Summary
هذا البروتوكول يتيح الحفاظ على الخلايا الجذعية الدموية البشرية هادئة في المختبر عن طريق محاكاة البيئة الدقيقة نخاع العظام باستخدام الأحماض الدهنية وفيرة, الكوليسترول, انخفاض تركيزات السيتوكينات, ونقص الأكسيجة.
Abstract
تحافظ الخلايا الجذعية الدموية البشرية (HSCs)، مثل غيرها من الثدييات HSCs، على الهيماتوبويز مدى الحياة في نخاع العظام. تبقى مركبات الكربون الهيدروفلورية هادئة في الجسم الحي، على عكس السلف الأكثر تمايزا، وتدخل دورة الخلية بسرعة بعد العلاج الكيميائي أو التشعيع لعلاج إصابة نخاع العظم أو في زراعة المختبر. من خلال محاكاة البيئة الدقيقة لنخاع العظم في وجود الأحماض الدهنية الوفيرة ، والكوليسترول ، وانخفاض تركيز السيتوكينات ، ونقص الأكسيد ، تحافظ HSCs البشرية على الهدوء في المختبر. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل للحفاظ على HSCs وظيفية في حالة هادئة في المختبر. هذه الطريقة ستمكن من إجراء دراسات لسلوك HSCs الإنسان في ظل الظروف الفسيولوجية.
Introduction
تشكل الخلايا الجذعية الدموية (HSCs) وخلايا السلف متعددة القدرات (MPPs) بشكل تنسيقي خزانا للتجديد المستمر للخلايا المتمايزة للحفاظ على وجود الدم طوال الحياة في البشر1. خلية دورة quiescence هو سمة بارزة من HSCs، التفريق بينها وبين MPPs2. تقليديا، ويعتقد أن HSCs يقيمون في قمة التسلسل الهرمي للنظام الدموي، وإنتاج جميع خلايا الدم المتباينة. تم استنتاج هذا النموذج الهرمي في الغالب من تجارب زرع3. ومع ذلك، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن ديناميات مركبات الكربون الهيدروفلورية تختلف في الجسم الحي مقارنة بتلك الموجودة في تجارب الزرع4و5و6و7. كشفت تجارب تتبع النسب باستخدام العديد من أنظمة الباركودينج أن مركبات المورين الظاهرية ليست من نوع الخلايا الفريدة التي تساهم في وجود دم ثابت الحالة ، وMPPs ، التي تعرض نشاطا محدودا للتجديد الذاتي عند إعدادات الزرع ، تزود باستمرار خلايا الدم الناضجة4و5و8. في المقابل ، يتم تعزيز مساهمة HSCs في الخلايا الناضجة بعد إصابة نخاع العظم4. ويمكن أن يعزى ذلك إلى التغيرات الجذرية في البيئة الدقيقة بعد استئصال نخاع العظم، بما في ذلك زرع نخاع العظم. على الرغم من أن تطبيق تتبع النسب من خلايا مورين على الخلايا البشرية أمر صعب، كشف التحليل النباتي الذي يجمع بين عزل المستعمرة المشتقة من خلية واحدة وتسلسل الجينوم كله عن خاصية مماثلة للنظام الدموي، حيث تكون كل من HSCs و MPPs مسؤولة عن الإنتاج اليومي للخلايا الناضجة7. وهكذا ، على الرغم من أن زرع أمر ضروري لفحص مورين أو نشاط HSC الإنسان ، وهناك حاجة إلى نماذج تجريبية أخرى لفهم سلوكيات HSCs في ظل الظروف الفسيولوجية.
وقد درست أساليب زراعة HSCs بالتفصيل لفهم تطبيقاتها السريرية وخصائصها. يمكن توسيع HSCs الإنسان في المختبر باستخدام مزيج من السيتوكينات، وإعادة تشكيل المصفوفات خارج الخلية، وإزالة الخصوم التجديد الذاتي، والثقافة المشتركة مع الخلايا المتوسطة أو البطانية، إضافة الألبومين أو استبداله، ونقل عوامل النسخ التجديد الذاتي، وإضافة مركبات جزيء صغير9،10. بعض هذه الطرق، بما في ذلك إضافة مركبات صغيرة SR111 و UM17112،وقد تم اختبارها في التجارب السريرية مع نتائج واعدة9. وبالنظر إلى الطبيعة الكوئسة لمركبات الكربون الهيدروفلورية في الجسم الحي، فإن الحفاظ على مركبات الكربون الهيدروفلورية بأقل قدر ممكن من ركوب الخلايا أمر بالغ الأهمية لتلخيص سلوك HSC في المختبر. Quiescent وHSCs المنتشرة معرض دخول دورة الخلية التفاضلية13, حالة التمثيل الغذائي14, والتسامح ضد الضغوط متعددة15 . والأساليب المستخدمة للحفاظ على هدوء مركبات الكربون الهيدروفلورية البشرية في المختبر محدودة.
من خلال محاكاة البيئة الدقيقة لنخاع العظام (نقص الأكسيد وغنية بالدهون) وتحسين تركيز السيتوكينات ، يمكن الحفاظ على HSCs الإنسان غير متمايزة وغير هادئة تحت الثقافة. ومن شأن تلخيص الطبيعة الكوزة لمركبات الكربون الهيدروفلورية في المختبر أن يحسن فهم خصائص الحالة الثابتة لمركبات الكربون الهيدروفلورية وأن يمكن من التلاعب التجريبي بمركبات الكربون الهيدروفلورية.
Protocol
ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية للمركز الوطني للصحة والطب العالميين. جميع الإجراءات التجريبية التي أجريت على الفئران معتمدة من قبل المركز الوطني للصحة العالمية والطب لجنة التجارب الحيوانية.
ملاحظة: يتم توضيح نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1.
1. إعداد الدهون
- حل الدهون التالية في الميثانول في أنابيب زجاجية بتركيزات المشار إليها: الصوديوم بالميتات, 16 ملغم / مل; أوليات الصوديوم، 30 ملغم/مل. والكوليسترول، 4 ملغم/مل. تخزين محلول الدهون في -30 درجة مئوية وذوبان العينة قبل الاستخدام.
- اخلط الحلول الدهنية المعدة في الخطوة 1.1 في أنبوب زجاجي طازج بالجرعات اللازمة للحصول على التركيز النهائي ل 100 ميكروغرام/مل بالميتات، و100 ميكروغرام/مل أوليات، و20 ميكروغرام/مل من الكوليسترول. على سبيل المثال، عند إعداد 10 مل من وسائل الإعلام الثقافية، اخلط 62.5 ميكرولتر من محلول البالميتات، و33 ميكرولتر من محلول الأوليات، و50 ميكرولتر من محلول الكوليسترول في الأنبوب الزجاجي.
- تبخر الميثانول عن طريق تمرير غاز النيتروجين من خلال محلول الدهون (الشكل 2A و 2B). إذا لم يكن غاز النيتروجين متوفرا، فمرر الهواء عبر المحلول باستخدام ماصة مساعدة.
- تتبخر تماما الميثانول المتبقية عن طريق تسخين أنبوب زجاجي في حمام مائي في 37 درجة مئوية (الشكل 2C).
ملاحظة: استخدام تركيز عال من الغاز N2 في الفضاء الضيق يحتمل أن تكون ضارة. على الرغم من أن الحجم المستخدم في البروتوكول لتبخر الميثانول محدود وبالتالي يعتبر آمنا ، إلا أن تهوية الغرفة بشكل كاف ووضع علامات على مناطق التركيزات العالية المحتملة لغاز N2 أمر مهم في حالة حدوث تسرب غير متوقع للغاز.
2. إعداد متوسط
- إعداد دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) / F12 المتوسطة (مع HEPES والغلوتامين). إضافة البنسلين والستريبتوميسين كبريتات إلى متوسط إلى التركيز النهائي من 50 وحدة و 50 ميكروغرام / مل، على التوالي. يمكن تخزين متوسط DMEM/F12 الذي يحتوي على المضادات الحيوية عند 4 درجات مئوية لمدة شهرين على الأقل.
- إضافة 4٪ ث / الخامس من الألبومين مصل البقري (BSA) إلى دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) / F12 المتوسطة (مع HEPES والغلوتامين).
- ضبط درجة الحموضة للوسط إلى درجة الحموضة 7.4-7.8 باستخدام حل NaOH، عادة إلى درجة الحموضة 7.6.
- أضف الوسط إلى الأنبوب الزجاجي المعد في الخطوة 1. لتحقيق حل مع أقصى قدر من الذوبان، ينصح بإضافة متوسط 3-15 مل.
- حل تماما الدهون عن طريق سونيكيشن (الأمثل: أكثر من 20 دقيقة من سونيكيشن). بعد أن يذوب BSA والدهون، يجب تخزين العينة في -80 درجة مئوية واستخدامها في غضون 2 أشهر. تذوب مباشرة قبل الاستخدام.
- أضف 1/1,000 من الأنسولين، والناقلين، وسيلينيت الصوديوم، وخليط أمين الإيثانول (ITS-X) إلى خليط DMEM/F12. تصفية الوسيطة المختلطة باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر (المعين باسم "وسائط الثقافة"). قبل الاستخدام، أضف عامل الخلايا الجذعية البشرية (SCF) والجلطات البشرية (TPO) إلى وسائل الإعلام الثقافية بتركيز نهائي قدره 3 نانوغرام/مل لكل منهما. بعد إضافة السيتوكينات و ITS-X، لا يمكن تخزين الوسيطة.
- تلطيخ العازلة: إضافة FCS 10٪ إلى Ca- و Mg خالية من الفوسفات المخزنة بالمحلول الملحي (PBS). يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
- وسائط ذوبان الجليد: إضافة FCS 10٪ إلى DMEM/F12. هذا الحل هو استخدام واحد.
- حل مخزون Cytokine: حل كل SCF الإنسان أو TPO الإنسان في برنامج تلفزيوني (Ca- ومغ خالية) في 20 ميكروغرام / مل. يمكن تخزين هذا الحل عند -80 درجة مئوية لمدة سنة واحدة على الأقل دون فقدان النشاط. وبمجرد إذابة الخزنة، قم بتخزين محلول المخزون عند درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمه في غضون شهر واحد.
ملاحظة: فحص الكثير بعد كل عملية شراء لتجنب الاختلاف في الملوثات في BSA. ثقافة HSCs في نفس الوقت مع دفعات مختلفة من BSA ودراسة رقم HSC phenotypic في اليوم 7 كما هو موضح أدناه. إذا أظهرت دفعة BSA عددا منخفضا أو ترددا منخفضا لخلايا CD34+ (على سبيل المثال أقل من نصف عدد خلايا الإدخال)، فتجنب استخدام هذه الدفعة.
3. إعداد نخاع العظم البشري CD34+ الخلايا
- شراء خلايا CD34+ نخاع العظم البشري وتخزين الخلايا في النيتروجين السائل حتى الاستخدام. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام خلايا نخاع العظم من متطوع سليم أو خلايا دم الحبل السري الطازجة بناء على موافقة اللجنة الأخلاقية للمعهد وموافقة المانحين.
- دافئ 10 مل من وسائل الإعلام ذوبان في أنبوب مخروطي 15 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إذابة الخلايا المجمدة في قوارير في حمام مائي 37 درجة مئوية في غضون 2 دقيقة. بعد مسح القارورة بالإيثانول بنسبة 70٪ لإزالة الملوثات، قم بنقل الخلايا إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على الوسيطة المدفأة مسبقا من الخطوة 3.2.
- طرد مركزي أنبوب 15 مل في 200 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant بعناية للحفاظ على بيليه سليمة (ترك < 50 ميكرولتر من المتوسط). إعادة تشغيل الخلايا مع الوسط المتبقي ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل على الجليد.
ملاحظة: التعرض لعينات مشتقة من الإنسان مباشرة في الغشاء المخاطي بما في ذلك العين أو الأنسجة المصابة قد يسبب العدوى من قبل مسببات الأمراض المعروفة أو غير المعروفة؛ وهكذا، ينصح القفازات والنظارات عند التعامل مع الخلايا البشرية. حتى لو كانت الخلايا CD34+ المشتراة سلبية لاختبار فيروس التهاب الكبد B (HBV) وفيروس التهاب الكبد C (HCV) وفيروس نقص المناعة البشرية 1 (HIV1) ، فيجب إجراء مراقبة دقيقة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية إذا حدث حدوث التعرض. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية عند التخلص من المواد المعرضة للخلايا البشرية.
4. فرز HSCs
- تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروشروم. مزيج 50 ميكرولتر من العازلة تلطيخ بالإضافة إلى 10 ميكرولتر من مكافحة CD34-FITC، 2 ميكرولتر من مكافحة CD38-PerCP-Cy5.5، 5 ميكرولتر من مكافحة CD90-PE-Cy7، و 10 ميكرولتر من مكافحة CD45RA-PE. Resuspend بيليه الخلية في خليط الأجسام المضادة. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- إضافة 1 مل من العازلة تلطيخ لغسل الأجسام المضادة. طرد مركزي الأنابيب في 340 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل الناتنات الفائق.
- Resuspend بيليه الخلية في 0.5 مل من العازلة تلطيخ + 0.1٪ يوديد البروبيديوم. نقل التعليق إلى أنبوب 5 مل باستخدام مرشح 40 ميكرومتر.
- بوابة HSCs phenotypic داخل PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- كسر باستخدام FACS Aria-IIIu وفرز الخلايا في أنبوب 1.5 مل مليئة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية (الشكل 3). باستخدام استراتيجية gating هو مبين في الشكل 3، ~ 10 ٪ من CD34+ من المتوقع أن تكون خلايا HSCs phenotypic. سجل رقم الخلية فرزها لحساب حجم وسائل الإعلام لإعادة إنفاق الخلايا في الخطوة 5.3.
ملاحظة: يتم تنفيذ استراتيجية gating كما هو موضح سابقا16 في حين حذف تلطيخ علامة النسب نظرا للتعبير منخفضة من علامات النسب في CD34 + CD38- جزء من الأفراد الأصحاء17 . - الطرد المركزي الخلايا فرزها في 340 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant. يستنشق بعناية supernatant لضمان أن بيليه لا تزال سليمة.
- تخزين الخلايا المفرزة على الجليد حتى الثقافة.
ملاحظة: ينبغي إجراء تعويض مضان التداخل الطيفي أثناء التجربة الأولى.
5. ثقافة الخلية
- نقل 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية التي تحتوي على السيتوكينات المعدة في الخطوة 2 إلى لوحات مسطحة القاع 96 بئرا.
- لتجنب تبخر المتوسط، قم بملء جميع الآبار غير المستخدمة ب 100-200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- إعادة إنفاق HSCs فرزها في وسائل الإعلام الثقافية دون السيتوكينات في 60 خلية / ميكرولتر.
- Aliquot 600 HSCs / جيدا (10 ميكرولتر من تعليق الخلية) في كل بئر. يمكن تغيير رقم الخلية. أقل من 300 خلية سوف تؤدي إلى تباين تقني أكبر، وبالتالي هناك حاجة إلى المزيد من الآبار لكل حالة للكشف عن الاختلافات البيولوجية. وينبغي تجنب زراعة أكثر من 1000 خلية في بئر واحد بسبب الحرمان من السيتوكين / المغذيات أو تراكم السيتوكينات / chemokines غير المواتية.
- زراعة الخلايا في حاضنة متعددة الغازات الرطبة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 و 1٪ O2.
- بالنسبة للثقافات على مدى 7 أيام ، يوصى باستبدال نصف حجم الوسائط كل 3-4 أيام. يستنشق بعناية 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام عن طريق pipetting وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة التي أعدت حديثا تحتوي على السيتوكينات إلى كل بئر. وينبغي أن تكون وسائل الإعلام الثقافية ساخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية.
6. تحليل الأنماط الظاهرية علامة باستخدام قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: على الرغم من أنه يجب تحليل الخلايا بعد 7 أيام من culture، يمكن تغيير مدة culture.
- تجاهل 170 ميكرولتر من الوسط باستخدام ماصة 8 قنوات.
- تسمية الخلايا مع خليط الأجسام المضادة. مزيج 0.5 ميكرولتر من مكافحة CD34-FITC، 0.1 ميكرولتر من مكافحة CD38-PerCP-Cy5.5، 0.25 ميكرولتر من المضادة CD90-PE-Cy7، 0.5 ميكرولتر من المضادة CD45RA-PE، و 9 ميكروغرام من العازلة تلطيخ لكل بئر. أضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى لوحة 96 جيدا واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- لغسل الأجسام المضادة، أضف 100 ميكرولتر من حاجز التلطيخ إلى الآبار واطرد المركزي اللوحات عند 400 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام تسارع منخفض وتباطؤ متوسط.
- يستنشق بعناية 100 ميكرولتر من الخلايا الفائقة للحفاظ على الخلايا في الجزء السفلي من الآبار ، ثم يعيد إنفاق الخلايا في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ + 0.1 ٪ v / v من PI + 1 ٪ v / v من ميكروسفيرات الفلورسنت (على سبيل المثال ، تدفق فحص الفلوروسفير).
- إعداد أداة قياس التدفق الخلوي. الحصول على بيانات للعينات في وضع سريع مع وضع عينة مختلطة على وحجم امتصاص 100 ميكرولتر.
- تصدير البيانات بتنسيق FCS وتحليلها باستخدام برامج مثل FlowJo. يمكن تحديد أرقام الخلايا باستخدام عدد حبات الفلورسنت المجهري. على سبيل المثال، إذا أضاف الباحث 2000 حبة لكل بئر وكان عدد الخرز 700، قم بضرب عدد الخلايا لكل كسر بحلول 2000/700 لتقدير إجمالي عدد الخلايا للكسر في البئر.
ملاحظة: الفلورسنت ميكروسفيرس سامة للخلايا المستزرعة بسبب وجود الفورمالديهايد. قد يؤدي هذا إلى موت الخلية أثناء التحليل. تقليل عدد الآبار (<50 بئرا) التي يتم تحليلها باستمرار لتجنب التحيز.
7. زرع HSCs الإنسان
ملاحظة: يتم التحقق من صحة نشاط إعادة إسكان الخلايا المستزرعة عن طريق زرع الفئران ذات المناعة. يجب أن تتم الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجان التجارب على الحيوانات أو ما يعادلها.
- كمتبرعين، قم بإعداد عدد كاف من فئران NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) التي تتراوح 8-12 أسبوعا. كما الفئران NOG هي عرضة للغاية للعدوى، والحفاظ على أقفاص تربية نظيفة قدر الإمكان وإطعام الفئران مع اتباع نظام غذائي معقم والماء.
- زراعة عدد كاف من HSCs لزرع كما هو موضح في الخطوة 5. على سبيل المثال، عندما يتم زرع 5000 HSCs (ما يعادل اليوم 0) إلى 6 فئران متلقية، والثقافة 35،000-40،000 HSCs في 40 بئرا من لوحة 96 بئر (200 ميكروغرام من وسائل الإعلام الثقافية لكل بئر) أو في 8 آبار من لوحة 24 بئرا (1 مل من وسائل الإعلام الثقافية لكل بئر). زراعة الخلايا لمدة 2 أسابيع مع تغيير نصف وسائل الإعلام كل 3-4 أيام في حاضنة متعددة الغازات الرطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 1٪ O2. يمكن تغيير مدة الثقافة.
- تشعيع الفئران NOG في 2.5 غراي في 6-24 ساعة قبل زرع.
- جمع HSCs المستزرعة في أنابيب 1.5 مل. طرد مركزي الأنابيب في 340 ×غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- يستنشق بعناية المضادات الفائقة وإعادة إنفاق الخلايا في العازلة العقيمة تلطيخ الجليد الباردة في كثافة الخلية من 5000 HSCs (اليوم 0 ما يعادل) لكل 200 ميكرولتر. نقل هذا التعليق إلى أنابيب البولي بروبلين 3 مل. لتعقيم المخزن المؤقت للتلطيخ، قم بتصفية هذا المخزن باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر.
- قبل الزرع ، تخدير الفئران عن طريق استنشاق سيفوفلوران أو isoflurane.
- لزرع 5000 من HSCs المستزرعة (اليوم 0 ما يعادلها)، وحقن 200 ميكروغرام من تعليق الخلية في الوريد الذيل أو الجيوب الأنفية المدارية الرجعية من الفئران NOG المشععة في الخطوة 7.1 باستخدام حقنة 1 مل وإبرة قياس 27. يمكن زرع نخاع العظم HSCs المعزول حديثا أو المذاب كعنصر تحكم. يجب تعقيم القفازات مع الإيثانول 70٪ v/v بين كل إجراء.
8. تحليل وتيرة الخلايا المشتقة من الإنسان في الدم المحيطي
- لفحص إعادة إسكان الخلايا البشرية، جمع الدم المحيطي في 1 و 2 و 3 أشهر بعد زرع.
- قبل جمع الدم المحيطي ، تخدير الفئران عن طريق استنشاق سيفوفلوران.
- جمع 40-80 ميكرولتر من الدم المحيطي من الجيوب الأنفية المدارية الرجعية باستخدام أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية الهيبارية وتعليق هذه العينة في 1 مل من برنامج تلفزيوني + الهيبارين (1 U/mL) في أنابيب 1.5 مل.
- الطرد المركزي تعليق الدم في 340 × غرام لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني + 1.2٪ ث / v dextran (200 كيلودا) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل supernatant إلى أنبوب آخر 1.5 مل والطرد المركزي في 340 × غرام لمدة 3 دقائق.
- لتحلل خلايا الدم الحمراء، إعادة إنفاق الخلايا في 0.17 M NH4Cl لمدة 5 دقائق.
- الطرد المركزي تعليق الخلية 340 × غرام لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من تلطيخ العازلة التي تحتوي على 0.3 ميكرولتر من مكافحة الماوس Fc-block. احتضان هذه العينة في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة الأجسام المضادة التالية لتلطيخ علامة السطح: 0.3 ميكرولتر من الماوس CD45-PE-Cy7، 0.3 ميكرولتر الماوس تير-119-PE-Cy7، 0.3 ميكرولتر من CD45-BV421 البشري، 0.3 ميكرولتر من CD13-PE البشري، 1.2 ميكرولتر من CD33-PE البشري، 0.3 ميكرولتر من CD19-APC البشري، 0.3 ميكروغرام من CD3-APC-Cy7 البشري. احتضان الخلايا في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- يغسل مرة واحدة مع 1 مل من العازلة تلطيخ والطرد المركزي في 340 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 200 ميكرولتر من تلطيخ العازلة + 0.1٪ v/v من PI.
- نقل تعليق الخلية إلى لوحة مسطحة القاع 96 جيدا والحصول على البيانات باستخدام تدفق السيتومتر في وضع سريع مع وضع عينة مزيج على وحجم امتصاص 100 ميكرولتر.
- تصدير البيانات بتنسيق FCS للتحليل باستخدام برامج مثل FlowJo.
- إعداد مقياس التدفق الخلوي. الحصول على بيانات للعينات في وضع سريع مع وضع عينة المزيج على وحجم امتصاص 100 ميكرولتر.
- تصدير البيانات بتنسيق FCS للتحليل باستخدام برامج مثل FlowJo.
Representative Results
بعد 7 أيام من زراعة HSCs المنقى، ما يصل إلى 80٪ من الخلايا عرض الأنماط الظاهرية علامة من CD34+CD38- (الشكل 4A). يعتمد إجمالي عدد الخلايا على تركيز السيتوكين(الشكل 4B). تركيزات أعلى من SCF و TPO المستحثة الدخول في دورة الخلية، والانتشار، والتمايز(الشكل 4B). عدد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية phenotypic HSCs التي تتميز بالأنماط الظاهرية للCD34+CD38-CD90+CD45RA- زاد بما يتناسب مع تركيزات SCF أو TPO (الشكل 4B)، في حين انخفض التردد بين الخلايا الإجمالية(الشكل 4C). وكانت الأعداد الإجمالية للخلايا متساوية في تركيبتي SCF 1.5 نانوغرام/مل و4 نانوغرام/مل TPO و3 نانوغرام/مل SCF 3 و2 نانوغرام/مل من TPO، مما يشير إلى أن مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية هادئة أثناء الحد الأدنى من تنشيط دورة الخلية. نظرا للاختلافات الفردية ، يوصى بتكسيت السيتوكين لكل متبرع بنخاع العظم.
بعد 3 أشهر من زرع نخاع العظام البالغ المستزرع HSCs ، يمكن تقييم إعادة التشكيل كتردد في الدم المحيطي لخلايا CD45 + murine CD45- Ter119- البشرية. ثلاثة أنساب بما في ذلك خلايا CD19 + B ، CD13/CD33 + خلايا النخاع ، وخلايا CD3 + T أعيد تشكيلها في فئران NOG المزروعة إما ب HSCs المذابة حديثا أو HSCs المستزرعة(الشكل 5).
الشكل 1. نظرة عامة على الإجراء. تضمن الملخص الرسومي للإجراء فرز الخلايا الجذعية الدموية البشرية وزراعةها وتحليلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إجراء لتبخر الميثانول من محلول الدهون. أ) اسطوانة غاز النيتروجين مع منظم الغاز. ب) إجراء لتمرير غاز النيتروجين من خلال محلول الدهون المذاب في الميثانول. ج) الدهون التمسك الجزء السفلي من الأنبوب الزجاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. Gating استراتيجية لفرز HSCs. تظهر المؤامرات CD34مسور +CD38-CD90+CD45RA- الخلايا. ما يقرب من 10٪ من خلايا CD34+ كانت HSCs الظاهري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. أرقام الخلايا التمثيلية بعد 7 أيام من الاستزراع. أ) ممثل مضان تنشيط مؤامرة فرز الخلية بعد زراعة HSCs في SCF (3 نانوغرام / مل) و TPO (2 نانوغرام / مل). تم إثراء الكسر 1 للخلايا الحية، وتم إثراء الكسر 2 للخلايا الميتة، وتم إثراء الكسر 3 للحطام. تشير الأرقام الملونة باللون الوردي إلى التردد (٪) من الكسر المسور. ب) عدد جميع HSCs، CD34+CD38- الخلايا، وCD34+CD38-CD90+CD45RA- الخلايا بعد زراعة 600 HSCs تحت ظروف السيتوكين المشار إليها. خطوط متقطعة حمراء تشير إلى العدد الأولي من خلايا الإدخال. S: SCF، T: TPO. متوسط الانحراف المعياري ±، n = 4. تشير الأرقام التالية S و T إلى تركيز (نانوغرام/مل) لكل سيتوكين. ج) تردد CD34+CD38- وCD34+CD38-CD90+CD45RA- الخلايا تحت ظروف السيتوكين المشار إليها. S: SCF، T: TPO. متوسط الانحراف المعياري ±، n = 4. تم حذف أشرطة الخطأ للخلايا المستزرعة في SCF (1 نانوغرام/مل) و TPO (0 نانوغرام/مل) بسبب قيمهما العالية (37.7 و 47.9 على التوالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. قطع الأراضي ممثل FACS من الفئران المانحة بعد 3 أشهر من زرع. تم زرع ما مجموعه 5000 من الألواح العليا المذابة حديثا ومركبات HSCs المستزرعة لمدة أسبوعين (3 نانوغرام / مل SCF و 3 نانوغرام / مل TPO ؛ لوحات أقل) في فئران NOG. hCD19 علامات الخلايا B البشرية، hCD13 و hCD33 علامة الخلايا النخاعية البشرية، وhCD3 علامات الخلايا التائية البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن عدة طرق لتوسيع HSCs مع الحد الأدنى من التمايز18،19،20،21. على الرغم من أن هذه الأساليب ممتازة، يضطر HSCs لتنشيط دورات الخلايا في وجود مستويات عالية من السيتوكينات، والذي يختلف عن الوضع في الجسم الحي الذي تظهر HSCs الحد الأدنى من ركوب الدراجات. هذا البروتوكول مفيد للحفاظ على HSCs كما هادئة، كما لوحظ في الجسم الحي، عن طريق تلخيص البيئة الدقيقة نخاع العظم.
من خلال زراعة HSCs الإنسان تحت السيتوكين منخفضة، والدهون الغنية، وظروف نقص الأكدمة، وأظهرت HSCs الحد الأدنى من ركوب الدراجات مع الحفاظ على الأنماط الظاهرية علامة بهم. الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هو إعداد المتوسطة التي تحتوي على تركيز عال من الأحماض الدهنية والكوليسترول وانخفاض تركيزات السيتوكين والثقافة تحت نقص الأكسيجة (الخطوة 1، الخطوة 2، والخطوة 4). دون الكولسترول و / أو الأحماض الدهنية، ومعدل صيانة HSCs تحت تركيزات السيتوكين منخفضة يقلل22. زراعة الخلايا تحت ظروف نقص الأكز مهم أيضا، كما ذكرت سابقا23.
كانت ظروف الثقافة مماثلة لتلك المستخدمة في مركبات الكربون الهيدروفلورية المورينية، باستثناء تركيزات السيتوكين. مورين HSCs البقاء على قيد الحياة دون TPO، في حين أن HSCs الإنسان تتطلب ما لا يقل عن 2 نانوغرام / مل من TPO مع 3 نانوغرام / مل من SCF22. وبما أن تركيز TPO أعلى بكثير من التركيز في المصل البشري (~ 100 pg/mL)، فإن الظروف المستخدمة في هذا البروتوكول قد تكون مفقودةعوامل محددة لدعم بقاء HSCs البشرية. إضافة ليغاند FLT3LG يقلل قليلا من متطلبات TPO للحفاظ على HSCs22.
HSCs الإنسان تتطلب تركيزات أعلى من الكوليسترول بالمقارنة مع HSCs مورين, يفترض بسبب عدم القدرة على الحث على التعبير عن الإنزيمات توليف الكوليسترول والتعرض للسمية الدهنية تحت تركيزات عالية (>400 ميكروغرام / مل) من الأحماض الدهنية22. على الرغم من أنه تم اختبار فقط مزيج من الأحماض البالميتية والأوليك واللينوليك والستيريك ، والتي توجد بوفرة في المصل البشري ، يجب تقييم مجموعات أخرى من الدهون للحد من السمية الدهنية وتحسين معدل الحفاظ على HSCs الوظيفية.
على الرغم من أن نشاط إعادة إسكان HSCs البشرية المستزرعة في الفئران المناعة بعد أسبوعين من الثقافة قد تم تأكيده22، إلا أن هذا النظام الثقافي لا يلخص بشكل كامل الوظائف المتخصصة ل HSCs في الجسم الحي. وقد أفيد أن التعبير عن CD45RA لزيادة وقدرة إعادة السكان هو أدنى من ذلك من HSCs فرزها حديثا22. ومع ذلك ، يمكن تحسين تركيزات العناصر الغذائية ، مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية والبيروفاتي والأنسولين ، والتي تضاف إلى الوسط عند مستويات فوقفيزيولوجية. الملوثات في BSA قد تعرض للخطر أيضا صيانة HSCs18،25. وبالإضافة إلى ذلك، تخضع بعض الخلايا المستزرعة لوفيات الخلايا، بينما تخضع خلايا أخرى لتقسيم الخلايا؛ وبالتالي، قد لا يشير الحفاظ على إجمالي عدد الخلايا إلى حالة هادئة لكل خلية.
وعلى الرغم من هذه القيود، فإن الظروف الثقافية الموصوفة في البروتوكول الذي تم تطويره في هذه الدراسة ستساعد على النهوض بالبحوث والهندسة في مركبات الكربون الهيدروفلورية، ولا سيما في ظل ظروف شبه فسيولوجية. وستكون الظروف الثقافية التي تحافظ على مركبات الكربون الهيدروفلورية بأقل قدر من التمايز ونشاط ركوب الدراجات مناسبة لاختبار المركبات البيولوجية والكيميائية التي تعمل على وجه التحديد على مركبات الكربون الهيدروفلورية، والتلاعب بمركبات الكربون الهيدروفلورية عن طريق نقل الفيروسات العدسية أو تحرير الجينوم دون فقدان الجذعية، وتوضيح الخطوة الأولية للتحول الناجمة عن الجينات المرتبطة بسرطان الدم.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح المرتبطة بهذه الدراسة.
Acknowledgments
نشكر م. هاراجوتشي وس. تاماكي على الدعم التقني وإدارة المختبرات، وK. شيروشيتا لالتقاط الصور الفوتوغرافية. وقد تم دعم هونج كونج جزئيا من منحة KAKENHI من MEXT /JSPS (المنحة رقم 19K17847) والمركز الوطني للصحة والطب العالميين. تم دعم KT جزئيا من منح KAKENHI من MEXT / JSPS (رقم المنحة 18H02845 و 18K19570) والمركز الوطني للصحة العالمية والطب (رقم المنحة 26-001 و 19A2002) ، AMED (رقم المنحة. JP18ck0106444، JP18ae0201014، وJP20bm0704042)، مؤسسة أونو للبحوث الطبية، مؤسسة كانزوا للبحوث الطبية، ومؤسسة تاكيدا للعلوم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
| NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
| Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
| Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
| Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
| Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
| Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
| Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
| Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
| Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
| Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
| Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
| Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
| Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
| DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
| Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
| Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
| Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
| Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
| Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
| Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
| EDTA 2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
| Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
| Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
| Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
| Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
| Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
| Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
| FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
| VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
| Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
| Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
| Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
| Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
| Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |
References
- Scala, S., Aiuti, A. In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions. Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).
- Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. Awakening dormant haematopoietic stem cells. Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Sun, J., et al. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).
- Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis. Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).
- Pineault, N., Abu-Khader, A. Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation. Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Cohen, S., et al. Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study. Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).
- Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Mendelson, A., Frenette, P. S. Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration. Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Xie, W., et al. Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes. Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Bai, T., et al. Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel. Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Kobayashi, H., et al. Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).
- Kikushige, Y., et al. Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival. Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).
- Ieyasu, A., et al. An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
