Summary
이 프로토콜은 풍부한 지방산, 콜레스테롤, 사이토카인의 낮은 농도 및 저산소증을 사용하여 골수 마이크로 환경을 모방하여 체외에서 정지한 인간 조혈 줄기 세포의 유지를 가능하게 합니다.
Abstract
인간 조혈 줄기 세포 (HSC), 다른 포유류 HSCs 처럼, 골수에 평생 조혈을 유지. HSC는 더 분화된 선조와는 달리 생체 내에서 정지 상태를 유지하고, 화학요법 또는 조사 후 급속히 세포 주기를 입력하여 골수 부상이나 체외 배양을 치료합니다. 풍부한 지방산, 콜레스테롤, 사이토카인의 낮은 농도 및 저산소증이 있는 골수 마이크로 환경을 모방함으로써 인간 HSC는 체외에서 퀴즈를 유지합니다. 여기서, 시험관내 의 정지 상태에서 기능성 HSC를 유지하기 위한 상세한 프로토콜이 설명된다. 이 방법은 생리적 조건하에서 인간 HSC의 행동에 대한 연구를 가능하게 할 것입니다.
Introduction
조혈 줄기 세포(HSC) 및 다능성 전구 세포(MpPs)는 인간1에서일생 동안 조혈을 유지하기 위해 분화 된 세포의 지속적인 보충을 위한 저장소를 조정하여 조정한다. 세포 주기 정지는 MPP2에서그들을 차별화하는 HSC의 눈에 띄는 기능입니다. 종래, HSC는 모든 분화 혈액 세포를 생산, 조혈 시스템의 계층 구조의 정점에 상주하는 것으로 생각된다. 이 계층적 모델은 대부분 이식 실험3에서추론되었다. 그러나, 최근 연구에 따르면 HSC의 역학은 이식 실험4,5,6,7에비해 생체 내에서 다르다. 여러 바코딩 시스템을 이용한 리니지 추적 실험은 표현형 모린 HSC가 안정된 상태 조혈증에 기여하는 독특한 세포 유형이 아니라 이식 설정 시 제한된 자기 재생 활동을 나타내는 MPP가 아니라 성숙한 혈액 세포4,5,8을지속적으로 공급한다는 것을 밝혔다. 대조적으로, 성숙세포에 대한 HSC의 기여는 골수 손상4후에 강화된다. 이것은 골수 이식을 포함하여 골수 절제 다음 미세 환경에 있는 급격한 변경에 기인할 지도 모릅니다. 인간 세포에 뮤린 세포의 계보 추적을 적용하는 것은 어렵지만, 단일 세포 유래 식민지 격리 및 전체 게놈 시퀀싱을 결합한 필로유전학 분석은 HSC와 MPP 가 성숙한 세포의 일일 생산을 담당하는 조혈 시스템의 유사한 특성을 밝혀냈습니다7. 따라서, 이식은 뮤린 또는 인간 HSC 활동을 검토하기 위해 필수적이지만, 다른 실험 모델은 생리적 조건하에서 HSC의 행동을 이해하기 위해 필요합니다.
HSC에 대한 배양 방법은 임상 응용 프로그램 및 특성을 이해하기 위해 자세히 연구되었습니다. 인간 HSC는 사이토카인의 조합을 사용하여 시험관 내에서 확장될 수 있고, 세포외 행렬의 재구성, 자기 재생 길항제의 제거, 중간엽 또는 내피 세포와의 공동 배양, 알부민 또는 그 교체, 자가 재생 전사 요인의 변환, 및 소분자 화합물9,10의첨가를 사용하여 확장될 수 있다. 이러한 방법 중 일부는 작은 화합물 SR111 및 UM17112의첨가를 포함하여 유망한 결과9를갖는 임상 시험에서 테스트되었습니다. 생체 내에서 HSC의 정지 특성을 고려, 최소한의 세포 사이클링으로 HSC를 유지하는 것은 시험관 내에서 HSC 행동을 다시 항복하는 데 중요합니다. 정지 및 증식 HSC는 차동 세포 주기항목(13,대사 상태14)및 다중 응력에 대한 내성(15)을 나타낸다. 체외에서 인간 HSC의 정지를 유지하는 데 사용되는 방법은 제한됩니다.
골수의 미세 환경(저산소및 지질이 풍부함)을 모방하고 사이토카인의 농도를 최적화함으로써 인간 HSC는 문화 하에서 차별화되지 않고 정지된 것을 유지할 수 있습니다. 체외에서 HSC의 정지 특성을 다시 수호하면 HsC의 안정적인 상태 특성에 대한 이해를 향상시키고 HSC의 실험적 조작을 가능하게 합니다.
Protocol
이 프로토콜은 국립 보건 의학 센터의 지침을 따릅니다. 쥐에 수행 된 모든 실험 절차는 글로벌 건강 및 의학 동물 실험위원회에 대한 국립 센터에 의해 승인됩니다.
참고: 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에설명되어 있습니다.
1. 지질 제제
- 표시된 농도의 유리 튜브에서 메탄올에 다음 지질을 녹입니다: 나트륨 팔미타트, 16 mg/mL; 나트륨 올레아테, 30 mg/mL; 콜레스테롤, 4 mg/mL. 지질 용액을 -30°C에 저장하고 사용하기 전에 샘플을 해동하십시오.
- 100 μg/mL 팔미타테, 100 μg/mL 올레아테, 20 μg/mL 콜레스테롤의 최종 농도를 얻는 데 필요한 용량으로 신선한 유리 튜브에서 1.1단계에서 제조된 지질 용액을 섞는다. 예를 들어, 배양 매체의 10mL를 준비할 때, 팔미타테 용액의 62.5 μL, 올레아테 용액33μL, 콜레스테롤 용액 50μL을 유리 튜브에 섞는다.
- 지질 용액(도2A 및 2B)을통해 질소 가스를 전달하여 메탄올을 증발시다. 질소 가스를 사용할 수 없는 경우 파이펫 보조를 사용하여 용액을 통해 공기를 전달합니다.
- 37°C(도2C)에서수조에서 유리튜브를 가열하여 남은 메탄올을 완전히 증발시다.
참고: 제한된 공간에서 고농도의N2 가스를 사용하는 것은 잠재적으로 해로울 수 있습니다. 메탄올을 증발시키는 프로토콜에 사용되는 부피는 제한되어 있어 안전하다고 여겨지지만, 방을 적절히 환기시키고 잠재적으로 고농도의N2 가스의 라벨링 영역은 예기치 않은 가스 누출이 발생할 경우 중요합니다.
2. 중간 준비
- Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)/F12 매체 (HEPES 및 글루타민)를 준비하십시오. 페니실린과 연쇄상 구균 황산염을 배지에 넣고 각각 50단위 및 50 μg/mL의 최종 농도를 가한다. 항생제를 함유하는 DMEM/F12 배지는 적어도 2개월 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- Dulbecco의 수정된 이글 매체(DMEM)/F12 매체(HEPES 및 글루타민)에 소 세럼 알부민(BSA)의 4%를 추가합니다.
- NaOH 용액을 사용하여 매체의 pH를 pH 7.4-7.8로 조정하여, 전형적으로 pH 7.6로 조정한다.
- 1단계에서 준비된 유리 튜브에 배지를 추가합니다. 최대 용해도가 있는 솔루션을 얻으려면 3-15mL 배지를 추가하는 것이 좋습니다.
- 초음파 처리로 지질을 완전히 녹입니다 (최적의 : 초음파 처리 20 분 이상). BSA와 지질이 용해된 후, 시료는 -80°C에 저장되고 2개월 이내에 사용해야 한다. 사용하기 직전에 해동하십시오.
- DMEM/F12에 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니트 나트륨 및 에탄올 아민(ITS-X) 혼합물의 1/1,000을 추가합니다. 0.22 μm 필터("배양 매체"로 지정)를 사용하여 혼합 배지를 필터링합니다. 사용하기 전에, 인간 줄기 세포 인자 (SCF) 및 인간 혈전포이에틴 (TPO)을 배양 배지에 각각 3 ng/mL의 최종 농도로 추가한다. 사이토카인과 ITS-X를 추가한 후 배지를 저장할 수 없습니다.
- 염색 버퍼: Ca-및 Mg 가성정제 식염수(PBS)에 10% FCS를 추가합니다. 이 용액은 2 주 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
- 해빙 미디어: DMEM/F12에 10% FCS를 추가합니다. 이 솔루션은 일회용입니다.
- Cytokine 스톡 솔루션: 20 μg/mL에서 PBS(Ca-및 Mg-free)에 각 인간 SCF 또는 인간 TPO를 용해합니다. 이 용액은 활동 손실없이 적어도 1 년 동안 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 해동후 후, 재고 용액을 4°C로 저장하고 1개월 이내에 사용하십시오.
참고: BSA의 오염 물질의 변동을 피하기 위해 모든 구매 후 로트 검사합니다. BSA의 다른 배치와 동시에 문화 HSC및 아래에 설명된 바와 같이 7일째에 표현형 HSC 번호를 검사합니다. BSA 배치가 CD34+ 셀의 낮은 수 또는 빈도(예: 입력 셀의 절반 미만)를 표시하는 경우 이 일괄 처리를 사용하지 마십시오.
3. 인간의 골수 CD34+ 세포의 준비
- 인간 CD34+ 골수 세포를 구입하고 사용까지 액체 질소에 세포를 저장합니다. 대안적으로, 건강한 자원 봉사자 또는 신선한 코드 혈액 세포에서 골수 세포는 연구소 윤리위원회와 기증자동의에 의해 승인에 의해 사용될 수 있습니다.
- 37°C 수조에서 15mL 원물 튜브에서 해동 매체의 따뜻한 10mL.
- 2 분 이내에 37 °C 수조에서 바이알에서 냉동 된 세포를 해동하십시오. 오염물질을 제거하기 위해 70% 에탄올로 바이알을 닦은 후, 3.2단계에서 미리 따뜻진 배지를 함유한 15mL 원물관으로 세포를 이송한다.
- 15mL 튜브의 원심분리기는 실온에서 15분 동안 200 × g로 원심분리합니다. 펠릿을 그대로 유지하기 위해 수퍼중을 조심스럽게 흡인하십시오(< 50 μL의 중간 크기). 나머지 배지로 세포를 다시 중단하고 얼음에 1.5 mL 튜브로 옮기.
참고: 눈 또는 상처받은 조직을 포함하여 점막에서 직접 인간 유래 견본에 노출은 알려지거나 알려지지 않은 병원체에 의하여 감염을 일으키는 원인이 될 수 있습니다; 따라서, 장갑과 안경은 인간의 세포를 취급할 때 추천됩니다. 구입한CD34+세포가 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV1)에 대해 음수를 테스트하더라도, 노출 발생률이 발생하면 제도적 지침에 따라 신중한 모니터링을 수행해야 한다. 인간 세포에 노출된 물질을 폐기할 때 제도적 지침을 따르십시오.
4. HSC 정렬
- 불소-공주 항체로 세포를 라벨. 염색 버퍼 50 μL과 안티 CD34-FITC의 10 μL, 안티 CD38-PerCP-Cy5.5의 2 μL, 안티 CD90-PE-Cy7의 5 μL, 및 안티 CD45RA-PE의 10 μL을 혼합합니다. 항체 혼합물에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 어둠 속에서 4 °C에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오.
- 항체를 세척하기 위해 염색 버퍼 1mL를 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 340 × g의 튜브를 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 염색 버퍼 + 0.1% 프로디듐 요오드의 0.5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 서스펜션을 40 μm 필터를 사용하여 5mL 튜브로 전송합니다.
- PI 내에서 페노티픽HSC를게이트 - CD34+CD38-CD90+CD45RA- FACS Aria-IIIu를 사용하여 분획과 배양 매체의 500 μL로 채워진 1.5 mL 튜브로 세포를 정렬(그림 3). 도 3에도시된 게이팅 전략을 사용하여 CD34+ 세포의 ~10%는 phenotypic HSC가 될 것으로 예상됩니다.
참고: 게이팅 전략은 건강한개인(17)으로부터 CD34+CD38-분획에서 계보 마커 염색을 생략하면서 이전에 설명된 바와 같이 수행된다. - 원심 분리기는 4°C에서 5분 동안 340 × g에서 정렬된 세포를 원심분리하고 상체를 폐기한다. 펠릿이 그대로 유지되도록 슈퍼네티드를 조심스럽게 흡인합니다.
- 정렬된 셀을 배양할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
참고: 스펙트럼 중복의 형광 보정은 첫 번째 실험 중에 수행해야 합니다.
5. 세포 배양
- 2단계에서 제조된 사이토카인을 함유한 배양 매체의 200 μL을 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮긴다.
- 매체의 증발을 피하려면 사용되지 않는 모든 우물을 PBS100-200 μL로 채웁니다.
- 60 세포 /μL에서 사이토카인없이 배양 매체에서 정렬 된 HSC를 다시 중단합니다.
- 각 우물에 알리쿼트 600 HSC/웰(셀 서스펜션 10μL). 셀 번호를 변경할 수 있습니다. 300개 미만의 세포는 더 큰 기술적 변화로 이어질 것이고, 따라서 조건당 더 많은 우물이 생물학적 차이를 검출하는 데 필요합니다. 단일 우물에서 1000 개 이상의 세포를 배양하는 것은 사이토카인 / 영양 부족 또는 불리한 사이토카인 / 케모킨의 축적으로 인해 피해야합니다.
- 5% CO2 및 1% O2 대기에서 37°C에서 가습된 다중 가스 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
- 7일 간 문화의 경우 3~4일마다 미디어 볼륨의 절반을 교체하는 것이 좋습니다. 조심스럽게 파이프팅하여 미디어의 100 μL을 흡인하고 각 우물에 사이토카인을 포함하는 새로 준비 된 문화 매체의 100 μL을 추가합니다. 문화 매체는 37°C에서 미리 데워져야 합니다.
6. 유동 세포형을 이용한 마커 표현형 분석
참고: 7일간의 배양 후에 세포를 분석해야 하지만 배양 기간을 변경할 수 있습니다.
- 8채널 파이펫을 사용하여 170 μL의 매체를 폐기하십시오.
- 항체 혼합물로 세포를 라벨로 지정합니다. 안티 CD34-FITC의 0.5 μL, 안티 CD38-PerCP-Cy5.5의 0.1 μL, 안티 CD90-PE-Cy7의 0.25 μL, 안티 CD45RA-PE의 0.5 μL, 그리고 잘 당 얼룩 버퍼의 9 μL을 혼합한다. 혼합물의 10 μL을 96웰 플레이트에 넣고 어둠 속에서 4°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
- 항체를 세척하려면, 낮은 가속 및 중간 감속을 사용하여 400 × g에서 플레이트에 스테인딩 버퍼 100 μL을 추가하고 원심분리기를 400 × g로 첨가한다.
- 조심스럽게 우물의 바닥에 세포를 유지하기 위해 상체의 100 μL을 흡인 한 다음, 염색 버퍼 + 0.1 % v / v의 200 μL에서 세포를 재중단 + 1 % v/ v의 PI + 1 % v / v형 마이크로 스피어 (예 : 흐름 검사 플루오로스스).
- 유동 세포측정기 설정. 100 μL의 혼합 샘플 모드와 섭취 볼륨을 사용하여 빠른 모드에서 샘플에 대한 데이터를 수집합니다.
- FCS 형식으로 데이터를 내보내고 FlowJo와 같은 소프트웨어를 사용하여 분석합니다. 세포 수는 형광 마이크로스피어 비드 수를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 연구원이 우물당 2000개의 구슬을 추가하고 비드 수가 700개인 경우 각 분획의 세포 수를 2000/700으로 곱하여 우물의 분획의 총 세포 수를 추정합니다.
참고: 형광 마이크로스피어는 포름알데히드의 존재 때문에 배양된 세포에 독성이 있다. 이 분석 하는 동안 세포 죽음을 유도할 수 있습니다. 편견을 피하기 위해 지속적으로 분석된 우물(<50웰)의 수를 최소화합니다.
7. 인간 HSC의 이식
참고: 배양된 세포의 재인구 활성은 면역결핍마우스에 이식하여 검증된다. 모든 절차는 동물 실험 위원회 또는 해당 절차에 의해 승인되어야 합니다.
- 기증자로서, 8-12주 면역절제 NOD-SCID-Il2rg-null(NOG) 마우스의 충분한 수를 준비한다. NOG 마우스는 감염에 매우 취약하기 때문에 사육 케이지를 가능한 한 깨끗하게 유지하고 살균 된 식단과 물로 마우스를 공급하십시오.
- 5단계에서 설명된 바와 같이 이식을 위한 충분한 수의 HSC를 배양한다. 예를 들어, 5000 HSC(0일 상당)가 6명의 수혜자 마우스에 이식될 때, 96웰 플레이트(웰당 문화매체 200μL) 또는 24웰 플레이트(웰당 문화미디어 1mL)의 8웰에서 40개의 우물에서 문화35,000-40,000 HsC를 배양한다. 반미디어로 2주 동안 의전을 맺은 세포는 37°C에서 가습된 다중 가스 인큐베이터에서 3-4일마다 변화하며, 5%의 CO 2 및 1%O2를 갖는다. 문화권 지속 시간을 변경할 수 있습니다.
- 이식 전 6-24h에서 2.5 Gy에서 NOG 마우스를 조사한다.
- 1.5mL 튜브에서 배양 된 HSC를 수집합니다. 4°C에서 5분 동안 340 ×g의 튜브원심분리기.
- 200 μL당 5000 HSC(일0 상당)의 세포 밀도에서 멸균 얼음-차가운 염색 버퍼에서 수퍼나츠를 조심스럽게 흡인시키고 세포를 재중단합니다. 염색 버퍼를 소독하려면 0.22 μm 필터를 사용하여 필터링합니다.
- 이식하기 전에 세보플루란 또는 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취시킵니다.
- 배양된 HSC(일00)를 이식하려면, 1mL 주사기 및 27게이지 바늘을 사용하여 7.1 단계에서 조사된 NOG 마우스의 꼬리 정맥 또는 레트로 궤도 부비동에 세포 현탁액의 200 μL을 주입한다. 새로 분리되거나 해동된 골수 HSC는 대조군으로 이식될 수 있다. 장갑은 각 절차 사이에 70 % v / v 에탄올로 살균해야합니다.
8. 말초 혈액에서 인간 유래 세포의 주파수 분석
- 인간 세포의 재수를 검사하기 위하여는, 이식 후에 1, 2 및 3 달에 말초 혈액을 수집합니다.
- 말초 혈액을 수집하기 전에 세보플루란 흡입으로 마우스를 마취시킵니다.
- 고원화 유리 모세관 튜브를 사용하여 복고풍 궤도 부비동에서 말초 혈액의 40-80 μL을 수집하고 1.5 mL 튜브에서 PBS + 헤파린 (1 U / mL)의 1 mL에서이 샘플을 일시 중단합니다.
- 4°C에서 3분 동안 340 × g의 혈액 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 실온에서 45 분 동안 PBS + 1.2 % w / v dextran (200 kDa)의 1 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
- 3 분 동안 340 × g에서 다른 1.5 mL 튜브 및 원심 분리기로 상체를 전송합니다.
- 적혈구 용해의 경우, 5 분 동안 0.17 M NH4Cl에서 세포를 다시 중단하십시오.
- 4°C에서 3분 동안 세포 현탁액 340 × g원심분리기. 항 마우스 Fc 블록의 0.3 μL을 포함하는 염색 버퍼의 50 μL에서 세포를 다시 중단합니다. 이 샘플을 4°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 표면 마커 염색을 위해 다음 항체를 추가하십시오: 마우스 CD45-PE-Cy7의 0.3 μL, 0.3 μL 마우스 Ter-119-PE-Cy7, 인간 CD45-BV421의 0.3 μL, 인간 CD13-PE의 0.3 μL, 인간 CD33-PE의 1.2 μL, 인간 CD19-APC의 0.3 μL, 인간 CD3-APC-Cy7의 0.3 μL. 세포를 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 염색 버퍼와 원심분리기 1mL로 한 번 340 × g에서 4°C에서 5분 간 세척하십시오.
- 상체를 버리고 염색 버퍼 + 0.1 % v /v의 PI의 200 μL에서 셀을 다시 중단하십시오.
- 셀 서스펜션을 96웰의 평평한 바닥 플레이트로 전송하고 혼합 샘플 모드와 100 μL의 섭취 량으로 빠른 모드에서 유동 사이토미터를 사용하여 데이터를 수집합니다.
- FlowJo와 같은 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 FCS 형식으로 데이터를 내보냅니다.
- 유동 세포계를 설정합니다. 믹스 샘플 모드와 100 μL의 섭취 량으로 빠른 모드에서 샘플에 대한 데이터를 수집합니다.
- FlowJo와 같은 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 FCS 형식으로 데이터를 내보냅니다.
Representative Results
정제된 HSC를 배양한 후, 세포의 최대 80%가 CD34+CD38의 마커 표현형을표시하였다- (도 4A). 총 세포 수는 사이토카인농도(도 4B)에의존하였다. SCF 및 TPO의 높은 농도는 세포 주기, 증식 및 분화(도4B)로의진입을 유도하였다. CD34 + CD38 -CD45RA-SCF 또는 TPO 농도(도4B)에비례하여 증가된 반면, 전체 세포 중 주파수가 감소하는 반면, CD34+ CD38-CD45RA의 마커 표현형을 특징으로 하는 표현형 HSC의 수는 감소하였다(도4C). 총 세포 수는 1.5 ng/mL SCF 및 4 ng/mL TPO 및 3 ng/mL SCF 3 및 2 ng/mL TPO 조합에서 동일했으며, 이는 HSC가 최소한의 세포 주기 활성화 중에 정지되어 있음을 시사합니다. 개별적인 다름을 감안할 때, 사이토카인 적정은 각 골수 기증자를 위해 추천됩니다.
배양 된 성인 골수 HSC의 이식 3 개월 후, 재구성은 인간 CD45 + murine CD45- Ter119- 세포의 말초 혈액에서 자신의 주파수로 평가 될 수있다. CD19+ B 셀, CD13/CD33+ 골수성 세포 및 CD3+ T 세포를 포함한 3개의 계보가 새롭게 해동된 HSC 또는 배양된 HSC(그림5)로이식된 NOG 마우스에서 재구성되었다.
그림 1. 절차 개요입니다. 절차의 그래픽 요약은 인간 조혈 줄기 세포 (HSC)를 분류, 배양 및 분석하는 관련시켰습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 지질 용액에서 메탄올을 증발하는 절차. A) 가스 레귤레이터가 있는 질소 가스 실린더. B) 메탄올에 용해된 지질 용액을 통해 질소 가스를 전달하는 절차. C) 유리 튜브의 바닥을 준수하는 지질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. HSC 를 정렬하기위한 게이팅 전략. 플롯은 게이트 CD34+CD38-CD90+CD45RA- 셀을 보여줍니다. CD34+ 세포의 약 10 %는 phenotypic HSC이었다.
그림 4. 배양 7 일 후 대표 세포 번호. A) SCF(3 ng/mL) 및 TPO(2 ng/mL)에서 HSC를 배양한 후 대표적인 형광 활성화 셀 정렬 플롯. 분획 1은 살아있는 세포를 위해 농축되었고, 분획 2는 죽은 세포를 위해 농축되었고, 분수 3은 이물질에 대해 농축되었다. 분홍색으로 칠해진 숫자는 빈도(%)를 나타냅니다. 게이트 된 분수의. B) 모든 HSC, CD34+CD38- 셀 및 CD38+CD38-CD90+CD45RA- 표시된 사이토카인 조건하에서 600 HSC를 배양한 후 셀의 수. 빨간색 파선선은 입력 셀의 초기 수를 나타냅니다. S: SCF, T: TPO. 표준 편차, n = 4를 ± 평균. S와 T에 따른 숫자는 각 사이토카인의 농도(ng/mL)를 나타낸다. C) CD34+CD38- 및 CD34+CD38-CD90+CD45RA- 표시된 사이토카인 조건 하에서 세포의 주파수. S: SCF, T: TPO. 표준 편차, n = 4를 ± 평균. SCF(1 ng/mL) 및 TPO(0 ng/mL)에서 배양된 셀에 대한 오차 막대는 각각 높은 값(37.7 및 47.9)으로 인해 생략되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 대표적인 FACS는 이식 3개월 후 기증자 마우스를 플롯합니다. 총 5000개의 갓 해동된(상부 패널)과 2주간 의 배양된 HSC(3ng/mL SCF 및 3ng/mL TPO; 하부 패널)가 NOG 마우스로 이식되었다. hCD19는 인간 B 세포를 표시, hCD13 및 hCD33 마크 인간의 골수성 세포, hCD3는 인간 T 세포를 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
최근에는 최소한의 분화를 통해 HSC를 확장하는 몇 가지 방법이18,19,20,21로보고되었다. 이러한 방법은 우수하지만, HSC는 HSC가 최소한의 사이클링을 보여주는 생체 내 상황과 는 다른 높은 수준의 사이토카인의 존재속에서 세포 주기를 활성화하도록 강요받습니다. 이 프로토콜은 골수 마이크로 환경을 재구성하여 생체 내에서 관찰된 바와 같이 HSC를 정지로 유지하는 데 유용합니다.
HSC는 낮은 사이토카인, 지질이 풍부하며 저산소 조건에서 인간 HSC를 배양함으로써 마커 표현형을 유지하면서 최소한의 사이클링을 보였습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 저산소증 하에서 고농도의 지방산과 콜레스테롤 및 저사이토카인 농도 및 배양을 포함하는 매체의 제조입니다(1단계, 2단계 및 4단계). 콜레스테롤 및/또는 지방산이 없으면 시토카인 농도가 낮은 HSC의 유지보수율은22로감소합니다. 저산소 조건 하에서 세포의 배양은 또한 중요합니다, 이전에 보고된 바와 같이23.
배양 조건은 사이토카인 농도를 제외하고, 뮤린 HSC에 사용되는 것과 유사했다. Murine HSC는 TPO없이 생존, 인간의 HSC는 SCF22의3 ng / mL와 TPO의 적어도 2 ng / mL을 필요로하는 반면. TPO의 농도가 인간 혈청(~100 pg/mL)보다 훨씬 높기 때문에, 이 프로토콜에 사용되는 조건은 인간 HSC의 생존을 지원하는 특정 요인을 누락할 수있다. 리간드 FLT3LG의 추가는 약간 HSC를 유지하기 위해 TPO에 대한 요구 사항을 감소22.
인간 HSC는 뮤린 HSC에 비해 콜레스테롤의 높은 농도를 필요로, 아마도 콜레스테롤 합성 효소의 발현을 유도하는 무능력과 지방산의 고농도 (>400 μg/mL) 지방산의 지방 독성에 감수성때문에 22. 팔미트, 올레릭, 리놀레릭 및 스테레산의 조합만 인체 혈청에서 풍부하게 발견되는 검사를 받았지만, 지질독성을 줄이고 기능성 HSC를 유지하는 속도를 향상시키기 위해 지질의 다른 조합을 평가해야 한다.
2주 간의 배양 후 면역형 마우스에서 배양된 인간 HSC의 재인구 활성이확인되었지만 22개의배양이 확인되었지만, 이 배양 시스템은 생체 내에서 HSC의 틈새 기능을 완전히 재구성하지 못하고 있다. CD45RA의 발현은 증가하는 것으로 보고되었으며, 재채우기 용량은 갓 분류된HSC(22)보다열등하다. 그러나, 포도당, 아미노산, 피루바테 및 인슐린과 같은 영양소의 농도는 수급생리학적 수준에서 배지에 첨가되어 최적화될 수 있다. BSA의 오염 물질은 HSC18,25의유지보수를손상시킬 수도 있다. 또한, 일부 배양 세포는 세포 죽음을 겪는 반면, 다른 세포 분열을 겪는다; 따라서, 총 세포 수의 유지 보수는 각 셀의 정지 상태를 나타내지 않을 수 있다.
이러한 제한에도 불구 하 고, 이 연구에서 개발 된 프로토콜에 설명 된 문화 조건 HSC의 연구 및 엔지니어링을 진행 하는 데 도움이 됩니다., 특히 거의 생리 조건 에서. 최소한의 분화 및 사이클링 활동으로 HSC를 유지하는 배양 조건은 특히 HSC에 작용하는 생물학적 및 화학 화합물을 테스트하고, 줄기의 손실없이 렌즈바이러스 변환 또는 게놈 편집을 통해 HSC를 조작하고, 백혈병 관련 유전자에 의해 유도된 변화의 초기 단계를 설명하는 데 적합할 것입니다.
Disclosures
저자는이 연구와 관련된 이해 상충을 선언합니다.
Acknowledgments
하라구치 M. M. 하라구치와 S. 다마키의 기술 지원 및 실험실 관리, K. 시로시타에게 사진 촬영을 해 주셔서 감사합니다. 홍콩은 MEXT/JSPS(19K17847 권부)와 국립 보건 의학 센터의 KAKENHI 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. KT는 MEXT/JSPS(교부금 18H02845 및 18K19570), 국립보건의료센터(교부금 26-001, 19A2002), AMED(보조금 노)의 지원을 받았다. JP18ck0106444, JP18ae0201014, JP20bm0704042), 오노 의료연구재단, 간자와 의료연구재단, 다케다사이언스재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
| NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
| Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
| Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
| Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
| Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
| Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
| Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
| Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
| Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
| Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
| Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
| Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
| Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
| DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
| Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
| Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
| Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
| Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
| Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
| Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
| EDTA 2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
| Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
| Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
| Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
| Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
| Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
| Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
| FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
| VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
| Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
| Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
| Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
| Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
| Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |
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