Summary
Denne protokol gør det muligt at opretholde hvilende menneskelige hæmatopoietiske stamceller in vitro ved at efterligne knoglemarvsmikromiljøet ved hjælp af rigelige fedtsyrer, kolesterol, lavere koncentrationer af cytokiner og hypoxi.
Abstract
Humane hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), som andre pattedyr HSC'er, opretholde livslang hæmatopoiesis i knoglemarven. HSC'er forbliver hvilende in vivo, i modsætning til mere differentierede forfædre, og kommer hurtigt ind i cellecyklussen efter kemoterapi eller bestråling til behandling af knoglemarvsskade eller in vitro-kultur. Ved at efterligne knoglemarvsmikromiljøet i nærværelse af rigelige fedtsyrer, kolesterol, lav koncentration af cytokiner og hypoxi opretholder humane HSC'er quiescence in vitro. Her beskrives en detaljeret protokol til vedligeholdelse af funktionelle HSC'er i hviletilstandsin vitro. Denne metode vil gøre det muligt at undersøge adfærden hos humane HSC'er under fysiologiske forhold.
Introduction
Hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) og multipotente stamceller (MPP'er) danner koordinat et reservoir til kontinuerlig genopfyldning af differentierede celler for at opretholde hæmatopoiesis gennem livet hos mennesker1. Cellecyklus quiescence er et fremtrædende træk ved HSC'er, der adskiller dem fra MPP'er2. Konventionelt, HSC menes at opholde sig på toppen af hierarkiet af det hæmatopoietiske system, der producerer alle differentierede blodlegemer. Denne hierarkiske model blev for det meste udledt af transplantationseksperimenter3. Nylige undersøgelser viste imidlertid , at HSC'ernes dynamik varierer in vivo sammenlignet med dynamikken i transplantationsforsøg4,5,6,7. Afstamningssporingseksperimenter ved hjælp af flere stregkodesystemer afslørede, at fænotypiske murine HSC'er ikke er en unik celletype, der bidrager til hematopoiesis med stabil tilstand, og MPPs, der viser begrænset selvfornyelsesaktivitet ved transplantationsindstillinger, leverer kontinuerligt modne blodlegemer4,5,8. I modsætning hertil øges HSC'ernes bidrag til modne celler efter knoglemarvsskade4. Dette kan tilskrives drastiske ændringer i mikromiljøet efter knoglemarvsabblation, herunder knoglemarvstransplantation. Selv om det er vanskeligt at anvende afstamningssporing af murinceller på menneskelige celler, afslørede fylogenetisk analyse, der kombinerer encellet koloniisolation og hele genomsekvensering, en lignende egenskab ved det hæmatopoietiske system, hvor både HSC'er og MPP'er er ansvarlige for den daglige produktion af modne celler7. Selvom transplantation er afgørende for at undersøge murin eller menneskelig HSC-aktivitet, er andre eksperimentelle modeller således nødvendige for at forstå HSC'ernes adfærd under fysiologiske forhold.
Dyrkningsmetoder for HSC'er er blevet undersøgt i detaljer for at forstå deres kliniske anvendelser og egenskaber. Human HSC'er kan udvides in vitro ved hjælp af en kombination af cytokiner, rekonstituering af ekstracellulære matricer, fjernelse af selvfornyelsesantagonister, co-kultur med mesenchymale eller endotelceller, tilsætning af albumin eller dets udskiftning, transduktion af selvfornyelsestransskriptionsfaktorer og tilsætning af småmolekyleforbindelser9,10. Nogle af disse metoder, herunder tilsætning af små forbindelser SR111 og UM17112, er blevet testet i kliniske forsøg med lovende resultater9. I betragtning af den hvilende karakter af HSC'er in vivo, opretholde HSC'er med minimal celle cykling er afgørende for at opsummere HSC adfærd in vitro. Hvilende og voksende HSC'er udviser differentialcellecyklusindgang13, metabolisk status14og tolerance over for flere belastninger15 . De metoder, der anvendes til at opretholde quiescence af humane HSC'er in vitro er begrænsede.
Ved at efterligne knoglemarvens mikromiljø (hypoksisk og rig på lipider) og optimere koncentrationen af cytokiner kan humane HSC'er opretholdes udifferentierede og hvilende under kulturen. En opsummering af HSC'ernes hvilende karakter vil forbedre forståelsen af HSC'ernes stabile egenskaber og muliggøre eksperimentel manipulation af HSC'er.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne fra National Center for Global Health and Medicine. Alle eksperimentelle forsøg udført på mus er godkendt af National Center for Global Health and Medicine dyreforsøg udvalg.
BEMÆRK: En oversigt over protokollen er illustreret i figur 1.
1. Lipid forberedelse
- Følgende lipider opløses i methanol i glasrør i de angivne koncentrationer: natriumpalat, 16 mg/mL; natrium oleat, 30 mg/mL og kolesterol, 4 mg/mL. Lipidopløsningen opbevares ved -30 °C, og prøven optøs inden brug.
- Lipidopløsningerne, der er fremstillet i trin 1.1, blandes i et friskglasrør ved de doser, der er nødvendige for at opnå den endelige koncentration på 100 μg/mL palmitate, 100 μg/mL oleat og 20 μg/mL kolesterol. For eksempel, når du forbereder 10 ml dyrkningsmedier, blandes 62,5 μL palmitateopløsning, 33 μL oleatopløsning og 50 μL kolesterolopløsning i glasrøret.
- Methanol fordampes ved at føre nitrogengassen gennem lipidopløsningen (figur 2A og 2B). Hvis der ikke er nitrogengas til rådighed, skal du sende luft gennem opløsningen ved hjælp af en pipettestøtte.
- De resterende methanol fordampes fuldstændigt ved opvarmning af glasrøret i et vandbad ved 37 °C (figur 2C).
BEMÆRK: Brugen af en høj koncentration af N2-gas i lukket rum er potentielt skadelig. Selv om den mængde, der anvendes i protokollen til at fordampe methanol, er begrænset og derfor betragtes som sikker, er det vigtigt at ventilere rummet tilstrækkeligt og mærke områder med potentielt højekoncentrationer af N 2-gas, hvis der opstår en uventet gaslækage.
2. Mellemforberedelse
- Forbered Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM)/F12 medium (med HEPES og glutamin). Tilsættes penicillin og streptomycinsulfat til mediet til den endelige koncentration på henholdsvis 50 enheder og 50 μg/mL. DMEM/F12-medium indeholdende antibiotika kan opbevares ved 4 °C i mindst 2 måneder.
- Der tilsættes 4% w/v af bovin serumalbumin (BSA) til Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM)/F12 medium (med HEPES og glutamin).
- Mediumets pH-h til pH-7,4-7,8 justeres ved hjælp af NaOH-opløsning, typisk til pH 7,6.
- Tilsæt mediet til glasrøret tilberedt i trin 1. For at opnå en opløsning med maksimal opløselighed anbefales tilsætning af 3-15 ml medium.
- Opløs lipiderne fuldstændigt ved sonikering (optimal: mere end 20 minutters sonikering). Efter opløsningen af BSA og lipider skal prøven opbevares ved -80 °C og anvendes inden for 2 måneder. Tø op umiddelbart før brug.
- Tilsæt 1/1.000 af blandingen insulin, transferrin, natriumselen og ethanolamin (ITS-X) til DMEM/F12. Det blandede medium filtreres med et 0,22 μm filter (betegnet som "kulturmedie"). Før brug tilsættes human stamcellefaktor (SCF) og human thrombopoietin (TPO) til kulturmedierne ved en endelig koncentration på 3 ng/mL hver. Efter tilsætning af cytokiner og ITS-X kan mediet ikke opbevares.
- Farvningsbuffer: Tilsæt 10% FCS til Ca- og Mg-fri fosfat-buffered saltvand (PBS). Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i 2 uger.
- Optøning medier: Tilføj 10% FCS til DMEM/F12. Denne løsning er engangsbrug.
- Cytokinbestandopløsning: Hver human SCF eller human TPO opløses i PBS (Ca- og Mg-fri) ved 20 μg/mL. Denne opløsning kan opbevares ved -80 °C i mindst et år uden tab af aktivitet. Når den er optøet, opbevares stamopløsningen ved 4 °C og anvendes inden for en måned.
BEMÆRK: Undersøg partiet efter hvert køb for at undgå variation i de forurenende stoffer i BSA. Kultur HSC'er på samme tid med forskellige partier af BSA og undersøge det fænotypiske HSC-nummer på dag 7 som beskrevet nedenfor. Hvis et BSA-parti viser et lavt antal eller en lav frekvens af CD34+-celler (f.eks. mindre end halvdelen af antallet af inputceller), skal du undgå at bruge denne batch.
3. Forberedelse af human knoglemarv CD34+ celler
- Køb humane CD34+ knoglemarvsceller og opbevar cellerne i flydende nitrogen, indtil de bruges. Alternativt kan knoglemarvsceller fra en sund frivillig eller friske navlestrengsblodceller bruges efter godkendelse af instituttets etiske udvalg og donorsamtykke.
- Varm 10 mL optøningsmedier i et 15 mL konisk rør i et 37 °C vandbad.
- De frosne celler optøs i hætteglas i et 37 °C vandbad inden for 2 min. Efter at have tørret hætteglasset med 70% ethanol for at fjerne forurenende stoffer, overføres cellerne til det 15 mL koniske rør, der indeholder det forvarmede medium fra trin 3.2.
- Centrifuge 15 mL røret ved 200 × g i 15 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten aspireres omhyggeligt for at holde pelleten intakt (hvilket efterlader < 50 μL medium). Resuspend cellerne med det resterende medium og overføre dem til en 1,5 mL rør på is.
BEMÆRK: Udsættelse for humane prøver direkte i slimhinden, herunder øjet eller såret væv, kan forårsage infektion med kendte eller ukendte patogener; Handsker og briller anbefales derfor ved håndtering af menneskelige celler. Selv om den købte CD34+ celler test negativ for hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), og human immundefekt virus 1 (HIV1), omhyggelig overvågning bør udføres i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer, hvis en eksponering forekomst opstår. Følg de institutionelle retningslinjer, når du bortskaffer materialer, der udsættes for menneskelige celler.
4. Sortering af HSC'er
- Mærk cellerne med fluorokrome konjugerede antistoffer. 50 μL farvningsbuffer plus 10 μL anti-CD34-FITC, 2 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL anti-CD90-PE-Cy7 og 10 μL anti-CD45RA-PE. Genbrug cellepillen i antistofblandingen. Cellerne inkuberes i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
- Tilsæt 1 mL farvningsbuffer til vask af antistofferne. Rørene centrifuges ved 340 × g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Resuspend cellepillen i 0,5 mL farvningsbuffer + 0,1% propidium jod. Suspensionen overføres til et 5 mL rør med et filter på 40 μm.
- Gate den fænotypiske HSC'er i PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fraktion ved hjælp af FACS Aria-IIIu og sortere cellerne i en 1,5 mL rør fyldt med 500 μL af kultur medier(Figur 3). Ved hjælp af gatingstrategien i figur 3, ~10% af CD34+ celler forventes at være fænotypiske HSC'er.
BEMÆRK: Gating-strategien udføres som beskrevet tidligere16, mens afstamningsmarkørens farvning udelades i betragtning af det lave udtryk for afstamningsmarkører i CD34+CD38-fraktionen fra raske personer17 . - De sorterede celler centrifugeres ved 340 × g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Aspirer forsigtigt supernatanten for at sikre, at pellet forbliver intakt.
- Opbevar de sorterede celler på is indtil kultur.
BEMÆRK: Fluorescenskompensation for spektral overlapning bør udføres under det første forsøg.
5. Cellekultur
- 200 μL af de dyrkningsmedier, der indeholder cytokiner, der er fremstillet i trin 2, overføres til flade plader med 96 brønde.
- For at undgå fordampning af mediet fyldes alle ubrugte brønde med 100-200 μL PBS.
- Genbrug de sorterede HSC'er i dyrkningsmedier uden cytokiner ved 60 celler/μL.
- Aliquot 600 HSC/brønd (10 μL celleaffjedring) i hver brønd. Cellenummeret kan ændres. Færre end 300 celler vil føre til større teknisk variation, og dermed flere brønde pr betingelse er nødvendige for at opdage biologiske forskelle. Dyrkning af mere end 1000 celler i en enkelt brønd bør undgås på grund af cytokin/næringsstofmangel eller akkumulering af ugunstige cytokiner/kemokiner.
- Dyrkning cellerne i en befugtet multigasinkubator ved 37 °C i en 5% CO2 og 1% O2 atmosfære.
- For kulturer over 7 dage anbefales det at udskifte halvdelen af medievolumen hver 3-4 dage. Der aspirerer forsigtigt 100 μL medier ved pipetter, og der tilsættes 100 μL nyforberedte dyrkningsmedier, der indeholder cytokiner, til hver brønd. Dyrkningsmedierne skal forvarmes ved 37 °C.
6. Analyse af markørphoenotyper ved hjælp af flowcytometry
BEMÆRK: Selvom cellerne skal analyseres efter 7 dages kultur, kan kulturens varighed ændres.
- 170 μL af mediet kasseres ved hjælp af en 8-kanals pipette.
- Mærk cellerne med antistofblandingen. 0,5 μL anti-CD34-FITC, 0,1 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 μL anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL anti-CD45RA-PE og 9 μL farvningsbuffer pr. brønd. Blandingen tilsættes 10 μL til 96-brøndspladen og cellerne inkuberes i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
- For at vaske antistofferne tilsættes 100 μL farvningsbuffer til brøndene og centrifuges pladerne ved 400 × g i 5 min ved 4 °C ved hjælp af lav acceleration og medium deceleration.
- Aspirér forsigtigt 100 μL af supernatanten for at opretholde cellerne i bunden af brøndene, og genbrugte derefter cellerne i 200 μL farvningsbuffer + 0,1% v/v PI + 1% v/v fluorescerende mikrosfærer (f.eks. Flow-Check Fluorosfærer).
- Konfigurer flowcytometriinstrumentet. Der udtages data for prøverne i hurtig tilstand med blandet prøvetilstand på og optagelsesmængder på 100 μL.
- Eksporter dataene i FCS-format, og analyser dem ved hjælp af software som FlowJo. Cellenumre kan bestemmes ved hjælp af fluorescerende mikrosfære perletal. For eksempel, hvis forskeren tilføjer 2000 perler per brønd og perle tæller er 700, gange cellenummeret for hver brøk med 2000/700 at estimere det samlede cellenummer af fraktionen i brønden.
BEMÆRK: Fluorescerende mikrosfærer er giftige for dyrkede celler på grund af tilstedeværelsen af formaldehyd. Dette kan fremkalde celledød under analysen. Minimer antallet af brønde (<50 brønde) analyseret kontinuerligt for at undgå bias.
7. Transplantation af humane HSC'er
BEMÆRK: Repopulationsaktiviteten af dyrkede celler valideres ved transplantation til immundefektmus. Alle forsøg skal godkendes af forsøgsudvalg eller tilsvarende.
- Som donorer skal du forberede et tilstrækkeligt antal 8-12-ugers immundefekt NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) mus. Da NOG-mus er meget modtagelige for infektion, skal du holde avlsburene så rene som muligt og fodre musene med en steriliseret kost og vand.
- Kultur et tilstrækkeligt antal HSC'er til transplantation som beskrevet i trin 5. For eksempel, når 5000 HSC'er (dag 0 tilsvarende) transplanteres til 6 modtagermus, kultur 35.000-40.000 HSC'er i 40 brønde af en 96-brønds plade (200 μL kulturmedier pr. brønd) eller i 8 brønde af en 24-brønds plade (1 mL kulturmedie pr. Brønd). Dyrkning cellerne i 2 uger med halv-media ændringer hver 3-4 dage i en befugtet multi-gas inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 1% O2. Kulturens varighed kan ændres.
- Bestråling af NOG-mus ved 2,5 Gy ved 6-24 timer før transplantation.
- Saml de dyrkede HSC'er i 1,5 mL rør. Rørene centrifuges ved 340 ×g i 5 min ved 4 °C.
- Supernatanterne aspireres forsigtigt, og cellerne opsuges i steril iskold farvningsbuffer med en celletæthed på 5000 HSC'er (dag 0 ækvivalent) pr. 200 μL. Denne suspension overføres til 3 mL polypropylenrør. For at sterilisere farvningsbufferen skal den filtreres med et filter på 0,22 μm.
- Før transplantation bedøve musene ved sevoflurane eller isoflurane indånding.
- Til transplantation af 5000 dyrkede HSC'er (dag 0-ækvivalent) injiceres 200 μL af cellesuspensionen i haleåren eller den retro orbitale sinus hos NOG-mus, der er bestrålet i trin 7.1 ved hjælp af en 1 mL sprøjte og en 27-gauge nål. Frisk isolerede eller optøede knoglemarvs-HSC'er kan transplanteres som en kontrol. Handsker skal steriliseres med 70% v/v ethanol mellem hver procedure.
8. Analyse af hyppigheden af humane celler i det perifere blod
- For at undersøge genpopulationen af menneskelige celler skal du indsamle det perifere blod ved 1, 2 og 3 måneder efter transplantationen.
- Før du samler det perifere blod, bedøve musene ved sevoflurane indånding.
- Der indsamles 40-80 μL perifert blod fra retro-orbital sinus ved hjælp af kapillære rør af glas, og denne prøve suspenderes i 1 mL PBS + heparin (1 U/mL) i 1,5 mL rør.
- Blodaffjedringen centrifuges ved 340 × g i 3 min ved 4 °C. Supernatanten kasseres og genbruges pellet i 1 mL PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) i 45 min ved stuetemperatur.
- Supernatanten overføres til et andet 1,5 mL rør og centrifuge ved 340 × g i 3 min.
- For røde blodlegemer lysis, opsuspend cellerne i 0,17 M NH4Cl i 5 min.
- Celleaffjedringen centrifuges 340 × g i 3 min ved 4 °C. Resuspend cellerne i 50 μL farvning buffer indeholder 0,3 μL af anti-mus Fc-blok. Denne prøve inkuberes ved 4 °C i 5 min.
- Der tilsættes følgende antistoffer mod overflademarkørpletter: 0,3 μL mus CD45-PE-Cy7, 0,3 μL mus Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL human CD45-BV421, 0,3 μL human CD13-PE, 1,2 μL human CD33-PE, 0,3 μL human CD19-APC, 0,3 μL human CD3-APC-Cy7. Cellerne inkuberes ved 4 °C i 15 min.
- Der vaskes én gang med 1 mL farvningsbuffer og centrifuge ved 340 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og cellerne genbruges i 200 μL farvningsbuffer + 0,1% v/v PI.
- Celleaffjedringen overføres til en fladbundsplade med 96 brønde, og der fremskaffes data ved hjælp af flowcytometeret i hurtig tilstand med blandeprøvetilstanden slået til og et optagelsesvolumen på 100 μL.
- Eksporter dataene i FCS-format til analyse ved hjælp af software som FlowJo.
- Sæt flowcytometeret op. Der udtages data for prøverne i hurtig tilstand med blandingsprøvetilstanden slået til, og et optagelsesvolumen på 100 μL.
- Eksporter dataene i FCS-format til analyse ved hjælp af software som FlowJo.
Representative Results
Efter 7 dages dyrkning af de rensede HSC'er viste op til 80% af cellerne markørphoenotyper på CD34+CD38- (Figur 4A). Det samlede celletal afhang af cytokinkoncentrationen (Figur 4B). Højere koncentrationer af SCF og TPO induceret indtræden i cellecyklussen, spredning og differentiering (Figur 4B). Antallet af fænotypiske HSC'er, der er karakteriseret ved markørfænotyperne i CD34+CD38-CD90+CD45RA- steg i forhold til SCF- eller TPO-koncentrationerne (figur 4B), mens hyppigheden blandt de samlede celler faldt (Figur 4C). De samlede celletal var ens i SCF på 1,5 mL og 4 ng/mL TPO og 3 ng/mL SCF 3 og 2 ng/mL TPO-kombinationer, hvilket tyder på, at HSC'er er hvilende under minimal cellecyklusaktivering. I betragtning af de individuelle forskelle anbefales cytokin titrering for hver knoglemarvsdonor.
Efter 3 måneders transplantation af dyrkede voksne knoglemarvs-HSC'er kan rekonstitution evalueres som deres hyppighed i det perifere blod på humant CD45+ murin CD45- Ter119-celler. Tre afstamninger, herunder CD19+ B-celler, CD13/CD33+ myeloidceller og CD3+ T-celler blev rekonstitueret i NOG-mus transplanteret med enten frisk optøede HSC'er eller dyrkede HSC'er (Figur 5).
Figur 1. Oversigt over proceduren. Grafisk resumé af proceduren involverede sortering, dyrkning og analyse af menneskelige hæmatopoietiske stamceller (HSC'er). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Procedure for at fordampe methanol fra lipidopløsningen. A) Nitrogengasflaske med gasregulator. B) Procedure for overførsel af nitrogengas gennem lipidopløsningen opløst i methanol. C) Lipider klæber til bunden af glasrøret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Gating strategi for sortering af HSC'er. Plottene viser gated CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler. Ca. 10% af CD34+ celler var fænotypiske HSC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative cellenumre efter 7 dages dyrkning. A) Repræsentativt fluorescensaktiveret cellesorteringsområde efter dyrkning af HSC'erne i SCF (3 ng/mL) og TPO (2 ng/mL). Fraktion 1 blev beriget til levende celler, fraktion 2 blev beriget til døde celler, og fraktion 3 blev beriget til snavs. Tal farvet med pink angiver frekvensen (%) af den indhegnede fraktion. B) Antal HSC'er, CD34+CD38- celler og CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler efter dyrkning af 600 HSC'er under de angivne cytokinforhold. Røde stiplede linjer angiver det første antal inputceller. S: SCF, T: TPO. Middelværdi ± standardafvigelse, n = 4. Tal efter S og T angiver koncentrationen (ng/mL) af hvert cytokin. C) Frekvens af CD34+CD38- og CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler under de angivne cytokinforhold. S: SCF, T: TPO. Middelværdi ± standardafvigelse, n = 4. Fejllinjerne for celler dyrket i SCF (1 ng/mL) og TPO (0 ng/mL) blev udeladt på grund af deres høje værdier (henholdsvis 37,7 og 47,9). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative FACS-parceller af donormus efter 3 måneders transplantation. I alt 5000 frisk optøede (øvre paneler) og 2-ugers dyrkede HSC'er (3 ng/mL SCF og 3 ng/mL TPO; nedre paneler) blev transplanteret til NOG-mus. hCD19 markerer menneskelige B-celler, hCD13 og hCD33 markerer menneskelige myeloidceller, og hCD3 markerer menneskelige T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
For nylig er flere metoder til at udvide HSC'er med minimal differentiering blevet rapporteret18,19,20,21. Selv om disse metoder er fremragende, er HSC'er tvunget til at aktivere deres cellecyklusser i nærværelse af høje niveauer af cytokiner, som adskiller sig fra in vivo-situationen, hvor HSC'er viser minimal cykling. Denne protokol er nyttig til opretholdelse af HSC'er som hvilende, som observeret in vivo, ved at opsummere knoglemarvsmikromiljøet.
Ved at dyrke humane HSC'er under lave cytokin-, lipidrige og hypoksiske forhold viste HSC'er minimal cykling, samtidig med at de bevarede deres markørphoenotyper. Det kritiske skridt i denne protokol er forberedelsen af medium, der indeholder en høj koncentration af fedtsyrer og kolesterol og lave cytokinkoncentrationer og kultur under hypoxi (trin 1, trin 2 og trin 4). Uden kolesterol og/eller fedtsyrer falder vedligeholdelseshastigheden af HSC'er under lave cytokinkoncentrationer22. Dyrkning af celler under hypoksiske tilstande er også vigtig, som rapporteret tidligere23.
Dyrkningsbetingelserne svarede til dem, der blev anvendt til murin-HSC'er, bortset fra cytokinkoncentrationerne. Murine HSC'er overlever uden TPO, mens humane HSC'er kræver mindst 2 ng/mL TPO med 3 ng/mL SCF22. Da koncentrationen af TPO er meget højere end koncentrationen i humant serum (~100 pg/mL), kan de betingelser, der anvendes i denneprotokol, mangle specifikke faktorer til støtte for overlevelsen af humane HSC'er. Tilføjelsen af sin ligand FLT3LG reducerer behovet for , at TPO opretholderHSC'er 22.
HumanE HSC'er kræver højere koncentrationer af kolesterol sammenlignet med murin HSC'er, formentlig på grund af manglende evne til at fremkalde udtrykket af kolesterolsyntetiserende enzymer og modtagelighed for lipotoksicitet under høje koncentrationer (>400 μg/mL) af fedtsyrer22. Selv om kun kombinationen af palmitiske, oliesyrer, linolsyrer og stearinsyrer blev testet, som er rigeligt findes i det menneskelige serum, andre kombinationer af lipider bør evalueres for at reducere lipotoksicitet og forbedre hastigheden af opretholde funktionelle HSC'er.
Selv om repopulationsaktiviteten af dyrkede humane HSC'er i immundefektmus efter to ugers kultur er blevet bekræftet22, opsummerer dette kultursystem ikke fuldt ud HSC'ernes nichefunktioner in vivo. Det forlyder , at udtrykket af CD45RA er blevet øget , og at genbefolkningskapaciteten er ringere end for nysorterede HSC'er22. Koncentrationerne af næringsstoffer, såsom glukose, aminosyre, pyruvat og insulin, som tilsættes til mediet ved suprafysiologiske niveauer, kan dog optimeres. Forurenende stoffer i BSA kan også kompromittere vedligeholdelsen afHSC'er 18,25. Derudover gennemgår nogle dyrkede celler celledød, mens andre gennemgår celledeling; Vedligeholdelsen af det samlede cellenummer kan således ikke angive hvilestatus for hver celle.
På trods af disse begrænsninger vil de kulturbetingelser, der er beskrevet i protokollen, der er udviklet i denne undersøgelse, bidrage til at fremme forskning og teknik af HSC'er, især under næsten fysiologiske forhold. Kulturforhold, der opretholder HSC'er med minimal differentierings- og cykelaktivitet, ville være egnede til at teste biologiske og kemiske forbindelser, der specifikt virker på HSC'er, manipulere HSC'er via lentivirustransduktion eller genomredigering uden tab af stængelhed og belyse det første trin i transformationen forårsaget af leukæmirelaterede gener.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt i forbindelse med denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi takker M. Haraguchi og S. Tamaki for teknisk support og laboratorieledelse og K. Shiroshita for at tage billeder. HK blev delvist støttet af KAKENHI Grant fra MEXT/JSPS (bevilling nr. 19K17847) og National Center for Global Health and Medicine. KT blev delvist støttet af KAKENHI Grants fra MEXT/JSPS (bevilling nr. 18H02845 og 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (bevillingsnr. 26-001 og 19A2002), AMED (tilskudsnr. JP18ck0106444, JP18ae0201014 og JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation og Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
| NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
| Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
| Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
| Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
| Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
| Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
| Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
| Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
| Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
| Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
| Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
| Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
| Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
| DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
| Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
| Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
| Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
| Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
| Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
| Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
| EDTA 2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
| Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
| Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
| Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
| Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
| Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
| Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
| FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
| VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
| Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
| Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
| Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
| Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
| Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |
References
- Scala, S., Aiuti, A. In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions. Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).
- Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. Awakening dormant haematopoietic stem cells. Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Sun, J., et al. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).
- Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis. Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).
- Pineault, N., Abu-Khader, A. Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation. Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Cohen, S., et al. Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study. Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).
- Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Mendelson, A., Frenette, P. S. Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration. Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Xie, W., et al. Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes. Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Bai, T., et al. Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel. Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Kobayashi, H., et al. Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).
- Kikushige, Y., et al. Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival. Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).
- Ieyasu, A., et al. An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
