Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En kulturmetod för att upprätthålla quiescenta mänskliga hematopoetiska stamceller

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/61938

Summary

Detta protokoll möjliggör underhåll av quiescent mänskliga hematopoetiska stamceller in vitro genom att efterlikna benmärg mikromiljön med rikliga fettsyror, kolesterol, lägre koncentrationer av cytokiner och hypoxi.

Abstract

Mänskliga hematooetiska stamceller (HSCs), som andra däggdjur HSCs, upprätthåller livslång hematopoiesis i benmärgen. HSCs förblir quiescent in vivo, till skillnad från mer differentierade stamceller, och går snabbt in i cellcykeln efter kemoterapi eller bestrålning för att behandla benmärg skada eller in vitro kultur. Genom att efterlikna benmärgsmikromiljön i närvaro av rikliga fettsyror, kolesterol, låg koncentration av cytokiner och hypoxi, upprätthåller mänskliga HSCs quiescence in vitro. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för att upprätthålla funktionella HSCs i quiescent tillstånd in vitro. Denna metod kommer att möjliggöra studier av beteendet hos mänskliga HSCs under fysiologiska förhållanden.

Introduction

Hematoopoetiska stamceller (HSCs) och multipotenta stamceller (MPP) bildar koordinat en reservoar för kontinuerlig påfyllning av differentierade celler för att upprätthålla hematopoiesis under hela livet hos människor1. Cellcykel quiescence är en framträdande egenskap hos HSCs, skiljer dem från MPPs2. Konventionellt, HSCs tros bo i toppen av hierarkin i det hematopoetiska systemet, producerar alla differentierade blodkroppar. Denna hierarkiska modell härleddes mestadels från transplantation experiment3. Nyligen genomförda studier visade dock att dynamiken hos HSCs skiljer sig in vivo jämfört med dem i transplantationsexperiment4,5,6,7. Härstamning spårning experiment med flera barcoding system visade att fenotypiska murin HSCs inte är en unik celltyp som bidrar till steady-state hematopoiesis, och MPPs, som visar begränsad självförnyelse verksamhet vid transplantation inställningar, kontinuerligt leverera mogna blodkroppar4,5,8. Däremot förbättras HSCs bidrag till mogna celler efter benmärgsskada4. Detta kan hänföras till drastiska förändringar i mikromiljön efter benmärg ablation, inklusive benmärg transplantation. Även om det är svårt att tillämpa härstamning spårning av murin celler på mänskliga celler, visade fylogenetisk analys som kombinerar encellig koloni isolering och hela genom sekvensering en liknande egenskap hos det hematopoetiska systemet, där både HSCs och MPPs ansvarar för den dagliga produktionen av mogna celler7. Således, även om transplantation är avgörande för att undersöka murin eller mänsklig HSC-aktivitet, behövs andra experimentella modeller för att förstå HSCs beteenden under fysiologiska förhållanden.

Odlingsmetoder för HSCs har studerats i detalj för att förstå deras kliniska tillämpningar och egenskaper. Mänskliga HSCs kan utökas in vitro med hjälp av en kombination av cytokiner, rekonstitution av extracellulära matriser, avlägsnande av självförnyelseantagonister, samkultur med mesenkymala eller endotelceller, tillsats av albumin eller dess ersättning, transduktion av självförnyelse transkriptionsfaktorer och tillägg av småmolekylföreningar9,10. Några av dessa metoder, inklusive tillsats av små föreningar SR111 och UM17112,har testats i kliniska prövningar med lovande resultat9. Med tanke på HSCs quiescent natur in vivo, upprätthålla HSCs med minimal cell cykling är avgörande för att recapitulating HSC beteende in vitro. Quiescent och prolifererande HSCs uppvisar differentialcellcykelinmatning13,metabolisk status14, och tolerans mot flera påfrestningar15 . De metoder som används för att upprätthålla quiescence av mänskliga HSCs in vitro är begränsade.

Genom att efterlikna benmärgens mikromiljö (hypoxisk och rik på lipider) och optimera koncentrationen av cytokiner kan mänskliga HSCs bibehållas odifferentierade och quiescenta under kulturen. Att rekapitla HSCs quiescenta natur in vitro kommer att förbättra förståelsen av HSCs steady state-egenskaper och möjliggöra experimentell manipulering av HSC.

Protocol

Protokollet följer riktlinjerna från National Center for Global Health and Medicine. Alla experimentella procedurer som utförs på möss är godkända av National Center for Global Health and Medicine animal experiment committee.
Obs: En översikt över protokollet illustreras i figur 1.

1. Lipidpreparat

  1. Lös upp följande lipider i metanol i glasrör vid de angivna koncentrationerna: natriumpalmitat, 16 mg/ml; Natriumoleat, 30 mg/ml. och kolesterol, 4 mg/ml. Förvara lipidlösningen vid -30 °C och tina provet före användning.
  2. Blanda lipidlösningarna i steg 1.1 i ett färskt glasrör med de doser som krävs för att erhålla den slutliga koncentrationen av 100 μg/ml palmitat, 100 μg/mL-oleat och 20 μg/ml kolesterol. När du till exempel förbereder 10 ml odlingsmedier, blanda 62,5 μL palmitatlösning, 33 μL oljelösning och 50 μL kolesterollösning i glasröret.
  3. Avdunsta metanolen genom att överföra kvävegas genom lipidlösningen (figur 2A och 2B). Om kvävegas inte finns tillgänglig, för luft genom lösningen med hjälp av ett pipettstöd.
  4. Avdunsta helt den återstående metanolen genom att värma glasröret i ett vattenbad vid 37 °C (figur 2C).
    OBS: Användning av en hög koncentration av N2-gas i trånga utrymmen är potentiellt skadlig. Även om volymen som används i protokollet för att avdunsta metanol är begränsad och därmed anses vara säker, är det viktigt att ventilera rummet på ett adekvat sätt och märka områden med potentiellt höga koncentrationer av N2-gas om en oväntad gasläcka skulle uppstå.

2. Medelpreparering

  1. Förbered Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM)/F12 medium (med HEPES och glutamin). Tillsätt penicillin och streptomycinsulfat till mediet till den slutliga koncentrationen på 50 enheter respektive 50 μg/ml. DMEM/F12 medium som innehåller antibiotika kan förvaras vid 4 °C i minst 2 månader.
  2. Tillsätt 4 % w/v av bovint serumalbumin (BSA) till Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM)/F12 medium (med HEPES och glutamin).
  3. Justera pH-korten för mediet till pH 7,4-7,8 med NaOH-lösningen, vanligtvis till pH 7,6.
  4. Tillsätt mediet i glasröret som är förberett i steg 1. För att uppnå en lösning med maximal löslighet rekommenderas tillsats av 3-15 ml medium.
  5. Lös upp lipiderna helt genom ultraljudsbehandling (optimal: mer än 20 min ultraljudsbehandling). När BSA och lipider har lösts upp ska provet förvaras vid -80 °C och användas inom 2 månader. Tina omedelbart före användning.
  6. Tillsätt 1/1 000 av blandningen insulin, transferrin, natriumsyrit och etanolamin (ITS-X) till DMEM/F12. Filtrera det blandade mediet med hjälp av ett filter på 0,22 μm (betecknas som "odlingsmedier"). Före användning, tillsätt human stamcellsfaktor (SCF) och humant trombopoietin (TPO) till odlingsmedierna vid en slutlig koncentration på 3 ng/ml vardera. Efter tillsats av cytokinerna och ITS-X kan mediet inte lagras.
  7. Färgningsbuffert: Tillsätt 10% FCS till Ca- och Mg-fri fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Denna lösning kan förvaras vid 4 °C i 2 veckor.
  8. Upptiningsmedia: Lägg till 10% FCS till DMEM/F12. Denna lösning är engångslösning.
  9. Cytokinlagerlösning: Lös upp varje mänsklig SCF eller mänsklig TPO i PBS (Ca- och Mg-fri) vid 20 μg/ml. Denna lösning kan förvaras vid -80 °C i minst ett år utan förlust av aktivitet. När lagerlösningen har tinats upp ska den förvaras vid 4 °C och användas inom 1 månad.
    OBS: Undersök partiet efter varje köp för att undvika variation i föroreningarna i BSA. Kultur HSCs samtidigt med olika partier av BSA och undersöka fenotypiska HSC nummer på dag 7 som beskrivs nedan. Om en BSA-batch visar ett lågt antal eller en låg frekvens av CD34+-celler (t.ex. mindre än hälften av antalet indataceller) bör du undvika att använda den här batchen.

3. Beredning av human benmärg CD34+ celler

  1. Köp mänskliga CD34 + benmärgsceller och förvara cellerna i flytande kväve tills de används. Alternativt kan benmärgsceller från en frisk frivillig eller färsk sladd blodceller användas efter godkännande av institutets etiska kommitté och donator samtycke.
  2. Värm 10 ml upptiningsmedier i ett 15 ml koniskt rör i ett vattenbad på 37 °C.
  3. Tina de frusna cellerna i injektionsflaska i ett 37 °C vattenbad inom 2 minuter. Efter att flaskan torkats med 70% etanol för att avlägsna föroreningar, överför cellerna till det 15 ml koniska röret som innehåller det förvärmda mediet från steg 3.2.
  4. Centrifugera 15 ml-röret vid 200 × g i 15 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten försiktigt för att hålla pelleten intakt (< 50 μL medium). Återanvänd cellerna med det återstående mediet och överför dem till ett 1,5 ml-rör på is.
    OBS: Exponering för prover som härrör från människor direkt i slemhinnan, inklusive ögat eller skadad vävnad, kan orsaka infektion av kända eller okända patogener. Således rekommenderas handskar och glasögon vid hantering av mänskliga celler. Även om de köpta CD34+ -cellerna testar negativt för hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV) och humant immunbristvirus 1 (HIV1), bör noggrann övervakning utföras enligt institutionella riktlinjer om en exponeringsincidens inträffar. Följ de institutionella riktlinjerna när du kasserar material som exponeras för mänskliga celler.

4. Sortering av HSC

  1. Märk cellerna med fluorokromkonjugerade antikroppar. Blanda 50 μL färgbuffert plus 10 μL anti-CD34-FITC, 2 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL anti-CD90-PE-Cy7 och 10 μL anti-CD45RA-PE. Återanvänd cellpelleten i antikroppsblandningen. Inkubera cellerna i 30 min vid 4 °C i mörker.
  2. Tillsätt 1 ml färgbuffert för att tvätta antikropparna. Centrifugera rören vid 340 × g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernaten.
  3. Återanvänd cellpelleten i 0,5 ml färgbuffert + 0, 1% propidiumididid. Överför fjädringen till ett 5 ml-rör med ett filter på 40 μm.
  4. Gate de fenotypiska HSCs inom PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fraktion med FACS Aria-IIIu och sortera cellerna i ett 1,5 ml rör fyllt med 500 μL odlingsmedier (Figur 3). Med hjälp av gatingstrategin som visas i figur 3förväntas ~10 % av CD34+ -cellerna vara fenotypiska HSCs. Registrera det sorterade cellnumret för att beräkna medievolymen för att återanvända cellerna i steg 5.3.
    OBS: Gating-strategin utförs som beskrivits tidigare16 medan man utelämnar härstamningsmarkörens färgning med tanke på det låga uttrycket av härstamningsmarkörer i CD34 + CD38- fraktionen från friska individer17 .
  5. Centrifugera de sorterade cellerna vid 340 × g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten. Aspirera försiktigt supernaten för att säkerställa att pelleten förblir intakt.
  6. Förvara de sorterade cellerna på is tills kulturen.
    OBS: Fluorescenskompensation av spektral överlappning bör utföras under det första experimentet.

5. Cellkultur

  1. Överför 200 μL av odlingsmedierna som innehåller cytokiner beredda i steg 2 till plattbottnade 96-brunnsplattor.
  2. För att undvika avdunstning av mediet, fyll alla oanvända brunnar med 100-200 μL PBS.
  3. Återanvänd de sorterade HSCs i odlingsmedier utan cytokiner vid 60 celler/μL.
  4. Alikvot 600 HSC/brunn (10 μL cellfjädring) i varje brunn. Cellnumret kan ändras. Färre än 300 celler kommer att leda till större tekniska variationer, och därför behövs fler brunnar per tillstånd för att upptäcka biologiska skillnader. Odling av mer än 1000 celler i en enda brunn bör undvikas på grund av cytokin/ näringsbrist eller ackumulering av ogynnsamma cytokiner / kemokiner.
  5. Odla cellerna i en fuktad multigasinkubator vid 37 °C i en 5% CO2 och 1% O2 atmosfär.
  6. För kulturer över 7 dagar rekommenderas att ersätta hälften av medievolymen var 3-4 dagar. Aspirera försiktigt 100 μL media genom pipettning och tillsätt 100 μL nytillagade odlingsmedier som innehåller cytokiner till varje brunn. Kulturmedierna bör förvärmas vid 37 °C.

6. Analys av markör fenotyper med hjälp av flödescytometri

OBS: Även om cellerna ska analyseras efter 7 dagars kultur, kan kulturens varaktighet ändras.

  1. Kassera 170 μL av mediet med en 8-kanals pipett.
  2. Märk cellerna med antikroppsblandningen. Blanda 0,5 μL anti-CD34-FITC, 0,1 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 μL anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL anti-CD45RA-PE och 9 μL färgningsbuffert per brunn. Tillsätt 10 μL av blandningen till 96-brunnsplattan och inkubera cellerna i 30 minuter vid 4 °C i mörker.
  3. För att tvätta antikropparna, tillsätt 100 μL färgbuffert till brunnarna och centrifugera plattorna vid 400 × g i 5 min vid 4 °C med låg acceleration och medelinbromsning.
  4. Aspirera försiktigt 100 μL av supernatanten för att bibehålla cellerna på botten av brunnarna och återanvänd sedan cellerna i 200 μL färgbuffert + 0,1% v/v PI + 1% v/v fluorescerande mikrosfärer (t.ex. flödeskontroll fluorsfärer).
  5. Sätt upp flödescytometriinstrumentet. Hämta data för proverna i snabbt läge med blandat provläge på och upptagsvolymer på 100 μL.
  6. Exportera data i FCS-format och analysera dem med hjälp av programvara som FlowJo. Cellnummer kan bestämmas med hjälp av det fluorescerande antalet mikrosfärpärlor. Om forskaren till exempel lägger till 2000 pärlor per brunn och pärlräkningen är 700 multiplicerar du cellnumret för varje fraktion med 2000/700 för att uppskatta det totala cellnumret för fraktionen i brunnen.
    OBS: Fluorescerande mikrosfärer är giftiga för odlade celler på grund av närvaron av formaldehyd. Detta kan inducera celldöd under analysen. Minimera antalet brunnar (<50 brunnar) som analyseras kontinuerligt för att undvika partiskhet.

7. Transplantation av mänskliga HSCs

OBS: Återinsättning av odlade celler valideras genom transplantation till immunbristmöss. Alla förfaranden måste godkännas av djurförsökskommittéer eller deras motsvarigheter.

  1. Som givare, förbered ett tillräckligt antal 8-12-veckors immunbrist NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) möss. Eftersom NOG-möss är mycket mottagliga för infektion, håll avelsburarna så rena som möjligt och mata mössen med en steriliserad kost och vatten.
  2. Kultur ett tillräckligt antal HSCs för transplantation enligt beskrivningen i steg 5. Till exempel, när 5000 HSCs (dag 0 ekvivalent) transplanteras till 6 mottagare möss, kultur 35.000-40.000 HSCs i 40 brunnar av en 96-brunn pläterar (200 μL av kulturmedier per brunn) eller i 8 brunnar av en 24-brunn pläterar (1 mL av kulturmedier per brunn). Odla cellerna i 2 veckor med halvmediaförändringar var 3-4 dagar i en fuktad multigasinkubator vid 37 °C med 5% CO2 och 1% O2. Kulturens varaktighet kan ändras.
  3. Bestråla NOG möss vid 2,5 Gy vid 6-24 h före transplantation.
  4. Samla de odlade HSCs i 1,5 ml rör. Centrifugera rören vid 340 ×g i 5 min vid 4°C.
  5. Aspirera försiktigt supernatanterna och återanvänd cellerna i steril iskyll färgningsbuffert med en celltäthet på 5000 HSC (dag 0 motsvarande) per 200 μL. Överför denna suspension till 3 mL polypropylenrör. För att sterilisera färgbufferten, filtrera den med ett filter på 0,22 μm.
  6. Före transplantation, bedöva mössen genom sevofluran eller isofluran inandning.
  7. För att transplantera 5000 odlade HSCs (dag 0 motsvarande), injicera 200 μL av cellfjädringen i svans venen eller retro orbital sinus av NOG möss bestrålade i steg 7.1 med en 1 ml spruta och 27-gauge nål. Nyisolerade eller tinade benmärgs HSCs kan transplanteras som en kontroll. Handskar bör steriliseras med 70% v/v etanol mellan varje procedur.

8. Analys av frekvensen av celler som härrör från människor i perifert blod

  1. För att undersöka återpopulationen av mänskliga celler, samla perifert blod vid 1, 2 och 3 månader efter transplantation.
  2. Innan du samlar in perifert blod, bedöva mössen genom sevofluraninandning.
  3. Samla upp 40-80 μL perifert blod från den retro-orbitala sinusen med hepariniserade kapillärrör i glas och suspendera detta prov i 1 ml PBS + heparin (1 U/ml) i 1,5 ml rör.
  4. Centrifugera blodsuspensionen vid 340 × g i 3 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) i 45 min vid rumstemperatur.
  5. Överför supernatanten till ett annat 1,5 ml-rör och centrifugera vid 340 × g i 3 min.
  6. För röda blodkroppar lysis, återanvänd cellerna i 0,17 M NH4Cl i 5 min.
  7. Centrifugera cellfjädringen 340 × g i 3 min vid 4 °C. Återanvänd cellerna i 50 μL färgbuffert som innehåller 0,3 μL antimus-fc-block. Inkubera provet vid 4 °C i 5 minuter.
  8. Tillsätt följande antikroppar för färgning av ytmarkörer: 0,3 μL mus CD45-PE-Cy7, 0,3 μL mus Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL human CD45-BV421, 0,3 μL human CD13-PE, 1,2 μL human CD33-PE, 0,3 μL human CD19-APC, 0,3 μL human CD3-APC-Cy7. Inkubera cellerna vid 4 °C i 15 minuter.
  9. Tvätta en gång med 1 ml färgbuffert och centrifugera vid 340 × g i 5 min vid 4 °C.
  10. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 200 μL färgbuffert + 0,1 % v/v pi.
  11. Överför cellfjädringen till en 96-brunns platt bottenplatta och få data med flödescytometern i snabbt läge med blandningsprovläget på och en upptagsvolym på 100 μL.
  12. Exportera data i FCS-format för analys med hjälp av programvara som FlowJo.
  13. Sätt upp flödescytometern. Hämta data för proverna i snabbt läge med blandningsprovläget på och en upptagsvolym på 100 μL.
  14. Exportera data i FCS-format för analys med hjälp av programvara som FlowJo.

Representative Results

Efter 7 dagars odling av de renade HSCs visade upp till 80% av cellerna markör fenotyper av CD34+CD38- (Figur 4A). Det totala cellnumret berodde på cytokinkoncentrationen (figur 4B). Högre koncentrationer av SCF och TPO inducerad inträde i cellcykeln, spridning och differentiering(figur 4B). Antalet fenotypiska HSCsom kännetecknas av markör fenotyperna CD34+CD38-CD90+CD45RA - ökade i proportion till SCF- eller TPO- koncentrationerna (figur 4B), medan frekvensen mellan de totala cellerna minskade (figur 4C). Totala cellnummer var lika i kombinationerna 1,5 ng/mL SCF och 4 ng/mL TPO och 3 ng/mL SCF 3 och 2 ng/mL TPO, vilket tyder på att HSC är quiescent under minimal cell cykeln aktivering. Med tanke på de individuella skillnaderna rekommenderas cytokintitrering för varje benmärgsdonator.

Efter 3 månaders transplantation av odlade vuxna benmärg HSCs, rekonstitution kan utvärderas som deras frekvens i perifert blod av mänskliga CD45 + murin CD45- Ter119- celler. Tre härstamningar, inklusive CD19+ B-celler, CD13/CD33+ myeloiska celler, och CD3+ T-celler rekonstituerades i NOG-möss som transplanterats med antingen ny tinade HSC eller odlade HSC(figur 5).

Figure 1
Figur 1. Översikt över förfarandet. Grafisk sammanfattning av förfarandet omfattade sortering, odling och analys av mänskliga hematopoetiska stamceller (HSCs). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. Förfarande för att avdunsta metanol från lipidlösningen. A) Kvävegasflaska med gasregulator. B) Förfarande för överföring av kvävegas genom lipidlösningen upplöst i metanol. C) Lipider som fastnar på botten av glasröret. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3. Gating strategi för sortering av HSCs. Tomterna visar gated CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler. Cirka 10% av CD34+ celler var fenotypiska HSCs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Representativa cellnummer efter 7 dagars odling. A) Representativt fluorescensaktiverat cellsorteringsdiagram efter odling av HSC i SCF (3 ng/mL) och TPO (2 ng/ml). Fraktion 1 berikades för levande celler, fraktion 2 berikades för döda celler och fraktion 3 berikades för skräp. Siffror färgade i rosa indikerar frekvensen (%) av den inhägnade fraktionen. B) Antal alla HSCs, CD34+CD38- celler och CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler efter odling av 600 HSCs under de angivna cytokinförhållandena. Röda streckade linjer anger det ursprungliga antalet indataceller. S: SCF, T: TPO. Medelvärde ± standardavvikelse, n = 4. Siffror efter S och T anger koncentrationen (ng/mL) av varje cytokin. C) Frekvens av CD34+CD38- och CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler under de angivna cytokinförhållandena. S: SCF, T: TPO. Medelvärde ± standardavvikelse, n = 4. Felstaplarna för celler som odlades i SCF (1 ng/mL) och TPO (0 ng/mL) utelämnades på grund av deras höga värden (37,7 respektive 47,9). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5. Representativa FACS-tomter av donatormöss efter 3 månaders transplantation. Totalt 5000 ny tinade (övre paneler) och 2-veckors odlade HSCs (3 ng/mL SCF och 3 ng/mL TPO; nedre paneler) transplanterades till NOG möss. hCD19 markerar mänskliga B-celler, hCD13 och hCD33 markerar mänskliga myeloiska celler, och hCD3 markerar mänskliga T-celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Nyligen har flera metoder för att expandera HSCs med minimal differentieringrapporterats 18,19,20,21. Även om dessa metoder är utmärkta, tvingas HSCs att aktivera sina cellcykler i närvaro av höga nivåer av cytokiner, som skiljer sig från in vivo-situationen där HSCs visar minimal cykling. Detta protokoll är användbart för att upprätthålla HSCs som quiescent, som observerats in vivo, genom att rekapitla benmärg microenvironment.

Genom att odla mänskliga HSCs under låg cytokin, lipid-rika och hypoxic villkor, HSCs visade minimal cykling samtidigt upprätthålla sin markör fenotyper. Det kritiska steget i detta protokoll är beredning av medium som innehåller en hög koncentration av fettsyror och kolesterol och låga cytokinkoncentrationer och kultur under hypoxi (steg 1, steg 2 och steg 4). Utan kolesterol och/eller fettsyror minskar underhållsgraden för HSC under låga cytokinkoncentrationer22. Odling av celler under hypoxiska förhållanden är också viktigt, som rapporterats tidigare23.

Odlingsförhållandena liknade dem som användes för murin HSCs, med undantag för cytokinkoncentrationerna. Murine HSCs överlever utan TPO, medan mänskliga HSCs kräver minst 2 ng/mL TPO med 3 ng/ml SCF22. Eftersom koncentrationen av TPO är mycket högre än i humant serum (~100 pg/ml) kan de villkor som används i detta protokoll sakna särskilda faktorer för att stödja överlevnaden av mänskliga HSC. FLT3 uttrycks på mänskliga HSC24. Tillägg av sin ligand FLT3LG minskar något kravet på att TPO ska behålla HSCs22.

Mänskliga HSCs kräver högre koncentrationer av kolesterol jämfört med murin HSCs, förmodligen på grund av oförmågan att inducera uttryck av kolesterol-syntetiserande enzymer och mottaglighet för lipotoxicity under höga koncentrationer (>400 μg/mL) avfettsyror 22. Även om endast kombinationen av palmitiska, oljeiska, linoleiska och steariska syror testades, som finns rikligt i det mänskliga serumet, bör andra kombinationer av lipider utvärderas för att minska lipotoxicity och förbättra hastigheten för att upprätthålla funktionella HSCs.

Även om återpopulationsaktiviteten hos odlade mänskliga HSCs hos immunbristmöss efter två veckors kultur harbekräftats 22,rekapitulerar detta kultursystem inte helt HSCs nischfunktioner in vivo. Uttrycket för CD45RA har rapporterats öka och återbefolkningskapaciteten är sämre än för nysorterade HSC22. Koncentrationerna av näringsämnen, såsom glukos, aminosyra, pyruvat och insulin, som tillsätts mediet på suprafysiologiska nivåer, kan dock optimeras. Föroreningar i BSA kan också äventyra underhållet av HSCs18,25. Dessutom genomgår vissa odlade celler celldöd, medan andra genomgår celldelning. Således kan underhållet av det totala cellnumret inte ange varje cells quiescenta status.

Trots dessa begränsningar kommer de kulturförhållanden som beskrivs i protokollet som utvecklats i denna studie att bidra till att främja forskning och teknik för HSCs, särskilt under nästan fysiologiska förhållanden. Odlingsförhållanden som upprätthåller HSCs med minimal differentiering och cykling verksamhet skulle vara lämpliga för att testa biologiska och kemiska föreningar specifikt verkar på HSCs, manipulera HSCs via lentivirus transduktion eller genomredigering utan förlust av stemness och klargöra det första steget av omvandling framkallas av leukemi-associerade gener.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt i samband med denna studie.

Acknowledgments

Vi tackar M. Haraguchi och S. Tamaki för teknisk support och laboratoriehantering och K. Shiroshita för att ha fotograferat. HK stöddes delvis av KAKENHI-bidraget från MEXT/JSPS (bidrag nr 19K17847) och National Center for Global Health and Medicine. KT stöddes delvis av KAKENHI Grants från MEXT/JSPS (bidrag nr 18H02845 och 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (bidrag nr 26-001 och 19A2002), AMED (bidragsnr. JP18ck0106444, JP18ae0201014 och JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation och Takeda Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human bone marrow CD34+ progenitor cells Lonza 2M-101C
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic In-Vivo Science Inc. https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) BD biosciences Cat# 560942; RRID: AB_10562559
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5  BD biosciences Cat# 551400; RRID: AB_394184
Anti-human CD45RA-PE BD biosciences Cat# 555489; RRID: AB_395880
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) BD biosciences Cat# 561558; RRID: AB_10714644
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) BioLegend Cat# 301703; RRID: AB_314179
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) BD biosciences Cat# 561816; RRID: AB_10896480
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) BioLegend Cat# 363005; RRID: AB_2564127
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) BD biosciences Cat# 561800; RRID: AB_10895381
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) BD biosciences Cat# 563880; RRID:AB_2744402
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) BioLegend Cat# 103114; RRID: AB_312979
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) BD biosciences Cat# 557853; RRID: AB_396898
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) BD Biosciences Cat# 553142; RRID: AB_394657
Phosphate buffered saline Nacalai Tesque Cat# 14249-24
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific Cat# 26140079
DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific Cat# 11320-033
ITS-X Thermo Fisher Scientific Cat# 51500056
Penicillin Meiji Seika PGLD755
Streptomycin sulfate Meiji Seika SSDN1013
Bovine serum albumin Sigma Aldrich Cat# A4503
Sodium palmitate Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cat# P0007
Sodium oleate Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cat# O0057
Cholesterol Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cat# C0318
Ammonium Chloride Fujifilm Cat# 017-2995
Sodium Hydrogen Carbonate Fujifilm Cat# 191-01305
EDTA 2Na Fujifilm Cat# 345-01865
Heparine Na MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. Cat# 224122557
Sevoflurane Fujifilm Cat# 193-17791
Dextran Nacalai Tesque Cat#  10927-54
Recombinant Human SCF PeproTech Cat# 300-07
Recombinant Human TPO PeproTech Cat# 300-18
Recombinant human Flt3 ligand PeproTech Cat# 300-19
Propidium iodide Life Technologies Cat# P3566
Flow-Check Fluorospheres Beckman Coulter Cat# 7547053
FlowJo version 10 BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
AutoMACS Pro Miltenyi Biotec N/A
FACS Aria3u BD Biosciences N/A
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) VELVO-CLEAR N/A
Nitrogen gas cylinder KOIKE SANSHO CO., LTD N/A
Gas regulator Astec Cat# IM-055
Multigas incubator Astec Cat# SMA-30DR
Glass tube, 16 mL Maruemu corporation N-16
Glass tube, 50 mL Maruemu corporation NX-50
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized Merck Millipore SLGPR33RS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scala, S., Aiuti, A. In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions. Blood Advances. 3, (12), 1916-1924 (2019).
  2. Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. Awakening dormant haematopoietic stem cells. Nature Reviews Immunology. 10, (3), 201-209 (2010).
  3. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553, (7689), 418-426 (2018).
  4. Sun, J., et al. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 514, (7522), 322-327 (2014).
  5. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518, (7540), 542-546 (2015).
  6. Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, (7724), 473-478 (2018).
  7. Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, (9), 2308-2316 (2018).
  8. Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis. Nature. 553, (7687), 212-216 (2018).
  9. Pineault, N., Abu-Khader, A. Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation. Experimental Hematology. 43, (7), 498-513 (2015).
  10. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21, (9), 541-554 (2020).
  11. Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18, (1), 144-155 (2016).
  12. Cohen, S., et al. Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study. Lancet Haematology. 7, (2), 134-145 (2020).
  13. Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16, (3), 302-313 (2015).
  14. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (4), 243-256 (2014).
  15. Mendelson, A., Frenette, P. S. Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration. Nature Medicine. 20, (8), 833-846 (2014).
  16. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1, (6), 635-645 (2007).
  17. Xie, W., et al. Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes. Cytometry A. 77, (9), 840-848 (2010).
  18. Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571, (7763), 117-121 (2019).
  19. Bai, T., et al. Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel. Nature Medicine. 25, (10), 1566-1575 (2019).
  20. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, (5997), 1345-1348 (2010).
  21. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345, (6203), 1509-1512 (2014).
  22. Kobayashi, H., et al. Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Cell Reports. 28, (1), 145-158 (2019).
  23. Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions. Journal of Clinical Investigation. 112, (1), 126-135 (2003).
  24. Kikushige, Y., et al. Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival. Journal of Immunology. 180, (11), 7358-7367 (2008).
  25. Ieyasu, A., et al. An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors. Stem Cell Reports. 8, (3), 500-508 (2017).
En kulturmetod för att upprätthålla quiescenta mänskliga hematopoetiska stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, H., Takubo, K. A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e61938, doi:10.3791/61938 (2021).More

Kobayashi, H., Takubo, K. A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e61938, doi:10.3791/61938 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter