हैं।

बोन मैरो (हाइपोक्सिक और लिपिड में समृद्ध) के माइक्रोएनवायरनमेंट की नकल करके और साइटोकिन्स की एकाग्रता को अनुकूलित करके, मानव एचएससी को संस्कृति के तहत अविभेदित और शांत बनाए रखा जा सकता है। विट्रो में एचएससी की शांत प्रकृति को पुनः निर्धारित करने से एचएससी के स्थिर राज्य गुणों की समझ में सुधार होगा और एचएससी के प्रायोगिक हेरफेर को सक्षम किया जा सकेगा।

Protocol

प्रोटोकॉल वैश्विक स्वास्थ्य और चिकित्सा के लिए राष्ट्रीय केंद्र के दिशा निर्देशों का पालन करता है । चूहों पर की जाने वाली सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय वैश्विक स्वास्थ्य और चिकित्सा पशु प्रयोग समिति के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा अनुमोदित किया जाता है ।
नोट: प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1में सचित्र है ।

1. लिपिड तैयारी

  1. संकेत सांद्रता पर ग्लास ट्यूबों में मेथनॉल में निम्नलिखित लिपिड भंग: सोडियम पामिटेट, 16 मिलीग्राम/ सोडियम ओलेट, 30 मिलीग्राम/एमएल; और कोलेस्ट्रॉल, 4 मिलीग्राम/एमएल । लिपिड समाधान को -30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से पहले नमूना गल लें।
  2. १०० μg/mL palmitate, १०० μg/mL oleate, और 20 μg/mL कोलेस्ट्रॉल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक खुराक पर एक ताजा ग्लास ट्यूब में कदम १.१ में तैयार लिपिड समाधान मिलाएं । उदाहरण के लिए, संस्कृति मीडिया के 10 एमएल तैयार करते समय, 62.5 माइक्रोन पलमिटेट समाधान, ओलिट समाधान के 33 माइक्रोन और ग्लास ट्यूब में कोलेस्ट्रॉल समाधान के 50 माइक्रोन मिलाएं।
  3. लिपिड समाधान(चित्रा 2A और 2B)के माध्यम से नाइट्रोजन गैस पारित करके मेथनॉल वाष्पित । यदि नाइट्रोजन गैस उपलब्ध नहीं है, तो पिपेट-सहायता का उपयोग करके समाधान के माध्यम से हवा से गुजरें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2 सी)पर पानी के स्नान में ग्लास ट्यूब को गर्म करके शेष मेथनॉल को पूरी तरह से वाष्पित कर दें।
    नोट: सीमित स्थान में एन2 गैस की उच्च एकाग्रता का उपयोग संभावित रूप से हानिकारक है। यद्यपि मेथनॉल को वाष्पित करने के लिए प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली मात्रा सीमित है और इस प्रकार इसे सुरक्षित माना जाता है, कमरे को पर्याप्त रूप से हवादार और एन2 गैस की संभावित उच्च सांद्रता के लेबलिंग क्षेत्रों को एक अप्रत्याशित गैस रिसाव होना चाहिए।

2. मध्यम तैयारी

  1. Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM)/F12 माध्यम (HEPES और ग्लूटामीन के साथ) तैयार करें । क्रमशः 50 इकाइयों और 50 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए माध्यम में पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट जोड़ें। डीएमईएम/एफ 12 माध्यम युक्त एंटीबायोटिक्स को कम से कम 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) /F12 माध्यम (HEPES और ग्लूटामीन के साथ) में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 4% w/v जोड़ें ।
  3. सामान्य रूप से पीएच 7.6 के लिए, NaOH समाधान का उपयोग कर पीएच 7.4-7.8 करने के लिए माध्यम के पीएच समायोजित करें।
  4. स्टेप 1 में तैयार ग्लास ट्यूब में मीडियम डालें। अधिकतम घुलनशीलता के साथ समाधान प्राप्त करने के लिए, 3-15 एमएल माध्यम के अलावा की सिफारिश की जाती है।
  5. सोनीशन (इष्टतम: 20 मिनट से अधिक सोनीशन) द्वारा लिपिड को पूरी तरह से भंग करें। बीएसए और लिपिड भंग होने के बाद, नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और 2 महीने के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए। उपयोग से तुरंत पहले गल जाएं।
  6. डीएमईएम/एफ12 में इंसुलिन, ट्रांसफरिन, सोडियम सेलेनिट और इथेनॉल अमीन (आईटीएस-एक्स) मिश्रण के 1/1,000 जोड़ें। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर (संस्कृति मीडिया" के रूप में नामित) का उपयोग करके मिश्रित माध्यम को फ़िल्टर करें। उपयोग से पहले, प्रत्येक 3 एनजी/एमएल प्रत्येक की अंतिम एकाग्रता पर संस्कृति मीडिया में मानव स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) और मानव थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) जोड़ें। साइटोकिन्स और आईटीएस-एक्स को जोड़ने के बाद मीडियम को स्टोर नहीं किया जा सकता ।
  7. धुंधला बफर: सीए और एमजी-फ्री फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 10% एफसीएस जोड़ें। इस समाधान को 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. विगलन मीडिया: DMEM/F12 में 10% FCS जोड़ें । यह समाधान एकल उपयोग है।
  9. साइटोकिन स्टॉक समाधान: प्रत्येक मानव एससीएफ या मानव टीपीओ को पीबीएस (सीए-और एमजी-मुक्त) में 20 माइक्रोग्राम/एमएल पर भंग करें। इस समाधान को गतिविधि के नुकसान के बिना कम से कम एक वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एक बार गल जाने के बाद स्टॉक सॉल्यूशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 1 महीने के भीतर इस्तेमाल करें।
    नोट: बीएसए में संदूषकों में भिन्नता से बचने के लिए हर खरीद के बाद बहुत जांच करें। संस्कृति एचएससी एक ही समय में बीएसए के विभिन्न बैचों के साथ और 7 दिन में फेनोटाइपिक एचएससी संख्या की जांच के रूप में नीचे वर्णित है । यदि बीएसए बैच सीडी 34 + कोशिकाओं की कम संख्या या आवृत्ति दिखाता है (उदाहरण के लिए इनपुट कोशिकाओं की संख्या आधी से भी कम), तो इस बैच का उपयोग करने से बचें।

3. मानव अस्थि मज्जा सीडी 34+ कोशिकाओं की तैयारी

  1. मानव CD34+ बोन मैरो कोशिकाओं को खरीदें और उपयोग होने तक कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, एक स्वस्थ स्वयंसेवक या ताजा गर्भनाल रक्त कोशिकाओं से अस्थि मज्जा कोशिकाओं संस्थान नैतिक समिति और दाता सहमति द्वारा अनुमोदन पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 एमएल शंकु नली में 10 एमएल विगलन मीडिया गर्म करें।
  3. 2 मिनट के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में शीशियों में जमे हुए कोशिकाओं को पिघलाएं। संदूषकों को हटाने के लिए 70% इथेनॉल के साथ शीशी पोंछने के बाद, कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्व-गर्म माध्यम चरण 3.2 से होता है।
  4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 200 × जी पर 15 एमएल ट्यूब अपकेंद्रित्र। गोली को बरकरार रखने के लिए सुपरनेट सावधानी से एस्पिरेट करें (मध्यम के < 50 माइक्रोल छोड़ना)। शेष माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और उन्हें बर्फ पर 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: आंख या घायल ऊतक सहित म्यूकोसा में सीधे मानव-व्युत्पन्न नमूनों के संपर्क में जाना जाता है या अज्ञात रोगजनकों द्वारा संक्रमण का कारण बन सकता है; इस प्रकार, मानव कोशिकाओं को संभालते समय दस्ताने और चश्मा की सिफारिश की जाती है। यहां तक कि अगर खरीदा CD34+ कोशिकाओं हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (HCV), और मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस 1 (HIV1) के लिए नकारात्मक परीक्षण, सावधान निगरानी संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए अगर एक जोखिम घटना होती है । मानव कोशिकाओं के संपर्क में आने वाली सामग्रियों का निपटान करते समय संस्थागत दिशा-निर्देशों का पालन करें।

4. एचएससी छंटाई

  1. फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी वाली कोशिकाओं को लेबल करें। एंटी-सीडी 34-फिटसी के 50 माइक्रोन, एंटी-सीडी 38-परसीपी-Cy5.5 के 2 माइक्रोन, एंटी-सीडी 90-पीई-Cy7 के 5 माइक्रोन, और एंटी-सीडी 45RA-पीई के 10 माइक्रोन को मिलाएं। एंटीबॉडी मिश्रण में सेल पेलेट को फिर से रीसल्पेंड करें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. एंटीबॉडी धोने के लिए धुंधला बफर के 1 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 340 × ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
  3. 0.5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्पेंड करें बफर + 0.1% प्रोपिडियम आयोडाइड। निलंबन को 40 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. गेट PI के भीतर फेनोटाइपिक एचएससी-सीडी 34+सीडी 38-सीडी 90+सीडी 45RA- FACS Aria-IIIu का उपयोग कर अंश और संस्कृति मीडिया के 500 μL(चित्रा 3)से भरा एक 1.5 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को सॉर्ट करें। चित्रा 3में दिखाए गए गेटिंग रणनीति का उपयोग करना, सीडी 34+ कोशिकाओं का ~ 10% फेनोटाइपिक एचएससी होने की उम्मीद है। 5.3 चरण में कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए मीडिया की मात्रा की गणना करने के लिए सॉर्ट सेल नंबर रिकॉर्ड करें।
    नोट: गेटिंग रणनीति के रूप में पहले16 वर्णित किया जाता है, जबकि वंशावली मार्कर CD34 + CD38 में वंश मार्कर की कम अभिव्यक्ति को देखते हुए दाग-स्वस्थ व्यक्तियों से अंश17 ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 340 × ग्राम पर सॉर्ट्रफ्यूज करें और सुपरनैंट को त्यागें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि गोली बरकरार रहे, सावधानी से सुपरनेट को एस्पिएरेट करें।
  6. संस्कृति तक बर्फ पर हल कोशिकाओं को स्टोर करें।
    नोट: पहले प्रयोग के दौरान स्पेक्ट्रल ओवरलैप का फ्लोरेसेंस मुआवजा किया जाना चाहिए।

5. सेल संस्कृति

  1. स्टेटोकिन्स युक्त संस्कृति मीडिया के 200 माइक्रोन को फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेटों में स्थानांतरित करें।
  2. माध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए, सभी अप्रयुक्त कुओं को पीबीएस के 100-200 माइक्रोन से भरें।
  3. ६० कोशिकाओं/μL पर साइटोकिन्स के बिना संस्कृति मीडिया में हल एचएससी को फिर से खर्च करें ।
  4. Aliquot 600 HSCs/अच्छी तरह से (सेल निलंबन के 10 μL) प्रत्येक अच्छी तरह से । सेल नंबर बदला जा सकता है। ३०० से कम कोशिकाओं को बड़ा तकनीकी बदलाव के लिए नेतृत्व करेंगे, और इस तरह हालत प्रति अधिक कुओं जैविक मतभेदों का पता लगाने की जरूरत है । एक ही कुएं में १००० से अधिक कोशिकाओं को बनाने से बचना चाहिए क्योंकि साइटोकिन/पोषक तत्वों के अभाव या प्रतिकूल साइटोकिन्स/केमोकिन्स का संचय होना चाहिए ।
  5. संस्कृति एक आर्द्रीकृत बहु गैस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 और 1% O2 वातावरण में।
  6. 7 दिनों में संस्कृतियों के लिए, हर 3-4 दिनों में आधे मीडिया वॉल्यूम की जगह लेने की सिफारिश की जाती है। ध्यान से पिपटिंग द्वारा मीडिया के 100 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से साइटोकिन्स युक्त नए तैयार संस्कृति मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें। कल्चर मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-गरम किया जाना चाहिए।

6. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर मार्कर फेनोटाइप का विश्लेषण

नोट: हालांकि कोशिकाओं संस्कृति के 7 दिनों के बाद विश्लेषण किया जाना चाहिए, संस्कृति की अवधि बदला जा सकता है ।

  1. 8-चैनल पिपेट का उपयोग करके माध्यम के 170 माइक्रोल को त्यागें।
  2. कोशिकाओं को एंटीबॉडी मिश्रण के साथ लेबल करें। एंटी-सीडी 34-फिटसी का 0.5 माइक्रोन, एंटी-सीडी 38-परसीपी-सी5.5, 0.25 माइक्रोन का एंटी-सीडी 90-पीई-सी7, एंटी-सीडी45RA-पीई का 0.5 माइक्रोन, और 9 μ का μl मिलाएं। 96-वेल प्लेट में मिश्रण के 10 माइक्रोन जोड़ें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. एंटीबॉडी को धोने के लिए, कुओं में 100 माइक्रोन बफर जोड़ें और कम त्वरण और मध्यम मंदी का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर प्लेटों को अपकेंद्रित्र करें।
  4. कुओं के तल पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोल को सावधानीपूर्वक बढ़ा दें, फिर पीआई + 0.1% v/v के 200 माइक्रोल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें + फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर (जैसे, फ्लो-चेक फ्लोरो फ्लोरस्फीयर)।
  5. फ्लो साइटोमेट्री इंस्ट्रूमेंट सेट करें। 100 माइक्रोन की मात्रा पर मिश्रित नमूना मोड और तेज मात्रा के साथ फास्ट मोड में नमूनों के लिए डेटा प्राप्त करें।
  6. एफसीएस प्रारूप में डेटा का निर्यात करें और फ्लोजो जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इसका विश्लेषण करें। सेल संख्या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर मनका गिनती का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि शोधकर्ता प्रति अच्छी तरह से 2000 मोती जोड़ता है और मनका गिनती 700 है, तो प्रत्येक अंश की सेल संख्या को 2000/700 तक गुणा करें ताकि कुएं में अंश की कुल सेल संख्या का अनुमान लगाया जा सके।
    नोट: फ़ेल्डिहाइड की उपस्थिति के कारण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं। यह विश्लेषण के दौरान सेल मौत को प्रेरित कर सकता है। पूर्वाग्रह से बचने के लिए लगातार विश्लेषण किए गए कुओं (<50 कुओं) की संख्या को कम करें।

7. मानव HSCs का प्रत्यारोपण

नोट: सुसंस्कृत कोशिकाओं की पुनर्जनसंख्या गतिविधि इम्यूनो कमी चूहों को प्रत्यारोपण द्वारा मान्य कर रहे हैं । सभी प्रक्रियाओं को पशु प्रयोग समितियों या उनके समकक्ष द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए ।

  1. दानदाताओं के रूप में, 8-12 सप्ताह इम्यूनोडि से कम होने वाली एनवाईडी-इल2र्ग-नल (एनओजी) चूहों की पर्याप्त संख्या तैयार करें। जैसा कि एनओजी चूहों संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, प्रजनन पिंजरों को यथासंभव साफ रखें और चूहों को निष्फल आहार और पानी से खिलाएं।
  2. संस्कृति प्रत्यारोपण के लिए एचएससी की एक पर्याप्त संख्या के रूप में 5 कदम में वर्णित है । उदाहरण के लिए, जब 5000 एचएससी (दिन 0 समकक्ष) 6 प्राप्तकर्ता चूहों, संस्कृति 35,000-40,000 HSCs एक 96 अच्छी तरह से थाली के 40 कुओं में प्रत्यारोपित कर रहे हैं (संस्कृति मीडिया के प्रति अच्छी तरह से 200 μL) या एक 24 अच्छी तरह से थाली के 8 कुओं में (संस्कृति मीडिया के 1 ml प्रति अच्छी तरह) । संस्कृति आधा मीडिया के साथ 2 सप्ताह के लिए कोशिकाओं को हर 3-4 दिनों में एक आर्द्रीकृत बहु गैस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 और 1% O2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस परबदलताहै । संस्कृति की अवधि को बदला जा सकता है।
  3. प्रत्यारोपण से पहले 6-24 घंटे में 2.5 Gy पर विकिरण NOG चूहों।
  4. 1.5 एमएल ट्यूब में सुसंस्कृत एचएससी ले लीजिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 340 ×जी पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  5. सुपरनेटैंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और 5000 एचएससी (दिन 0 समकक्ष) प्रति 200 माइक्रोन के सेल घनत्व पर बाँझ बर्फ-ठंडे धुंधला बफर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। इस निलंबन को 3 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें। धुंधला बफर को स्टरलाइज करने के लिए, इसे 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
  6. प्रत्यारोपण से पहले, सेवोफ्लुरन या आइसोफ्लुने इनहेलेशन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  7. सुसंस्कृत एचएससी (दिन 0 समकक्ष) के 5000 प्रत्यारोपण करने के लिए, एक 1 मिलीएल सिरिंज और 27 गेज सुई का उपयोग कर चरण 7.1 में विकिरणित एनओजी चूहों के पूंछ नस या रेट्रो कक्षीय साइनस में सेल निलंबन के 200 μL इंजेक्ट करें। हौसले से अलग या गल अस्थि मज्जा HSCs एक नियंत्रण के रूप में प्रत्यारोपित किया जा सकता है । दस्ताने प्रत्येक प्रक्रिया के बीच ७०% v/v इथेनॉल के साथ निष्फल किया जाना चाहिए ।

8. परिधीय रक्त में मानव व्युत्पन्न कोशिकाओं की आवृत्ति का विश्लेषण

  1. मानव कोशिकाओं की पुनर्जनसंख्या की जांच करने के लिए, प्रत्यारोपण के बाद 1, 2 और 3 महीने में परिधीय रक्त एकत्र करें।
  2. परिधीय रक्त एकत्र करने से पहले, सेवोफ्लुरन साँस लेना द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  3. हेपरिनाइज्ड ग्लास केशिका ट्यूबों का उपयोग करके रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस से 40-80 माइक्रोन रक्त एकत्र करें और 1.5 एमएल ट्यूबों में पीबीएस + हेपरिन (1 यू/एमएल) के 1 एमएल में इस नमूने को निलंबित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 340 × जी पर रक्त निलंबन अपकेंद्रित्र। सुपरनैंट को त्यागें और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए पीबीएस + 1.2% डब्ल्यू/वी डेक्सट्रान (200 केडीए) के 1 मिलीलन में गोली को फिर से खर्च करें।
  5. सुपरनेट को 3 मिनट के लिए 340 × जी पर एक और 1.5 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में स्थानांतरित करें।
  6. लाल रक्त कोशिका लाइसिस के लिए, 0.17 एम एनएच4सीएल में कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए फिर से खर्च करें।
  7. सेंट्रलाइज सेल सस्पेंशन 340 × जी 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए। एंटी-माउस एफसी-ब्लॉक के 0.3 माइक्रोन युक्त धुंधला बफर के 50 माइक्रोल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। इस नमूने को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. सतह मार्कर धुंधला के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी जोड़ें: माउस CD45-PE-Cy7, 0.3μl माउस Ter-119-PE-Cy7 के 0.3 माइक्रोन, मानव सीडी 45-बीवी421 का 0.3 माइक्रोन, मानव सीडी 13-पीई का 0.3 माइक्रोन, मानव सीडी 33-पीई का 1.2 माइक्रोन, मानव सीडी 19-एपीसी का 0.3 माइक्रोन, मानव सीडी 3-एपीसी-साइ7 का 0.3 माइक्रोन। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 340 × जी पर धुंधला बफर और अपकेंद्रित्र के 1 एमएल के साथ एक बार धोएं।
  10. सुपरनेट को त्यागें और पीआई के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को धुंधला बफर + 0.1% v/v में फिर से खर्च करें।
  11. सेल निलंबन को 96-वेल फ्लैट-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें और मिक्स सैंपल मोड और 100 माइक्रोन की तेज मात्रा के साथ फास्ट मोड में प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें।
  12. फ्लोजो जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण के लिए एफसीएस प्रारूप में डेटा का निर्यात करें।
  13. फ्लो साइटोमीटर सेट करें। मिक्स सैंपल मोड पर और 100 माइक्रोन की तेज मात्रा के साथ फास्ट मोड में नमूनों के लिए डेटा प्राप्त करें।
  14. फ्लोजो जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण के लिए एफसीएस प्रारूप में डेटा का निर्यात करें।

Representative Results

शुद्ध HSCs की खेती के 7 दिनों के बाद, 80% कोशिकाओं ने CD34+CD38 के मार्कर फेनोटाइप प्रदर्शित किए- (चित्रा 4A)। कुल सेल संख्या साइटोकिन एकाग्रता(चित्रा 4B)पर निर्भर थी। एससीएफ और टीपीओ की उच्च सांद्रता ने सेल चक्र, प्रसार और भेदभाव(चित्रा 4B)में प्रवेश को प्रेरित किया। CD34+CD38 के मार्कर फेनोटाइप की विशेषता फेनोटाइप एचएससी की संख्या-सीडी 90+सीडी 45RA- एससीएफ या टीपीओ सांद्रता(चित्रा 4 बी)के अनुपात में बढ़ी, जबकि कुल कोशिकाओं के बीच आवृत्ति(चित्रा 4C)में कमी आई। कुल सेल नंबर १.५ एनजी/एमएल एससीएफ और 4 एनजी/एमएल टीपीओ और 3 एनजी/एमएल एससीएफ 3 और 2 एनजी/एमएल टीपीओ संयोजनों में बराबर थे, जिससे यह सुझाव मिलता है कि एचएससी न्यूनतम सेल चक्र सक्रियण के दौरान शांत हैं । व्यक्तिगत मतभेदों को देखते हुए, प्रत्येक बोन मैरो दाता के लिए साइटोकिन टिटरेशन की सिफारिश की जाती है।

सुसंस्कृत वयस्क अस्थि मज्जा HSCs के प्रत्यारोपण के 3 महीने के बाद, पुनर्गठन मानव CD45 + murine CD45-Ter119 कोशिकाओं के परिधीय रक्त में उनकी आवृत्ति के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है । CD19 + बी कोशिकाओं, CD13/CD33 + myeloid कोशिकाओं सहित तीन वंश, और CD3 + टी कोशिकाओं को नोग चूहों में पुनर्गठित किया गया या तो हौसले से गल HSCs या सुसंस्कृत HSCs(चित्रा 5)के साथ प्रत्यारोपित ।

Figure 1
चित्रा 1। प्रक्रिया का अवलोकन। प्रक्रिया के चित्रमय सारांश में मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) को छांटने, खेती करने और विश्लेषण करना शामिल था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। लिपिड समाधान से मेथनॉल को वाष्पित करने की प्रक्रिया। ए) गैस रेगुलेटर वाला नाइट्रोजन गैस सिलेंडर। ख) मेथनॉल में भंग लिपिड समाधान के माध्यम से नाइट्रोजन गैस पारित करने के लिए प्रक्रिया । ग) लिपिड ग्लास ट्यूब के नीचे का पालन करते हुए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। एचएससी छंटाई के लिए गेटिंग रणनीति। भूखंडों gated CD34+CD38-CD90+CD45RA- कोशिकाओं को दिखाते हैं। CD34+ कोशिकाओं का लगभग 10% फेनोटाइपिक एचएससी था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। 7 दिनों की खेती के बाद प्रतिनिधि सेल नंबर। ए) एससीएफ (3 एनजी/एमएल) और टीपीओ (2 एनजी/एमएल) में एचएससी की खेती के बाद प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई प्लॉट । अंश 1 जीवित कोशिकाओं के लिए समृद्ध किया गया था, अंश 2 मृत कोशिकाओं के लिए समृद्ध किया गया था, और अंश 3 मलबे के लिए समृद्ध किया गया था। गुलाबी रंग की संख्या आवृत्ति (%) गेटेड अंश का। B) सभी HSCs की संख्या, CD34+CD38- कोशिकाओं, और CD34+CD38-CD90+CD45RA- संकेत साइटोकिन स्थितियों के तहत 600 HSCs खेती के बाद कोशिकाओं। लाल धराशायी रेखाएं इनपुट कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या का संकेत देती हैं। एस: एससीएफ, टी: टीपीओ। मानक विचलन ± मतलब है, एन = 4। एस और टी के बाद की संख्या प्रत्येक साइटोकिन की एकाग्रता (एनजी/एमएल) का संकेत देती है । C) CD34+CD38 की आवृत्ति- और सीडी 34+सीडी 38-CD90+CD45RA- संकेत साइटोकिन स्थितियों के तहत कोशिकाओं। एस: एससीएफ, टी: टीपीओ। मानक विचलन ± मतलब है, एन = 4। एससीएफ (1 एनजी/एमएल) और टीपीओ (0 एनजी/एमएल) में सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए त्रुटि सलाखों को उनके उच्च मूल्यों (क्रमशः ३७.७ और ४७.९) के कारण छोड़ दिया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। प्रत्यारोपण के 3 महीने के बाद दाता चूहों के प्रतिनिधि FACS भूखंडों । कुल ५००० हौसले से गल (ऊपरी पैनल) और 2 सप्ताह के संस्कारी एचएससी (3 एनजी/एमएल एससीएफ और 3 एनजी/एमएल टीपीओ; लोअर पैनल) को नोग चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । HCD19 मानव बी कोशिकाओं को चिह्नित करता है, एचसीडी 13 और एचसीडी 33 मानव माइलॉयड कोशिकाओं को चिह्नित करता है, और एचसीडी 3 मानव टी कोशिकाओं को चिह्नित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हाल ही में, न्यूनतम भेदभाव के साथ एचएससी के विस्तार के लिए कई तरीकों की सूचना दी गई है18,19,20,21. हालांकि ये विधियां उत्कृष्ट हैं, एचएससी को साइटोकिन्स के उच्च स्तर की उपस्थिति में अपने सेल चक्रों को सक्रिय करने के लिए मजबूर किया जाता है, जो वीवो स्थिति में से अलग होता है जिसमें एचएससी न्यूनतम साइकिलिंग दिखाते हैं। यह प्रोटोकॉल एचएससी को शांत के रूप में बनाए रखने के लिए उपयोगी है, जैसा कि वीवो में मनाया जाता है, बोन मैरो माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से शुरू करके।

कम साइटोकिन, लिपिड-समृद्ध और हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत मानव एचएससी को बनाकर, एचएससी ने अपने मार्कर फेनोटाइप को बनाए रखते हुए न्यूनतम साइकिलिंग दिखाई। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हाइपोक्सिया (चरण 1, चरण 2, और चरण 4) के तहत फैटी एसिड और कोलेस्ट्रॉल और कम साइटोकिन सांद्रता और संस्कृति की उच्च एकाग्रता वाले माध्यम की तैयारी है। कोलेस्ट्रॉल और/या फैटी एसिड के बिना, कम साइटोकिन सांद्रता के तहत एचएससी की रखरखाव दर22कम हो जाती है । हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत कोशिकाओं की खेती भी महत्वपूर्ण है, जैसा कि पहले23बताया गया था ।

संस्कृति की स्थितियां साइटोकिन सांद्रता को छोड़कर, मुरीन एचएससी के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों के समान थीं। मुरीन एचएससी टीपीओ के बिना जीवित रहते हैं, जबकि मानव एचएससी को एससीएफ 22 के 3 एनजी/एमएल के साथ टीपीओ के कम से2एनजी/एमएल की आवश्यकता होती है । चूंकि टीपीओ की एकाग्रता मानव सीरम (~ 100 पीजी/एमएल) की तुलना में बहुत अधिक है, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली स्थितियां मानव एचएससी के अस्तित्व का समर्थन करने के लिए विशिष्ट कारकों को याद कर सकती हैं। FLT3 मानव एचएससीएस24पर व्यक्त किया गया है। इसके लिगांड FLT3LG के अलावा 22 एचएससी22को बनाए रखने के लिए टीपीओ के लिए आवश्यकता को थोड़ा कम कर देता है ।

मानव एचएससी को मुरीन एचएससी की तुलना में कोलेस्ट्रॉल की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है, संभवतः कोलेस्ट्रॉल संश्लेषित एंजाइमों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में असमर्थता और फैटी एसिड22के उच्च सांद्रता (>400 माइक्रोग्राम/एमएल) के तहत लिपोटॉक्सिकता के लिए संवेदनशीलता के कारण। यद्यपि केवल पामिटिक, ओलिक, लिनोलिक और स्टीरिक एसिड के संयोजन का परीक्षण किया गया था, जो मानव सीरम में प्रचुर मात्रा में पाए जाते हैं, लिपिड के अन्य संयोजनों का मूल्यांकन लिपोटॉक्सिकिटी को कम करने और कार्यात्मक एचएससी को बनाए रखने की दर में सुधार करने के लिए किया जाना चाहिए।

यद्यपि दो सप्ताह की संस्कृति के बाद इम्यूनोडिरकी चूहों में सुसंस्कृत मानव एचएससी की पुनर्जनसंख्या गतिविधि की पुष्टि की गई है22,यह संस्कृति प्रणाली वीवो में एचएससी के आला कार्यों को पूरी तरह से पुन: रीकैपिटल नहीं करती है। CD45RA की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है और पुनर्जनसंख्या क्षमता हौसले से हल किए गए एचएससीएस22से कम है । हालांकि, ग्लूकोज, अमीनो एसिड, पाइरुवेट और इंसुलिन जैसे पोषक तत्वों की सांद्रता, जो सुपराफिजियोलॉजिकल स्तर पर माध्यम में जोड़ी जाती है, अनुकूलित की जा सकती है। बीएसए में संदूषक एचएससी18,25के रखरखाव से भी समझौता करसकतेहैं . इसके अलावा, कुछ सुसंस्कृत कोशिकाओं को कोशिका मृत्यु से गुजरना पड़ता है, जबकि अन्य कोशिका विभाजन से गुजरते हैं; इस प्रकार, कुल सेल संख्या के रखरखाव प्रत्येक कोशिका की शांत स्थिति का संकेत नहीं हो सकता है।

इन सीमाओं के बावजूद, इस अध्ययन में विकसित प्रोटोकॉल में वर्णित संस्कृति की स्थिति एचएससी के अनुसंधान और इंजीनियरिंग को आगे बढ़ाने में मदद करेगी, विशेष रूप से लगभग शारीरिक परिस्थितियों में । संस्कृति की स्थिति है कि ंयूनतम भेदभाव और साइकिल चालन गतिविधि के साथ HSCs बनाए रखने के जैविक और रासायनिक विशेष रूप से HSCs पर अभिनय यौगिकों के परीक्षण के लिए उपयुक्त होगा, स्टेमनेस के नुकसान के बिना लेंटीवायरस ट्रांसडक्शन या जीनोम संपादन के माध्यम से HSCs हेरफेर, और ल्यूकेमिया से जुड़े जीन द्वारा प्रेरित परिवर्तन के प्रारंभिक कदम को स्पष्ट ।

Disclosures

लेखक इस अध्ययन से जुड़े हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम एम हरगुची और एस तामाकी को तकनीकी सहायता और प्रयोगशाला प्रबंधन और के शिरोशिता को फोटोग्राफ लेने के लिए धन्यवाद देते हैं । HK को एमईएक्सटी/जेएसपीएस (ग्रांट नंबर 19K17847) और नेशनल सेंटर फॉर ग्लोबल हेल्थ एंड मेडिसिन से काकेनही ग्रांट द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था । केटी को एमईएक्सटी/जेएसपीएस (अनुदान नग 18H02845 और 18K19570), नेशनल सेंटर फॉर ग्लोबल हेल्थ एंड मेडिसिन (अनुदान नग 26-001 और 19A2002), एएमईड (अनुदान नग) से KAKENHI अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । JP18ck0106444, JP18ae0201014, और JP20bm0704042), ओनो मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, कंजावा मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, और Takeda विज्ञान फाउंडेशन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human bone marrow CD34+ progenitor cells Lonza 2M-101C
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic In-Vivo Science Inc. https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) BD biosciences Cat# 560942; RRID: AB_10562559
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5  BD biosciences Cat# 551400; RRID: AB_394184
Anti-human CD45RA-PE BD biosciences Cat# 555489; RRID: AB_395880
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) BD biosciences Cat# 561558; RRID: AB_10714644
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) BioLegend Cat# 301703; RRID: AB_314179
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) BD biosciences Cat# 561816; RRID: AB_10896480
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) BioLegend Cat# 363005; RRID: AB_2564127
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) BD biosciences Cat# 561800; RRID: AB_10895381
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) BD biosciences Cat# 563880; RRID:AB_2744402
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) BioLegend Cat# 103114; RRID: AB_312979
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) BD biosciences Cat# 557853; RRID: AB_396898
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) BD Biosciences Cat# 553142; RRID: AB_394657
Phosphate buffered saline Nacalai Tesque Cat# 14249-24
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific Cat# 26140079
DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific Cat# 11320-033
ITS-X Thermo Fisher Scientific Cat# 51500056
Penicillin Meiji Seika PGLD755
Streptomycin sulfate Meiji Seika SSDN1013
Bovine serum albumin Sigma Aldrich Cat# A4503
Sodium palmitate Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cat# P0007
Sodium oleate Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cat# O0057
Cholesterol Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cat# C0318
Ammonium Chloride Fujifilm Cat# 017-2995
Sodium Hydrogen Carbonate Fujifilm Cat# 191-01305
EDTA 2Na Fujifilm Cat# 345-01865
Heparine Na MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. Cat# 224122557
Sevoflurane Fujifilm Cat# 193-17791
Dextran Nacalai Tesque Cat#  10927-54
Recombinant Human SCF PeproTech Cat# 300-07
Recombinant Human TPO PeproTech Cat# 300-18
Recombinant human Flt3 ligand PeproTech Cat# 300-19
Propidium iodide Life Technologies Cat# P3566
Flow-Check Fluorospheres Beckman Coulter Cat# 7547053
FlowJo version 10 BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
AutoMACS Pro Miltenyi Biotec N/A
FACS Aria3u BD Biosciences N/A
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) VELVO-CLEAR N/A
Nitrogen gas cylinder KOIKE SANSHO CO., LTD N/A
Gas regulator Astec Cat# IM-055
Multigas incubator Astec Cat# SMA-30DR
Glass tube, 16 mL Maruemu corporation N-16
Glass tube, 50 mL Maruemu corporation NX-50
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized Merck Millipore SLGPR33RS

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 171 हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल क्विसेंट फैटी एसिड कोलेस्ट्रॉल हाइपोक्सिया बोन मैरो माइक्रोएनवायरनमेंट
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Kobayashi, H., Takubo, K. A Culture… More

Kobayashi, H., Takubo, K. A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e61938, doi:10.3791/61938 (2021).

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