Summary
Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung von ruhenden humanen hämatopoetischen Stammzellen in vitro, indem die Mikroumgebung des Knochenmarks mit reichlich Fettsäuren, Cholesterin, niedrigeren Konzentrationen von Zytokinen und Hypoxie imitiert wird.
Abstract
Menschliche hämatopoetische Stammzellen (HSCs) halten wie andere Säugetier-HSCs lebenslange Hämatopoese im Knochenmark aufrecht. HSCs bleiben im Gegensatz zu differenzierten Vorläufern ruhig in vivo und treten nach Chemotherapie oder Bestrahlung schnell in den Zellzyklus ein, um Knochenmarkverletzungen oder In-vitro-Kultur zu behandeln. Durch die Nachahmung der Knochenmark-Mikroumgebung in Gegenwart von reichlich Fettsäuren, Cholesterin, niedrige Konzentration von Zytokinen, und Hypoxie, menschliche HSCs halten Ruhe in vitro. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Aufrechterhaltung funktioneller HSCs im Ruhezustand in vitro beschrieben. Diese Methode ermöglicht Studien über das Verhalten menschlicher HSCs unter physiologischen Bedingungen.
Introduction
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) und multipotente Vorläuferzellen (MPPs) bilden koal ein Reservoir für die kontinuierliche Auffüllung differenzierter Zellen, um die Hämatopoese im Laufe des Lebens beim Menschen aufrechtzuerhalten1. Zellzyklus-Ruhe ist ein herausragendes Merkmal von HSCs, das sie von MPPs2unterscheidet. Konventionell, HSCs werden gedacht, um an der Spitze der Hierarchie des hämatopoetischen Systems zu residieren, produzieren alle differenzierten Blutzellen. Dieses hierarchische Modell wurde hauptsächlich aus Transplantationsexperimentenabgeleitet 3. Jüngste Studien zeigten jedoch, dass sich die Dynamik von HSCs in vivo im Vergleich zu denen in Transplantationsexperimenten4,5,6,7unterscheidet. Lineage-Tracing-Experimente mit mehreren Barcoding-Systemen ergaben, dass phänotypische murine HSCs kein einzigartiger Zelltyp sind, der zu stationärer Hämatopoese beiträgt, und MPPs, die eine begrenzte Selbsterneuerungsaktivität bei Transplantationseinstellungen zeigen, kontinuierlich reife Blutzellen4,5,8liefern. Im Gegensatz dazu wird der Beitrag von HSCs zu reifen Zellen nach einer Knochenmarkverletzung verbessert4. Dies kann auf drastische Veränderungen in der Mikroumgebung nach Knochenmarkablation, einschließlich Knochenmarktransplantation, zurückgeführt werden. Obwohl die Anwendung der Linienverfolgung von murinen Zellen auf menschliche Zellen schwierig ist, ergab die phylogenetische Analyse, die die einzellige Kolonieisolation und die vollständige Genomsequenzierung kombiniert, eine ähnliche Eigenschaft des hämatopoetischen Systems, in dem sowohl HSCs als auch MPPs für die tägliche Produktion von reifen Zellen verantwortlich sind7. Obwohl die Transplantation für die Untersuchung der murinen oder menschlichen HSC-Aktivität unerlässlich ist, sind andere experimentelle Modelle erforderlich, um das Verhalten von HSCs unter physiologischen Bedingungen zu verstehen.
Culturing-Methoden für HSCs wurden im Detail untersucht, um ihre klinischen Anwendungen und Eigenschaften zu verstehen. Humane HSCs können in vitro mit einer Kombination von Zytokinen, Rekonstitution von extrazellulären Matrizen, Entfernung von Selbsterneuerungsantagonisten, Kokultur mit mesenchymalen oder endotheliale Zellen, Zugabe von Albumin oder dessen Ersatz, Transduktion von Selbsterneuerungs-Transkriptionsfaktoren und Zugabe von Kleinmolekülverbindungen9,10erweitert werden. Einige dieser Methoden, einschließlich der Zugabe von kleinen Verbindungen SR111 und UM17112, wurden in klinischen Studien mit vielversprechenden Ergebnissen getestet9. Angesichts der Ruhevon HSCs in vivo ist die Aufrechterhaltung von HSCs mit minimalem Zellzyklus entscheidend für die Rekapitulation des HSC-Verhaltens in vitro. Ruhe- und proliferierende HSCs weisen Differentialzellzykluseintrag13, Stoffwechselstatus14und Toleranz gegenüber mehrfachen Spannungen15 auf. Die Methoden, die verwendet werden, um die Ruhe menschlicher HSCs in vitro aufrechtzuerhalten, sind begrenzt.
Durch die Nachahmung der Mikroumgebung des Knochenmarks (hypoxisch und fettreich) und die Optimierung der Konzentration von Zytokinen können menschliche HSCs unter Kultur undifferenziert und still gehalten werden. Die Rekapitulation der Ruhevon HSCs in vitro wird das Verständnis der stationären Eigenschaften von HSCs verbessern und eine experimentelle Manipulation von HSCs ermöglichen.
Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien des National Center for Global Health and Medicine. Alle experimentellen Verfahren an Mäusen werden vom National Center for Global Health and Medicine Animal Experiment Committee genehmigt.
ANMERKUNG: Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Lipidzubereitung
- Die folgenden Lipide in Methanol in Glasröhren bei den angegebenen Konzentrationen auflösen: Natriumpalmitat, 16 mg/ml; Natriumoleat, 30 mg/ml; und Cholesterin, 4 mg/ml. Die Lipidlösung bei -30 °C aufbewahren und die Probe vor Gebrauch auftauen.
- Mischen Sie die in Schritt 1.1 hergestellten Lipidlösungen in einem frischen Glasrohr in den Dosen, die erforderlich sind, um die Endkonzentration von 100 g/ml Palmitat, 100 g/ml Oleat und 20 g/ml-Cholesterin zu erhalten. Zum Beispiel, bei der Vorbereitung von 10 ml Kulturmedien, mischen Sie 62,5 l Palmitat-Lösung, 33 l Oleat-Lösung, und 50 l Cholesterin-Lösung in der Glasröhre.
- Verdampfen Sie das Methanol, indem Sie Stickstoffgas durch die Lipidlösung passieren (Abbildung 2A und 2B). Wenn kein Stickstoffgas verfügbar ist, leiten Sie die Luft mit hilfe einer Pipettenhilfe durch die Lösung.
- Das restliche Methanol vollständig verdampfen, indem sie das Glasrohr in einem Wasserbad bei 37 °C erhitzen (Abbildung 2C).
HINWEIS: Die Verwendung einer hohen Konzentration vonN2-Gas auf engstem Raum ist potenziell schädlich. Obwohl das im Protokoll zur Verdunstung von Methanol verwendete Volumen begrenzt ist und daher als sicher gilt, ist eine ausreichende Belüftung des Raumes und die Kennzeichnung von Bereichen mit potenziell hohen Konzentrationen vonN2-Gas wichtig, falls ein unerwartetes Gasleck auftritt.
2. Mittlere Vorbereitung
- Bereiten Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM)/F12 medium (mit HEPES und Glutamin) vor. Penicillin und Streptomycinsulfat in das Medium eintragen und die Endkonzentration von 50 Einheiten bzw. 50 g/ml erreichen. DMEM/F12-mittelhaltige Antibiotika können mindestens 2 Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Fügen Sie 4% w/v Rinderserumalbumin (BSA) zu Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM)/F12 medium (mit HEPES und Glutamin) hinzu.
- Stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf pH 7.4-7.8 mit NaOH-Lösung ein, typischerweise auf pH 7,6.
- Fügen Sie das Medium in Schritt 1 auf das in Schritt 1 vorbereitete Glasrohr ein. Um eine Lösung mit maximaler Löslichkeit zu erreichen, wird die Zugabe von 3-15 ml Medium empfohlen.
- Vollständig lösen die Lipide durch Beschallung (optimal: mehr als 20 min Beschallung). Nachdem die BSA und lipide gelöst sind, sollte die Probe bei -80 °C gelagert und innerhalb von 2 Monaten verwendet werden. Unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
- 1/1.000 des Insulin-, Transferrin-, Natriumselenit- und Ethanolamin-Gemischs (ITS-X) in das DMEM/F12 geben. Filtern Sie das Mischmedium mit einem 0,22 m-Filter (als "Kulturmedium" bezeichnet). Vor der Anwendung fügen Sie den Kulturmedien mit einer Endkonzentration von jeweils 3 ng/ml den menschlichen Stammzellfaktor (SCF) und humanes Thrombopoietin (TPO) hinzu. Nach dem Hinzufügen der Zytokine und ITS-X kann das Medium nicht gespeichert werden.
- Färbepuffer: Fügen Sie Ca- und Mg-freier Phosphat-gepufferter Saline (PBS) 10% FCS hinzu. Diese Lösung kann bei 4 °C für 2 Wochen gelagert werden.
- Auftauen von Medien: Fügen Sie dem DMEM/F12 10% FCS hinzu. Diese Lösung ist einsam.
- Cytokin-Stammlösung: Lösen Sie jeden menschlichen SCF oder menschlichen TPO in PBS (Ca- und Mg-frei) bei 20 g/ml. Diese Lösung kann bei -80 °C für mindestens ein Jahr ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. Nach dem Auftauen die Lagerlösung bei 4 °C aufbewahren und innerhalb von 1 Monat verwenden.
HINWEIS: Untersuchen Sie das Los nach jedem Kauf, um Abweichungen in den Verunreinigungen in BSA zu vermeiden. Kultur HSCs zur gleichen Zeit mit verschiedenen Chargen von BSA und untersuchen Sie die phänotypische HSC-Nummer an Tag 7, wie unten beschrieben. Wenn ein BSA-Batch eine geringe Anzahl oder Häufigkeit von CD34+-Zellen anzeigt (z. B. weniger als die Hälfte der Anzahl der Eingabezellen), vermeiden Sie die Verwendung dieses Batches.
3. Herstellung des menschlichen Knochenmarks CD34+ Zellen
- Kaufen Sie menschliche CD34+ Knochenmarkzellen und speichern Sie die Zellen in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung. Alternativ können Knochenmarkzellen aus einem gesunden Freiwilligen oder frischen Nabelschnurblutzellen nach Genehmigung durch die Ethikkommission des Instituts und der Zustimmung des Spenders verwendet werden.
- Erwärmen Sie 10 ml Auftaumedien in einem 15 ml konischen Rohr in einem 37 °C Wasserbad.
- Die gefrorenen Zellen in Fläschchen in einem 37 °C-Wasserbad innerhalb von 2 min auftauen. Nach dem Abwischen der Durchstechflasche mit 70% Ethanol zur Entfernung von Verunreinigungen, übertragen Sie die Zellen in das 15 ml konische Rohr, das das vorgewärmte Medium aus Schritt 3.2 enthält.
- Zentrifugieren Sie das 15 ml-Rohr bei 200 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig, um das Pellet intakt zu halten (wobei < 50 l Medium). Setzen Sie die Zellen mit dem verbleibenden Medium wieder auf und übertragen Sie sie in eine 1,5 ml Röhre auf Eis.
HINWEIS: Die Exposition gegenüber vom Menschen abgeleiteten Proben direkt in der Schleimhaut einschließlich des Auges oder des verwundeten Gewebes kann zu einer Infektion durch bekannte oder unbekannte Krankheitserreger führen; Daher werden Handschuhe und Brillen beim Umgang mit menschlichen Zellen empfohlen. Selbst wenn die gekauften CD34+ Zellen negativ auf Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV) und humanes Immundefizienzvirus 1 (HIV1) testen, sollte eine sorgfältige Überwachung gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt werden, wenn eine Expositionsinzidenz auftritt. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien bei der Entsorgung von Materialien, die menschlichen Zellen ausgesetzt sind.
4. Sortieren von HSCs
- Beschriften Sie die Zellen mit fluorchromkonjugierten Antikörpern. Mischen Sie 50 l Desreinenpuffer plus 10 l Anti-CD34-FITC, 2 l Anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 l Anti-CD90-PE-Cy7 und 10 l Anti-CD45RA-PE. Das Zellpellet in der Antikörpermischung wieder aufsetzen. Inkubieren Sie die Zellen 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Fügen Sie 1 ml Färbepuffer hinzu, um die Antikörper zu waschen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 340 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Zellpellet in 0,5 ml Färbepuffer + 0,1% Propidiumjodid wieder auf. Übertragen Sie die Suspension mit einem 40-ml-Filter in ein 5 ml-Rohr.
- Gate die phäotypische HSCs innerhalb der PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- Fraktion mit dem FACS Aria-IIIu und sortieren Sie die Zellen in eine 1,5 ml Rohr gefüllt mit 500 L Kulturmedien (Abbildung 3). Mit der in Abbildung 3gezeigten Gating-Strategie werden 10 % der CD34+ Zellen als phänotische HSCs erwartet. Zeichnen Sie die sortierte Zellennummer auf, um das Medienvolumen zu berechnen, um die Zellen in Schritt 5.3 wieder auszusetzen.
HINWEIS: Die Gating-Strategie wird wie zuvorbeschrieben 16 durchgeführt, während die Linienmarkierungsfärbung unter Berücksichtigung des geringen Ausdrucks von Linienmarkierungen in der CD34+CD38-Fraktion von gesunden Personen17 weggelassen wird. - Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen bei 340 × g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Achten Sie sorgfältig auf den Überstand, um sicherzustellen, dass das Pellet intakt bleibt.
- Bewahren Sie die sortierten Zellen auf Eis bis zur Kultur auf.
HINWEIS: Die Fluoreszenzkompensation der spektralen Überlappung sollte während des ersten Experiments durchgeführt werden.
5. Zellkultur
- Übertragen Sie 200 l der in Schritt 2 hergestellten Kulturmedien mit Zytokinen in flache 96-Well-Platten.
- Um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden, füllen Sie alle ungenutzten Brunnen mit 100-200 l PBS.
- Setzen Sie die sortierten HSCs in Kulturmedien ohne Zytokine bei 60 Zellen/L aus.
- Aliquot 600 HSCs/Well (10 l Zellsuspension) in jedem Brunnen. Die Zellennummer kann geändert werden. Weniger als 300 Zellen führen zu größeren technischen Schwankungen, und daher werden mehr Brunnen pro Zustand benötigt, um biologische Unterschiede zu erkennen. Das Kultivieren von mehr als 1000 Zellen in einem einzigen Brunnen sollte aufgrund von Zytokin/Nährstoffentzug oder anhäufenvon ungünstigen Zytokinen/Chemokinen vermieden werden.
- Die Zellen in einem befeuchteten Multigas-Inkubator bei 37 °C in einer 5%CO2 und 1%O2-Atmosphäre kulturieren.
- Für Kulturen über 7 Tage wird empfohlen, die Hälfte des Medienvolumens alle 3-4 Tage zu ersetzen. Saugen Sie sorgfältig 100 l Medien durch Pipettieren und fügen Sie jedem Brunnen 100 L neu hergestellte Kulturmedien hinzu, die Zytokine enthalten. Die Kulturmedien sollten bei 37 °C vorgewärmt werden.
6. Analyse von Marker-Phänotypen mittels Durchflusszytometrie
HINWEIS: Obwohl die Zellen nach 7 Tagen Kultur analysiert werden sollten, kann die Kulturdauer geändert werden.
- Entsorgen Sie 170 l des Mediums mit einer 8-Kanal-Pipette.
- Beschriften Sie die Zellen mit der Antikörpermischung. Mischen Sie 0,5 l Anti-CD34-FITC, 0,1 l Anti-CD38-PerCP-Cy5,5, 0,25 l Anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 l Anti-CD45RA-PE und 9 l Färbepuffer pro Bohrung. 10 L der Mischung in die 96-Well-Platte geben und die Zellen im Dunkeln 30 min bei 4 °C bebrüten.
- Um die Antikörper zu waschen, fügen Sie 100 l Färbepuffer in die Brunnen und zentrifugieren Sie die Platten bei 400 × g für 5 min bei 4 °C mit geringer Beschleunigung und mittlerer Verzögerung.
- Saugen Sie vorsichtig 100 l des Überstandes an, um die Zellen auf dem Boden der Brunnen zu erhalten, und suspendieren Sie dann die Zellen in 200 l Färbepuffer + 0,1 % v/v PI + 1% v/v fluoreszierender Mikrosphären (z. B. Flow-Check Fluorosphären).
- Richten Sie das Durchflusszytometrieinstrument ein. Erfassen Sie Daten für die Proben im schnellen Modus mit gemischtem Probenmodus auf und Aufnahmevolumina von 100 l.
- Exportieren Sie die Daten im FCS-Format und analysieren Sie sie mit Software wie FlowJo. Zellnummern können mit der fluoreszierenden Mikrosphärenperlenzahl bestimmt werden. Wenn der Forscher beispielsweise 2000 Perlen pro Brunnen hinzufügt und die Perlenzahl 700 beträgt, multiplizieren Sie die Zellzahl jedes Bruchs mit 2000/700, um die Gesamtzahl der Zellmenge im Brunnen zu schätzen.
HINWEIS: Fluoreszierende Mikrosphären sind aufgrund des Vorhandenseins von Formaldehyd toxisch für kultivierte Zellen. Dies kann den Zelltod während der Analyse induzieren. Minimieren Sie die Anzahl der Bohrungen (<50 Brunnen), die kontinuierlich analysiert werden, um Verzerrungen zu vermeiden.
7. Transplantation menschlicher HSCs
HINWEIS: Die Repopulation-Aktivität von kultivierten Zellen wird durch Transplantation an immundefizienten Mäusen validiert. Alle Verfahren müssen von Tierversuchsausschüssen oder deren Äquivalenten genehmigt werden.
- Als Spender bereiten Sie eine ausreichende Anzahl von 8-12-wöchigen immundefizienten NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) Mäusen vor. Da NOG-Mäuse sehr anfällig für Infektionen sind, halten Sie die Zuchtkäfige so sauber wie möglich und füttern Sie die Mäuse mit einer sterilisierten Ernährung und Wasser.
- Kultur eine ausreichende Anzahl von HSCs für die Transplantation, wie in Schritt 5 beschrieben. Wenn beispielsweise 5000 HSCs (Tag 0-Äquivalent) an 6 Empfängermäuse transplantiert werden, kulturen Sie 35.000-40.000 HSCs in 40 Brunnen einer 96-Well-Platte (200 L Kulturmedien pro Brunnen) oder in 8 Brunnen einer 24-Well-Platte (1 ml Kulturmedien pro Brunnen). Kultur die Zellen für 2 Wochen mit Halbmedienveränderungen alle 3-4 Tage in einem befeuchteten Multigas-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 und 1% O2. Die Kulturdauer kann geändert werden.
- Bestrahlen Sie NOG-Mäuse bei 2,5 Gy bei 6-24 h vor der Transplantation.
- Sammeln Sie die kultivierten HSCs in 1,5 ml Röhren. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 340 ×g für 5 min bei 4°C.
- Die Überdringungsmittel vorsichtig ansaugen und die Zellen in sterilem eiskalten Färbepuffer bei einer Zelldichte von 5000 HSCs (Tag 0 Äquivalent) pro 200 l wieder aufsetzen. Übertragen Sie diese Suspension in 3 ml Polypropylenrohre. Um den Färbepuffer zu sterilisieren, filtern Sie ihn mit einem 0,22 m-Filter.
- Vor der Transplantation die Mäuse durch Sevofluran oder Isofluran-Inhalation anästhesieren.
- Zur Transplantation von 5000 kultivierten HSCs (Tag 0 Äquivalent) injizieren Sie 200 l der Zellsuspension in die Schwanzvene oder retro-Orbitalsinus von NOG-Mäusen, die in Schritt 7.1 mit einer 1 ml Spritze und einer 27-Spur-Nadel bestrahlt wurden. Frisch isolierte oder aufgetaute Knochenmark-HSCs können als Kontrolle transplantiert werden. Handschuhe sollten zwischen jedem Verfahren mit 70% v/v Ethanol sterilisiert werden.
8. Analyse der Häufigkeit von vom Menschen abgeleiteten Zellen im peripheren Blut
- Um die Repopulation menschlicher Zellen zu untersuchen, sammeln Sie das periphere Blut bei 1, 2 und 3 Monaten nach der Transplantation.
- Bevor Sie das periphere Blut sammeln, befeuchten Sie die Mäuse durch Sevofluran-Inhalation.
- Sammeln Sie 40-80 l peripheres Blut aus der retro-orbitalen Sinus mit heparinisierten Glaskapillarröhren und setzen Sie diese Probe in 1 ml PBS + Heparin (1 U/ml) in 1,5 ml Röhren auf.
- Zentrifuge die Blutsuspension bei 340 × g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS + 1,2 % w/v Dextran (200 kDa) 45 min bei Raumtemperatur wieder auf.
- Übertragen Sie den Überstand in 3 min. auf ein weiteres 1,5 ml Rohr und eine Zentrifuge bei 340 × g.
- Bei roter Blutzelllyse die Zellen in 0,17 M NH4Cl für 5 min wieder aussetzen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 340 × g für 3 min bei 4 °C. Setzen Sie die Zellen in 50 l Färbungspuffer mit 0,3 l Anti-Maus-Fc-Block aus. Inkubieren Sie diese Probe bei 4 °C für 5 min.
- Fügen Sie die folgenden Antikörper für die Oberflächenmarkerfärbung hinzu: 0,3 l Maus CD45-PE-Cy7, 0,3 l Maus Ter-119-PE-Cy7, 0,3 l menschliche CD45-BV421, 0,3 l menschliche CD13-PE, 1,2 l menschliche CD33-PE, 0,3 l menschliche CD19-APC, 0,3 l menschliche CD3-APC-Cy7. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 15 min.
- Einmal mit 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge bei 340 × g 5 min bei 4 °C waschen.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 200 l Desstrichpuffer + 0,1 % v/v PI wieder aus.
- Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Flachbodenplatte und erfassen Sie Daten mit dem Durchflusszytometer im Schnellmodus mit dem Mix-Sample-Modus auf und einem Aufnahmevolumen von 100 l.
- Exportieren Sie die Daten im FCS-Format zur Analyse mit Software wie FlowJo.
- Richten Sie das Durchflusszytometer ein. Erfassen Sie Daten für die Proben im schnellen Modus mit dem Mix-Sample-Modus auf und einem Aufnahmevolumen von 100 l.
- Exportieren Sie die Daten im FCS-Format zur Analyse mit Software wie FlowJo.
Representative Results
Nach 7 Tagen kultivieren der gereinigten HSCs zeigten bis zu 80% der Zellen Marker-Phänotypen von CD34+CD38- (Abbildung 4A). Die Gesamtzahl der Zellen hing von der Zytokinkonzentration ab (Abbildung 4B). Höhere Konzentrationen von SCF und TPO induzierten Eintritt in den Zellzyklus, Proliferation, und Differenzierung (Abbildung 4B). Die Anzahl der phänotypischen HSCs, die durch die Marker-Phänotypen von CD34+CD38-CD90+CD45RA gekennzeichnet sind, nahm proportional zu den SCF- oder TPO-Konzentrationen zu (Abbildung 4B), während die Häufigkeit unter den Gesamtzellen abnahm (Abbildung 4C). Die Gesamtzahl der Zellen war in den 1,5 ng/mL SCF und 4 ng/mL TPO und den 3 ng/mL SCF 3 und 2 ng/mL TPO-Kombinationen gleich, was darauf hindeutet, dass HSCs während der minimalen Zellzyklusaktivierung still sind. Aufgrund der individuellen Unterschiede wird für jeden Knochenmarkspender zytokintitation empfohlen.
Nach 3 Monaten Transplantation kultivierter adulter Knochenmark-HSCs kann die Rekonstitution als ihre Häufigkeit im peripheren Blut menschlicher CD45+ muriner CD45- Ter119-Zellen bewertet werden. Drei Abstammungslinien, darunter CD19+ B-Zellen, CD13/CD33+ Myeloidzellen und CD3+ T-Zellen wurden in NOG-Mäusen rekonstituiert, die entweder mit frisch aufgetauten HSCs oder kultivierten HSCs transplantiert wurden (Abbildung 5).
Abbildung 1. Überblick über das Verfahren. Grafische Zusammenfassung des Verfahrens umfasste das Sortieren, Kultivieren und Analysieren menschlicher hämatopoetischer Stammzellen (HSCs). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Verfahren zur Verdunstung von Methanol aus der Lipidlösung. A) Stickstoffgasflasche mit Gasregler. B) Verfahren zur Weitergabe von Stickstoffgas durch die in Methanol gelöste Lipidlösung. C) Lipide, die an der Unterseite des Glasrohres haften. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Gating-Strategie zum Sortieren von HSCs. Die Plots zeigen abgezäunte CD34+CD38-CD90+CD45RA- Zellen. Ungefähr 10% der CD34+ Zellen waren phänotypic HSCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Repräsentative Zellnummern nach 7 Tagen Kultivierung. A) Repräsentatives fluoreszenzaktiviertes Zellsortierdiagramm nach der Kultivierung der HSCs in SCF (3 ng/ml) und TPO (2 ng/ml). Fraktion 1 wurde für lebende Zellen angereichert, Fraktion 2 wurde für abgestorbene Zellen und Fraktion 3 für Schutt angereichert. Rosa gefärbte Zahlen geben die Häufigkeit an (%) der Gated-Fraktion. B) Anzahl aller HSCs, CD34+CD38- Zellen und CD34+CD38-CD90+CD45RA- Zellen nach der Kultivierung von 600 HSCs unter den angegebenen Zytokinbedingungen. Rote gestrichelte Linien geben die anfängliche Anzahl von Eingabezellen an. S: SCF, T: TPO. Mittelwert ± Standardabweichung, n = 4. Zahlen nach S und T geben die Konzentration (ng/ml) jedes Zytokins an. C) Häufigkeit von CD34+CD38- und CD34+CD38-CD90+CD45RA- Zellen unter den angegebenen Zytokinbedingungen. S: SCF, T: TPO. Mittelwert ± Standardabweichung, n = 4. Die Fehlerbalken für Zellen, die in SCF (1 ng/mL) und TPO (0 ng/mL) kultiviert wurden, wurden aufgrund ihrer hohen Werte (37,7 bzw. 47,9) weggelassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Repräsentative FACS-Plots von Spendermäusen nach 3 Monaten Transplantation. Insgesamt 5000 frisch aufgetaute (obere Paneele) und 2-wöchige kultivierte HSCs (3 ng/mL SCF und 3 ng/mL TPO; untere Paneele) wurden in NOG-Mäuse transplantiert. hCD19 markiert menschliche B-Zellen, hCD13 und hCD33 markieren menschliche myeloische Zellen und hCD3 menschliche T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Kürzlich wurden mehrere Methoden zur Erweiterung von HSCs mit minimaler Differenzierung gemeldet18,19,20,21. Obwohl diese Methoden ausgezeichnet sind, sind HSCs gezwungen, ihre Zellzyklen in Gegenwart hoher Zytokine zu aktivieren, was sich von der in vivo-Situation unterscheidet, in der HSCs minimales Radfahren aufweisen. Dieses Protokoll ist nützlich, um HSCs als still zu halten, wie in vivo beobachtet, indem es die Mikroumgebung des Knochenmarks rekapituliert.
Durch die Kultivierung menschlicher HSCs unter niedrigen Zytokin-, Lipid-reichen und hypoxischen Bedingungen zeigten HSCs minimales Radfahren bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Marker-Phänotypen. Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll ist die Herstellung von Mittel mit einer hohen Konzentration von Fettsäuren und Cholesterin und niedrigen Zytokinkonzentrationen und Kultur unter Hypoxie (Schritt 1, Schritt 2 und Schritt 4). Ohne Cholesterin und/oder Fettsäuren sinkt die Erhaltungsrate von HSCs unter niedrigen Zytokinkonzentrationen um22. Die Kultivierung von Zellen unter hypoxischen Bedingungen ist ebenfalls wichtig, wie zuvorberichtet 23.
Die Kulturbedingungen ähnelten denen, die für murine HSCs verwendet wurden, mit Ausnahme der Zytokinkonzentrationen. Murine HSCs überleben ohne TPO, während menschliche HSCs mindestens 2 ng/ml TPO mit 3 ng/ml SCF22benötigen. Da die Konzentration von TPO viel höher ist als die im menschlichen Serum (100 pg/ml), können die in diesem Protokoll verwendeten Bedingungen spezifische Faktoren fehlen, um das Überleben menschlicher HSCs zu unterstützen. FLT3 wird auf menschlichen HSCs24ausgedrückt. Durch die Zugabe des Liganden flT3LG verringert sich die Anforderung an TPO, HSCs22beizubehalten, leicht ab.
Menschliche HSCs erfordern höhere Konzentrationen von Cholesterin im Vergleich zu murinen HSCs, vermutlich wegen der Unfähigkeit, die Expression von cholesterin-synthesizing Enzymen und die Anfälligkeit für Lipotoxizität unter hohen Konzentrationen (>400 g/ml) von Fettsäuren22zu induzieren. Obwohl nur die Kombination von palmitischen, öligen, Linol- und Stearinsäuren getestet wurde, die reichlich im menschlichen Serum vorgefunden werden, sollten andere Kombinationen von Lipiden bewertet werden, um die Lipotoxizität zu reduzieren und die Rate der Aufrechterhaltung funktioneller HSCs zu verbessern.
Obwohl die Repopulation-Aktivität von kultivierten menschlichen HSCs bei immundefizienten Mäusen nach zwei Wochen Kultur bestätigt wurde22, rekapituliert dieses Kultursystem die Nischenfunktionen von HSCs in vivo nicht vollständig. Die Expression von CD45RA hat berichtet, dass sie zunimmt, und die Wiederbesiedlungskapazität ist geringer als die der frisch sortierten HSCs22. Die Konzentrationen von Nährstoffen wie Glukose, Aminosäure, Pyruvat und Insulin, die dem Medium auf supraphysiologischen Ebenen zugesetzt werden, können jedoch optimiert werden. Verunreinigungen in BSA können auch die Wartung von HSCs18,25beeinträchtigen. Darüber hinaus werden einige kultivierte Zellen zelldeathiert, während andere einer Zellteilung unterzogen werden; Daher kann die Beibehaltung der Gesamtzellenzahl nicht den Ruhezustand jeder Zelle anzeigen.
Trotz dieser Einschränkungen werden die in dem in dieser Studie entwickelten Protokoll beschriebenen Kulturbedingungen dazu beitragen, die Forschung und Das Entwicklung von HSCs, insbesondere unter nahezu physiologischen Bedingungen, voranzutreiben. Kulturbedingungen, die HSCs mit minimaler Differenzierung und Zyklusaktivität aufrechterhalten, wären geeignet, um biologische und chemische Verbindungen zu testen, die speziell auf HSCs wirken, HSCs über Lentivirus-Transduktion oder Genombearbeitung ohne Denrückstand zu manipulieren und den ersten Transformationsschritt zu erläutern, der durch Leukämie-assoziierte Gene induziert wird.
Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit dieser Studie.
Acknowledgments
Wir danken M. Haraguchi und S. Tamaki für die technische Unterstützung und Labormanagement und K. Shiroshita für das Fotografieren. HK wurde teilweise durch den KAKENHI Grant von MEXT/JSPS (Grant-Nr. 19K17847) und das National Center for Global Health and Medicine unterstützt. KT wurde teilweise von KAKENHI Grants von MEXT/JSPS (Grant-Nr. 18H02845 und 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (Grant Nos. 26-001 und 19A2002), AMED (Grant Nos. JP18ck0106444, JP18ae0201014 und JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation und Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
| NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
| Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
| Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
| Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
| Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
| Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
| Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
| Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
| Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
| Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
| Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
| Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
| Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
| DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
| Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
| Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
| Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
| Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
| Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
| Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
| EDTA 2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
| Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
| Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
| Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
| Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
| Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
| Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
| FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
| VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
| Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
| Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
| Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
| Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
| Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |
References
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