Summary
Dit protocol maakt het mogelijk om quiescente menselijke hematopoëtische stamcellen in vitro te behouden door het micromilieu van het beenmerg na te bootsen met behulp van overvloedige vetzuren, cholesterol, lagere concentraties cytokinen en hypoxie.
Abstract
Menselijke hematopoëtische stamcellen (HSC's) houden, net als andere HSC's van zoogdieren, levenslange hematopoiese in het beenmerg. HSC's blijven in vivo rustgevend, in tegenstelling tot meer gedifferentieerde voorlopers, en komen snel na chemotherapie of bestraling in de celcyclus om beenmergletsel of in vitro kweek te behandelen. Door het micromilieu van het beenmerg na te bootsen in aanwezigheid van overvloedige vetzuren, cholesterol, lage concentratie cytokinen en hypoxie, handhaven menselijke HSC's quiescence in vitro. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het handhaven van functionele HSC's in de rustgevende toestand in vitro. Deze methode maakt studies van het gedrag van menselijke HSC's onder fysiologische omstandigheden mogelijk.
Introduction
Hematopoëtische stamcellen (HSC's) en multipotente voorlopercellen (MCP's) vormen coördinerend een reservoir voor continue aanvulling van gedifferentieerde cellen om hematopoiese gedurende het hele leven bij mensen te behouden1. Celcyclus quiescence is een prominent kenmerk van HSC's, waardoor ze worden onderscheiden van MPPs2. Conventioneel, HSC's worden verondersteld te verblijven aan de top van de hiërarchie van het hematopoietische systeem, het produceren van alle gedifferentieerde bloedcellen. Dit hiërarchische model werd meestal afgeleid uit transplantatie-experimenten3. Recente studies wezen er echter op dat de dynamiek van HSC 's in vivo verschilt in vergelijking met die in transplantatie-experimenten4,5,6,7. Lineage tracing experimenten met behulp van verschillende barcoding systemen onthulden dat fenotypische murine HSC's geen uniek celtype zijn dat bijdraagt aan steady-state hematopoiese, en MPPs, die beperkte zelfvernieuwingsactiviteit vertonen bij transplantatie-instellingen, continu volwassen bloedcellen leveren4,5,8. Daarentegen wordt de bijdrage van HSC's aan volwassen cellen versterkt na beenmergletsel4. Dit kan worden toegeschreven aan drastische veranderingen in het micromilieu na beenmergablatie, waaronder beenmergtransplantatie. Hoewel het toepassen van afstammingstracering van muriene cellen op menselijke cellen moeilijk is, onthulde fylogenetische analyse die eencellige kolonieisolatie en hele genoomsequencing combineert een vergelijkbare eigenschap van het hematopoietische systeem, waarbij zowel HSC's als MSP's verantwoordelijk zijn voor de dagelijkse productie van volwassen cellen7. Hoewel transplantatie dus essentieel is voor het onderzoeken van muriene of menselijke HSC-activiteit, zijn andere experimentele modellen nodig om het gedrag van HSC's onder fysiologische omstandigheden te begrijpen.
Cultiveringsmethoden voor HSC's zijn in detail bestudeerd om hun klinische toepassingen en kenmerken te begrijpen. Humane HSC's kunnen in vitro worden uitgebreid met behulp van een combinatie van cytokinen, reconstitutie van extracellulaire matrices, verwijdering van zelfvernieuwingsantagonisten, co-cultuur met mesenchymale of endotheelcellen, toevoeging van albumine of de vervanging ervan, transductie van zelfvernieuwingstranscriptiefactoren en toevoeging van verbindingen met kleine moleculen9,10. Sommige van deze methoden , waaronder toevoeging van kleine verbindingen SR111 en UM17112, zijn getest in klinische studies met veelbelovende resultaten9. Gezien de rustgevende aard van HSC's in vivo, is het handhaven van HSC's met minimale celcycli van cruciaal belang voor het heroveren van HSC-gedrag in vitro. Rustgevende en proliferatie HSC 's vertonen differentiële celcyclusvermelding13, metabole status14en tolerantie tegen meervoudigespanningen 15 . De methoden die worden gebruikt om de quiescence van menselijke HSC's in vitro te behouden, zijn beperkt.
Door de micro-omgeving van het beenmerg (hypoxisch en rijk aan lipiden) na te bootsen en de concentratie van cytokinen te optimaliseren, kunnen menselijke HSC's ongedifferentieerd en rustgevend onder cultuur worden gehouden. Het samengevat van het rustgevende karakter van HSC's in vitro zal het begrip van de steady state eigenschappen van HSC's verbeteren en experimentele manipulatie van HSC's mogelijk maken.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van het National Center for Global Health and Medicine. Alle experimentele procedures die op muizen worden uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de animal experiment committee van het National Center for Global Health and Medicine.
OPMERKING: Een overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Lipidenpreparaat
- Los de volgende lipiden op in methanol in glazen buizen in de aangegeven concentraties: natriumpalmitaat, 16 mg/ml; natriumoleaat, 30 mg/ml; en cholesterol, 4 mg/ml. Bewaar de lipidenoplossing bij -30 °C en ontdooi het monster voor gebruik.
- Meng de lipideoplossingen bereid in stap 1.1 in een verse glazen buis in de doses die nodig zijn om de uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml palmitaat, 100 μg/ml oleaat en 20 μg/ml cholesterol te verkrijgen. Meng bijvoorbeeld bij het bereiden van 10 ml kweekmedia 62,5 μL palmitaatoplossing, 33 μL oleaatoplossing en 50 μL cholesteroloplossing in de glazen buis.
- Verdamper het methanol door stikstofgas door de lipideoplossing te leiden (figuur 2A en 2B). Als er geen stikstofgas beschikbaar is, laat dan lucht door de oplossing met behulp van een pipethulpmiddel.
- Verdampt de resterende methanol volledig door de glazen buis in een waterbad op 37 °C te verwarmen (figuur 2C).
OPMERKING: Het gebruik van een hoge concentratie N2-gas in besloten ruimte is potentieel schadelijk. Hoewel het volume dat in het protocol wordt gebruikt om methanol te verdampen beperkt is en dus als veilig wordt beschouwd, is het belangrijk om de ruimte adequaat te ventileren en gebieden met potentieel hoge concentraties N2-gas te labelen als er een onverwacht gaslek optreedt.
2. Medium voorbereiding
- Bereid Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/F12 medium (met HEPES en glutamine). Voeg penicilline en streptomycinesulfaat toe aan het medium tot de uiteindelijke concentratie van respectievelijk 50 eenheden en 50 μg/ml. DMEM/F12 medium bevattende antibiotica kunnen ten minste 2 maanden bij 4 °C worden bewaard.
- Voeg 4% w/v runderserumalbumine (BSA) toe aan Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/F12 medium (met HEPES en glutamine).
- Stel de pH van het medium in op pH 7,4-7,8 met behulp van de NaOH-oplossing, meestal op pH 7,6.
- Voeg het medium toe aan de glazen buis die in stap 1 is voorbereid. Om een oplossing met maximale oplosbaarheid te bereiken, wordt toevoeging van 3-15 ml medium aanbevolen.
- Los de lipiden volledig op door sonicatie (optimaal: meer dan 20 minuten sonicatie). Nadat de BSA en lipiden zijn opgelost, moet het monster bij -80 °C worden bewaard en binnen 2 maanden worden gebruikt. Ontdooi onmiddellijk voor gebruik.
- Voeg 1/1.000 van het mengsel insuline, transferrine, natriumseleniet en ethanolamine (ITS-X) toe aan het DMEM/F12. Filter het gemengde medium met een filter van 0,22 μm (aangeduid als "kweekmedia"). Voeg voor gebruik de humane stamcelfactor (SCF) en humane trombopoëtine (TPO) toe aan de kweekmedia bij een eindconcentratie van 3 ng/ml per stuk. Na toevoeging van de cytokinen en ITS-X kan het medium niet meer worden opgeslagen.
- Kleuringsbuffer: Voeg 10% FCS toe aan Ca- en Mg-vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Deze oplossing kan gedurende 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
- Ontdooimedia: Voeg 10% FCS toe aan de DMEM/F12. Deze oplossing is voor eenmalig gebruik.
- Cytokine stamoplossing: Los elke menselijke SCF of humane TPO op in PBS (Ca- en Mg-vrij) bij 20 μg/ml. Deze oplossing kan ten minste één jaar bij -80 °C worden bewaard zonder verlies van activiteit. Eenmaal ontdooid, bewaar de voorraadoplossing op 4 °C en gebruik binnen 1 maand.
OPMERKING: Onderzoek de partij na elke aankoop om variatie in de verontreinigingen in BSA te voorkomen. Kweek HSC's tegelijkertijd met verschillende partijen BSA en onderzoek het fenotypische HSC-nummer op dag 7 zoals hieronder beschreven. Als een BSA-batch een laag aantal of frequentie cd34+-cellen weergeeft (bijvoorbeeld minder dan de helft van het aantal invoercellen), vermijd dan het gebruik van deze batch.
3. Bereiding van menselijk beenmerg CD34+ cellen
- Koop menselijke CD34+ beenmergcellen en bewaar de cellen in vloeibare stikstof tot gebruik. Als alternatief kunnen beenmergcellen van een gezonde vrijwilliger of verse navelstrengbloedcellen worden gebruikt na goedkeuring door de ethische commissie van het instituut en toestemming van de donor.
- Verwarm 10 ml ontdooimedia in een conische buis van 15 ml in een waterbad van 37 °C.
- Ontdooi de bevroren cellen in flacons in een waterbad van 37 °C binnen 2 minuten. Nadat u de flacon met 70% ethanol hebt afgeveegd om verontreinigingen te verwijderen, brengt u de cellen vanaf stap 3.2 over naar de conische buis van 15 ml met het voorverwarmde medium.
- Centrifugeer de buis van 15 ml op 200 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer het supernatant voorzichtig om de pellet intact te houden (laat < 50 μL medium achter). Resuspendeer de cellen met het resterende medium en breng ze over in een buis van 1,5 ml op ijs.
OPMERKING: Blootstelling aan monsters van menselijke afbakening rechtstreeks in het slijmvlies, met inbegrip van het oog of gewond weefsel, kan infectie veroorzaken door bekende of onbekende ziekteverwekkers; handschoenen en brillen worden daarom aanbevolen bij het hanteren van menselijke cellen. Zelfs als de gekochte CD34+ cellen negatief testen op hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV) en humaan immunodeficiëntievirus 1 (HIV1), moet zorgvuldige monitoring worden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen als er een blootstellingsincidentie optreedt. Volg de institutionele richtlijnen bij het weggooien van materialen die zijn blootgesteld aan menselijke cellen.
4. Sorteren van HSC's
- Label de cellen met fluorchrome geconjugeerde antilichamen. Meng 50 μL kleurbuffer plus 10 μL anti-CD34-FITC, 2 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL anti-CD90-PE-Cy7 en 10 μL anti-CD45RA-PE. Resuspend de celkorrel in het antilichaammengsel. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Voeg 1 ml kleurbuffer toe om de antilichamen te wassen. Centrifugeer de buizen bij 340 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de celkorrel in 0,5 ml kleurbuffer + 0,1% propidiumjodide. Breng de suspensie over in een buis van 5 ml met behulp van een filter van 40 μm.
- Poort de fenotypische HSC's binnen de PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fractie met behulp van de FACS Aria-IIIu en sorteer de cellen in een buis van 1,5 ml gevuld met 500 μL kweekmedia (figuur 3). Met behulp van de gatingstrategie in figuur 3wordt verwacht dat ~10% van de CD34+ cellen fenotypische HSC's zijn. Noteer het gesorteerde celnummer om het volume van de media te berekenen om de cellen in stap 5.3 te resuspenden.
OPMERKING: De gatingstrategie wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven16, terwijl de afstammingsmarkerkleuring wordt weggelaten gezien de lage expressie van afstammingsmarkers in de CD34+CD38-fractie van gezonde individuen17 . - Centrifugeer de gesorteerde cellen op 340 × g gedurende 5 min bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Aspireer het supernatant voorzichtig om ervoor te zorgen dat de pellet intact blijft.
- Bewaar de gesorteerde cellen op ijs tot kweek.
OPMERKING: Fluorescentiecompensatie van spectrale overlapping moet tijdens het eerste experiment worden uitgevoerd.
5. Celcultuur
- Breng 200 μL van de kweekmedia die cytokinen bevatten, bereid in stap 2, over in platbodemplaten van 96 putjes.
- Om verdamping van het medium te voorkomen, vult u alle ongebruikte putten met 100-200 μL PBS.
- Resuspend de gesorteerde HSC's in kweekmedia zonder cytokinen bij 60 cellen/μL.
- Aliquot 600 HSC's/put (10 μL celsuspensie) in elke put. Het celnummer kan worden gewijzigd. Minder dan 300 cellen zullen leiden tot grotere technische variatie, en dus zijn er meer putten per aandoening nodig om biologische verschillen op te sporen. Het cultiveren van meer dan 1000 cellen in één put moet worden vermeden vanwege cytokine/nutriëntentekort of accumulatie van ongunstige cytokinen/chemokinen.
- Kweek de cellen in een bevochtigde multi-gas incubator bij 37 °C in een 5% CO2 en 1% O2 atmosfeer.
- Voor culturen van meer dan 7 dagen wordt aanbevolen om elke 3-4 dagen de helft van het mediavolume te vervangen. Aspireer voorzichtig 100 μL media door pipetten en voeg 100 μL nieuw bereide kweekmedia met cytokinen toe aan elke put. De cultuurmedia moeten worden voorverwarmd bij 37 °C.
6. Analyse van markerfenotypes met behulp van flowcytometrie
OPMERKING: Hoewel de cellen na 7 dagen cultuur moeten worden geanalyseerd, kan de kweekduur worden gewijzigd.
- Gooi 170 μL van het medium weg met behulp van een 8-kanaals pipet.
- Label de cellen met het antilichaammengsel. Meng 0,5 μL anti-CD34-FITC, 0,1 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 μL anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL anti-CD45RA-PE en 9 μL kleurbuffer per put. Voeg 10 μL van het mengsel toe aan de 96-putplaat en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Om de antilichamen te wassen, voegt u 100 μL kleuringsbuffer toe aan de putten en centrifugeert u de platen op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van lage acceleratie en gemiddelde vertraging.
- Aspireer voorzichtig 100 μL van het supernatant om de cellen op de bodem van de putten te houden en resuspeneer de cellen vervolgens in 200 μL kleurbuffer + 0,1% v/v PI + 1% v/v fluorescerende microsferen (bijv. Flow-Check Fluorospheres).
- Stel het flow cytometrie instrument in. Verkrijg gegevens voor de monsters in de snelle modus met gemengde monstermodus en opnamevolumes van 100 μL.
- Exporteer de gegevens in FCS-indeling en analyseer deze met behulp van software zoals FlowJo. Celnummers kunnen worden bepaald met behulp van het aantal fluorescerende microsfeerparellen. Als de onderzoeker bijvoorbeeld 2000 kralen per put toevoegt en het aantal kraaltjes 700 is, vermenigvuldigt hij het celnummer van elke breuk met 2000/700 om het totale celnummer van de breuk in de put te schatten.
OPMERKING: Fluorescerende microbolletjes zijn giftig voor gekweekte cellen vanwege de aanwezigheid van formaldehyde. Dit kan celdood veroorzaken tijdens de analyse. Minimaliseer het aantal putten (<50 putten) dat continu wordt geanalyseerd om bias te voorkomen.
7. Transplantatie van menselijke HSC's
OPMERKING: Herbevolkingsactiviteit van gekweekte cellen wordt gevalideerd door transplantatie naar immunodeficiënte muizen. Alle procedures moeten worden goedgekeurd door comités voor dierproeven of hun equivalenten.
- Bereid als donor een voldoende aantal immunodeficiënte NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) muizen van 8-12 weken voor. Omdat NOG-muizen zeer vatbaar zijn voor infectie, houd de kweekkooien zo schoon mogelijk en voed de muizen met een gesteriliseerd dieet en water.
- Kweek een voldoende aantal HSC's voor transplantatie zoals beschreven in stap 5. Bijvoorbeeld, wanneer 5000 HSC's (dag 0 equivalent) worden getransplanteerd naar muizen met 6 ontvangers, kweek dan 35.000-40.000 HSC's in 40 putten van een 96-putplaat (200 μL kweekmedia per put) of in 8 putten van een 24-putplaat (1 ml kweekmedia per put). Kweek de cellen gedurende 2 weken met halfmediale veranderingen om de 3-4 dagen in een bevochtigde multi-gas incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 1% O2. De cultuurduur kan worden gewijzigd.
- Bestraal NOG muizen bij 2,5 Gy om 6-24 uur voorafgaand aan de transplantatie.
- Verzamel de gekweekte HSC's in buizen van 1,5 ml. Centrifugeer de buizen op 340 ×g gedurende 5 min bij 4°C.
- Aspireer de supernatanten zorgvuldig en resuspendeer de cellen in steriele ijskoude kleuringsbuffer bij een celdichtheid van 5000 HSC's (dag 0 equivalent) per 200 μL. Breng deze suspensie over op 3 ml polypropyleen buizen. Om de kleuringsbuffer te steriliseren, filtert u deze met een filter van 0,22 μm.
- Verdoof de muizen vóór de transplantatie door inademing van sevofluraan of isofluraan.
- Om 5000 gekweekte HSC's (dag 0-equivalent) te transplanteren, injecteert u 200 μL van de celsuspensie in de staartader of retro orbitale sinus van NOG-muizen die in stap 7.1 zijn bestraald met behulp van een spuit van 1 ml en een naald met een 27 gauge. Vers geïsoleerde of ontdooide beenmerg HSC's kunnen als controle worden getransplanteerd. Handschoenen moeten tussen elke procedure worden gesteriliseerd met 70% v/v ethanol.
8. Analyse van de frequentie van door de mens afgeleide cellen in het perifere bloed
- Om de herbevolking van menselijke cellen te onderzoeken, verzamelt u het perifere bloed op 1, 2 en 3 maanden na transplantatie.
- Voordat u het perifere bloed verzamelt, verdooft u de muizen door sevofluraaninhalatie.
- Verzamel 40-80 μL perifeer bloed uit de retro-orbitale sinus met behulp van gepariniseerde glazen capillaire buizen en hang dit monster op in 1 ml PBS + heparine (1 U/ml) in 1,5 ml buizen.
- Centrifugeer de bloedsuspensie bij 340 × g gedurende 3 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 1 ml PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng het supernatant over naar een andere buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 340 × g.
- Voor rode bloedcellysis, resuspend de cellen in 0.17 M NH4Cl gedurende 5 min.
- Centrifugeer de celsuspensie 340 × g gedurende 3 min bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in 50 μL kleurbuffer met 0,3 μL antimuis Fc-blok. Incubeer dit monster gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Voeg de volgende antilichamen toe voor oppervlaktemarkerkleuring: 0,3 μL muis CD45-PE-Cy7, 0,3 μL muis Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL menselijk CD45-BV421, 0,3 μL menselijk CD13-PE, 1,2 μL humaan CD33-PE, 0,3 μL Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Was eenmaal met 1 ml kleurbuffer en centrifugeer op 340 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 200 μL kleurbuffer + 0,1% v/v PI.
- Breng de celsuspensie over naar een 96-put vlakke bodemplaat en verkrijg gegevens met behulp van de flowcytometer in de snelle modus met de mixmonstermodus aan en een opnamevolume van 100 μL.
- Exporteer de gegevens in FCS-indeling voor analyse met behulp van software zoals FlowJo.
- Stel de flow cytometer in. Verkrijg gegevens voor de monsters in de snelle modus met de mixmonstermodus aan en een opnamevolume van 100 μL.
- Exporteer de gegevens in FCS-indeling voor analyse met behulp van software zoals FlowJo.
Representative Results
Na 7 dagen cultiveren van de gezuiverde HSC's vertoonde tot 80% van de cellen markerfenotypes van CD34+CD38- (figuur 4A). Het totale celnummer was afhankelijk van de cytokineconcentratie (figuur 4B). Hogere concentraties SCF en TPO leidden tot toegang tot de celcyclus, proliferatie en differentiatie (figuur 4B). Het aantal fenotypische HSC 's dat wordt gekenmerkt door de markerfenotypes van CD34+CD38-CD90+CD45RA- steeg in verhouding tot de SCF- of TPO-concentraties (figuur 4B), terwijl de frequentie onder de totale cellen afnam (figuur 4C). De totale celaantallen waren gelijk in de combinaties 1,5 ng/ml SCF en 4 ng/ml TPO en 3 ng/ml SCF 3 en 2 ng/ml TPO, wat erop wijst dat HSC's rustgevend zijn tijdens minimale activering van de celcyclus. Gezien de individuele verschillen wordt cytokinetitratie aanbevolen voor elke beenmergdonor.
Na 3 maanden transplantatie van gekweekte volwassen beenmerg HSC's kan reconstitutie worden geëvalueerd als hun frequentie in het perifere bloed van menselijke CD45+ muriene CD45- Ter119-cellen. Drie afstammingen, waaronder CD19+ B-cellen, CD13/CD33+ myeloïde cellen en CD3+ T-cellen, werden gereconstitueerd in NOG-muizen die werden getransplanteerd met vers ontdooide HSC's of gekweekte HSC's (figuur 5).
Figuur 1. Overzicht van de procedure. Grafische samenvatting van de procedure omvatte het sorteren, cultiveren en analyseren van menselijke hematopoëtische stamcellen (HSC's). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Procedure om methanol uit de lipideoplossing te verdampen. A) Stikstofgasfles met een gasregelaar. B) Procedure voor het passeren van stikstofgas door de lipideoplossing opgelost in methanol. C) Lipiden die zich aan de onderkant van de glazen buis houden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Gating-strategie voor het sorteren van HSC's. De plots tonen gated CD34+CD38-CD90+CD45RA- cellen. Ongeveer 10% van de CD34+ cellen waren fenotypische HSC's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Representatieve celnummers na 7 dagen cultiveren. A) Representatief fluorescentiegeactiveerd celsorteerperceel na het cultiveren van de HSC's in SCF (3 ng/ml) en TPO (2 ng/ml). Fractie 1 werd verrijkt voor levende cellen, fractie 2 werd verrijkt voor dode cellen en fractie 3 werd verrijkt voor puin. In roze gekleurde getallen geven de frequentie aan (%) van de gated fraction. B) Aantal van alle HSC's, CD34+CD38- cellen en CD34+CD38-CD90+CD45RA- cellen na het cultiveren van 600 HSC's onder de aangegeven cytokineomstandigheden. Rode stippellijnen geven het beginaantal invoercellen aan. S: SCF, T: TPO. Gemiddelde ± standaardafwijking, n = 4. Getallen na S en T geven de concentratie (ng/ml) van elk cytokine aan. C) Frequentie van CD34+CD38- en CD34+CD38-CD90+CD45RA- cellen onder de aangegeven cytokineomstandigheden. S: SCF, T: TPO. Gemiddelde ± standaardafwijking, n = 4. De foutbalken voor cellen gekweekt in SCF (1 ng/ml) en TPO (0 ng/ml) werden weggelaten vanwege hun hoge waarden (respectievelijk 37,7 en 47,9). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Representatieve FACS-percelen van donormuizen na 3 maanden transplantatie. In totaal werden 5000 vers ontdooide (bovenste panelen) en 2 weken gekweekte HSC's (3 ng/ml SCF en 3 ng/ml TPO; onderste panelen) getransplanteerd in NOG-muizen. hCD19 markeert menselijke B-cellen, hCD13 en hCD33 markeren menselijke myeloïde cellen en hCD3 markeert menselijke T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Onlangs zijn verschillende methoden voor het uitbreiden van HSC 's met minimale differentiatie gerapporteerd18,19,20,21. Hoewel deze methoden uitstekend zijn, worden HSC's gedwongen om hun celcycli te activeren in aanwezigheid van hoge niveaus van cytokinen, wat verschilt van de in vivo situatie waarin HSC's minimale cyclus vertonen. Dit protocol is nuttig voor het handhaven van HSC's als rustgevend, zoals in vivo waargenomen, door het micromilieu van het beenmerg opnieuw samen te vatten.
Door menselijke HSC's te cultiveren onder lage cytokine, lipiderijke en hypoxische omstandigheden, vertoonden HSC's minimale fietsen met behoud van hun marker fenotypes. De cruciale stap in dit protocol is de bereiding van medium dat een hoge concentratie vetzuren en cholesterol en lage cytokineconcentraties en -cultuur onder hypoxie bevat (stap 1, stap 2 en stap 4). Zonder cholesterol en/of vetzuren neemt de onderhoudssnelheid van HSC's bij lage cytokineconcentraties afmet 22. Cultivering van cellen onder hypoxische omstandigheden is ook belangrijk, zoals eerder gemeld23.
De kweekomstandigheden waren vergelijkbaar met die voor muriene HSC's, met uitzondering van de cytokineconcentraties. Muriene HSC's overleven zonder TPO, terwijl menselijke HSC's ten minste 2 ng/ml TPO nodig hebben met 3 ng/ml SCF22. Aangezien de concentratie van TPO veel hoger is dan die in menselijk serum (~100 pg/ml), kunnen de in dit protocol gebruikte omstandigheden specifieke factoren missen om de overleving van menselijke HSC's te ondersteunen. FLT3 wordt uitgedrukt op menselijke HSC's24. De toevoeging van haar ligand FLT3LG vermindert enigszins de eis voor TPO om HSC 's22te handhaven .
Humane HSC's vereisen hogere concentraties cholesterol in vergelijking met muriene HSC's, vermoedelijk vanwege het onvermogen om de expressie van cholesterolsyntheserende enzymen te induceren en de gevoeligheid voor lipotoxiciteit bij hoge concentraties (>400 μg/ml) vetzuren22. Hoewel alleen de combinatie van palmitine-, olie-, linolzuur- en stearinezuren werd getest, die overvloedig in het menselijke serum worden aangetroffen, moeten andere combinaties van lipiden worden geëvalueerd om de lipotoxiciteit te verminderen en de snelheid van het behoud van functionele HSC's te verbeteren.
Hoewel de herbevolkingsactiviteit van gekweekte menselijke HSC's bij immunodeficiënte muizen na twee weken kweek is bevestigd22, vat dit kweeksysteem de nichefuncties van HSC's in vivo niet volledig samen. De expressie van CD45RA is naar verluidt toegenomen en de herbevolkingscapaciteit is inferieur aan die van vers gesorteerde HSC 's22. De concentraties van voedingsstoffen, zoals glucose, aminozuur, pyruvaat en insuline, die op suprafysiologische niveaus aan het medium worden toegevoegd, kunnen echter worden geoptimaliseerd. Verontreinigingen in BSA kunnen ook het onderhoud van HSC 's18,25in gevaar brengen . Bovendien ondergaan sommige gekweekte cellen celdood, terwijl andere celdeling ondergaan; het behoud van het totale celnummer kan dus niet de rustgevende status van elke cel aangeven.
Ondanks deze beperkingen zullen de cultuuromstandigheden die worden beschreven in het protocol dat in deze studie is ontwikkeld, het onderzoek en de engineering van HSC's helpen bevorderen, met name onder bijna fysiologische omstandigheden. Kweekomstandigheden die HSC's met minimale differentiatie en fietsactiviteit behouden, zouden geschikt zijn voor het testen van biologische en chemische verbindingen die specifiek op HSC's werken, het manipuleren van HSC's via lentivirustransductie of genoombewerking zonder het verlies van stamness, en het verduidelijken van de eerste stap van transformatie geïnduceerd door leukemie-geassocieerde genen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling in verband met deze studie.
Acknowledgments
We danken M. Haraguchi en S. Tamaki voor technische ondersteuning en laboratoriumbeheer en K. Shiroshita voor het maken van foto's. HK werd gedeeltelijk ondersteund door de KAKENHI Grant van MEXT/JSPS (grant no. 19K17847) en National Center for Global Health and Medicine. KT werd gedeeltelijk ondersteund door KAKENHI Grants van MEXT/JSPS (subsidienr. 18H02845 en 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (subsidienr. 26-001 en 19A2002), AMED (subsidienr. JP18ck0106444, JP18ae0201014 en JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation en Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
| NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
| Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
| Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
| Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
| Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
| Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
| Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
| Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
| Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
| Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
| Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
| Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
| Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
| DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
| Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
| Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
| Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
| Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
| Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
| Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
| EDTA 2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
| Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
| Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
| Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
| Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
| Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
| Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
| FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
| VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
| Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
| Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
| Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
| Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
| Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |
References
- Scala, S., Aiuti, A. In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions. Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).
- Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. Awakening dormant haematopoietic stem cells. Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Sun, J., et al. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).
- Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis. Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).
- Pineault, N., Abu-Khader, A. Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation. Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Cohen, S., et al. Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study. Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).
- Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Mendelson, A., Frenette, P. S. Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration. Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Xie, W., et al. Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes. Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Bai, T., et al. Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel. Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Kobayashi, H., et al. Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).
- Kikushige, Y., et al. Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival. Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).
- Ieyasu, A., et al. An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
