Summary
פרוטוקול זה מאפשר שמירה על תאי גזע המטטופיאטיים אנושיים רגיעה במבחנה על ידי חיקוי microenvironment מח העצם באמצעות חומצות שומן בשפע, כולסטרול, ריכוזים נמוכים יותר של ציטוקינים, והיפוקסיה.
Abstract
תאי גזע hematopoietic אנושי (HSCs), כמו HSCs יונקים אחרים, לשמור על hematopoiesis לכל החיים במח העצם. HSCs נשארים רגיעה vivo, בניגוד אבות מובחנים יותר, ולהיכנס למחזור התא במהירות לאחר כימותרפיה או הקרנה לטיפול פגיעה במח העצם או בתרבות במבחנה. על ידי חיקוי microenvironment מח העצם בנוכחות חומצות שומן בשפע, כולסטרול, ריכוז נמוך של ציטוקינים, היפוקסיה, HSCs אנושי לשמור על שביעות שפל במבחנה. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לשמירה על HSCs פונקציונליים במצב השבתה במבחנה. שיטה זו תאפשר מחקרים על התנהגותם של HSCs אנושיים בתנאים פיזיולוגיים.
Introduction
תאי גזע hematopoietic (HSCs) ותאי אב רב-פוטנטיים (MPPs) יוצרים באופן מתואם מאגר לחידוש מתמשך של תאים מובחנים כדי לשמור על hematopoiesis לאורך כל החיים בבני אדם1. השבתה במחזור התא היא תכונה בולטת של HSCs, המבדילה אותם מ- MPPs2. באופן קונבנציונלי, HSCs נחשבים להתגורר בשיא ההיררכיה של מערכת hematopoietic, לייצר את כל תאי הדם מובחנים. מודל היררכי זה הסיק בעיקר מניסויי השתלה3. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו על כך שהדינמיקה של HSCs שונה ב- vivo בהשוואה לאלה בניסויי השתלה4,5,6,7. ניסויי מעקב שושלת באמצעות מספר מערכות barcoding גילה כי HSCs מורין phenotypic אינם סוג תא ייחודי התורם hematopoiesis מצב יציב, ו MPPs, אשר מציגים פעילות התחדשות עצמית מוגבלת על הגדרות ההשתלה, ברציפות לספק תאידםבוגרים 4,5,8. לעומת זאת, התרומה של HSCs לתאים בוגרים משופרת לאחר פגיעה במחהעצם 4. ניתן לייחס זאת לשינויים דרסטיים במיקרו-ווירונימנט בעקבות אבלציה של מח העצם, כולל השתלת מח עצם. למרות החלת מעקב שושלת של תאי מורין על תאים אנושיים קשה, ניתוח פילוגנטי המשלב בידוד מושבה חד-תאית ריצוף הגנום כולו גילה תכונה דומה של מערכת hematopoietic, שבו הן HSCs ו MPPs אחראים לייצור היומי של תאים בוגרים7. לכן, למרות השתלה חיונית לבדיקת פעילות מורין או אדם HSC, מודלים ניסיוניים אחרים נדרשים כדי להבין את ההתנהגויות של HSCs בתנאים פיזיולוגיים.
שיטות Culturing עבור HSCs נחקרו בפירוט כדי להבין את היישומים הקליניים שלהם ואת המאפיינים. HSCs אנושי ניתן להרחיב במבחנה באמצעות שילוב של ציטוקינים, שחזור של מטריצות חוץ תאיות, הסרת יריבים להתחדשות עצמית, תרבות משותפת עם תאים mesenchymal או אנדותל, תוספת של אלבומין או החלפתו, התמרה של גורמי שעתוק עצמית, ותוספת של תרכובות מולקולה קטנה9,10. חלק משיטות אלה, כולל תוספת של תרכובות קטנות SR111 ו UM17112, נבדקו בניסויים קליניים עם תוצאות מבטיחות9. בהתחשב באופי רגיעה של HSCs ב vivo, שמירה על HSCs עם רכיבה על אופניים תא מינימלי הוא קריטי עבור recapitulating התנהגות HSC במבחנה. HSCs רגיעה ושגשוג להפגין ערך מחזור תאים דיפרנציאלי13, מצב מטבולי14, וסובלנות נגד לחצים מרובים15 . השיטות המשמשות לשמירה על רגיעה של HSCs אנושי במבחנה מוגבלות.
על ידי חיקוי microenvironment של מח העצם (היפוקסי ועשיר שומנים) ואופטימיזציה של ריכוז ציטוקינים, HSCs אנושי יכול להישמר מובחן ורגיעה תחת התרבות. סיכום מחדש של האופי המרגיע של HSCs במבחנה ישפר את ההבנה של תכונות המצב היציב של HSCs ויאפשר מניפולציה ניסיונית של HSCs.
Protocol
הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות המרכז הלאומי לבריאות ורפואה גלובלית. כל ההליכים הניסיוניים המבוצעים בעכברים מאושרים על ידי הוועדה הלאומית לניסויים בבעלי חיים של המרכז הלאומי לבריאות ורפואה.
הערה: סקירה כללית של הפרוטוקול מאוירת באיור 1.
1. הכנת שומנים
- להמיס את השומנים הבאים מתנול בצינורות זכוכית בריכוזים המצוינים: נתרן פלמיטט, 16 מ"ג / מ"ל; נתרן אולאט, 30 מ"ג/מ"ל; וכולסטרול, 4 מ"ג / מ"ל. יש לאחסן את תמיסת השומנים ב-30°C ולהפשיר את הדגימה לפני השימוש.
- מערבבים את פתרונות השומנים שהוכנו בשלב 1.1 בצינור זכוכית טרי במינונים הדרושים כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל פלמיאט, 100 מיקרוגרם / מ"ל oleate, ו 20 מיקרוגרם / מ"ל כולסטרול. לדוגמה, בעת הכנת 10 מ"ל של מדיה תרבותית, לערבב 62.5 μL של פתרון palmitate, 33 μL של פתרון oleate, ו 50 μL של פתרון כולסטרול בצינור הזכוכית.
- אידו את המתנול על ידי העברת גז חנקן דרך תמיסת השומנים (איור 2A ו-2B). אם גז חנקן אינו זמין, להעביר אוויר דרך הפתרון באמצעות פיפטה סיוע.
- לאדות לחלוטין את המתנול הנותר על ידי חימום צינור הזכוכית באמבט מים ב 37 °C(איור 2C).
הערה: השימוש בריכוז גבוה של גז N2 בחלל סגור עלול להזיק. למרות נפח המשמש בפרוטוקול כדי לאדות מתנול מוגבל ולכן נחשב בטוח, אוורור החדר כראוי ותיוג אזורים של ריכוזים גבוהים פוטנציאליים של גז N2 חשוב אם דליפת גז בלתי צפויה להתרחש.
2. הכנה בינונית
- הכינו את מדיום הנשר (DMEM)/F12 הבינוני של Dulbecco (עם HEPES וגלוטמין). מוסיפים פניצילין וסטרפטומיצין גופרתי למדיום לריכוז הסופי של 50 יחידות ו-50 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה. DMEM / F12 בינוני המכיל אנטיביוטיקה ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 חודשים.
- הוסף 4% w/v של אלבומין סרום שור (BSA) למדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/F12 בינוני (עם HEPES וגלוטמין).
- כוונן את רמת ה- pH של המדיום ל- pH 7.4-7.8 באמצעות פתרון NaOH, בדרך כלל ל- pH 7.6.
- מוסיפים את המדיום לצינור הזכוכית שהוכן בשלב 1. כדי להשיג פתרון עם מסיסות מקסימלית, תוספת של 3-15 מ"ל בינוני מומלץ.
- ממיסים לחלוטין את השומנים על ידי sonication (אופטימלי: יותר מ 20 דקות של sonication). לאחר BSA ושומנים מומסים, המדגם צריך להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס ומשמש בתוך 2 חודשים. הפשרה מיד לפני השימוש.
- הוסף 1/1,000 של אינסולין, transferin, נתרן סלניט, ואתנולאמין (ITS-X) תערובת DMEM/F12. סנן את המדיה המעורבת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר (המוגדר כ"מדיית תרבות"). לפני השימוש, להוסיף גורם תא גזע אנושי (SCF) ו תרומבופויאטין אנושי (TPO) למדיה התרבות בריכוז הסופי של 3 ng/mL כל אחד. לאחר הוספת ציטוקינים ו- ITS-X, לא ניתן לאחסן את המדיום.
- מאגר כתמים: הוסף 10% FCS לתמיסת מלח (PBS) נטולת פוספטים ללא Ca ו-Mg. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 שבועות.
- הפשרת מדיה: הוסף 10% FCS ל- DMEM/F12. פתרון זה הוא חד-פעמי.
- פתרון מלאי ציטוקינים: להמיס כל SCF אנושי או TPO אנושי ב PBS (Ca- ו Mg-free) ב 20 מיקרוגרם / מ"ל. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס לפחות שנה אחת ללא אובדן פעילות. לאחר הפשרה, לאחסן את פתרון המלאי ב 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בתוך 1 חודש.
הערה: בדוק את המגרש לאחר כל רכישה כדי למנוע שונות במזהמים ב- BSA. תרבות HSCs באותו זמן עם קבוצות שונות של BSA ולבחון את מספר HSC פנוטיפי ביום 7 כמתואר להלן. אם אצוות BSA מציגה מספר נמוך או תדירות נמוכה של תאי CD34+ (למשל פחות ממחצית ממספר תאי הקלט), הימנע משימוש באצווה זו.
3. הכנת מח עצם אנושי CD34+ תאים
- לרכוש CD34 אנושי+ תאי מח עצם ולאחסן את התאים חנקן נוזלי עד השימוש. לחלופין, ניתן להשתמש בתאי מח עצם ממתנדב בריא או מתאי דם טריים לאחר אישור ועדת האתיקה של המכון והסכמת התורם.
- חם 10 מ"ל של מדיה הפשרה בצינור חרוט 15 מ"ל באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- להפשיר את התאים הקפואים בבקבוקונים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בתוך 2 דקות. לאחר ניגוב הבקבוקון עם 70% אתנול להסרת מזהמים, להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל את המדיום שחומם מראש משלב 3.2.
- צנטריפוגה צינור 15 מ"ל ב 200 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant בזהירות כדי לשמור על גלולה שלם (משאיר < 50 μL של בינוני). לשים מחדש את התאים עם המדיום הנותר ולהעביר אותם צינור 1.5 מ"ל על הקרח.
הערה: חשיפה לדגימות שמקורן בבני אדם ישירות ברירית כולל העין או הרקמה הפצועה עלולה לגרום לזיהום על ידי פתוגנים ידועים או לא ידועים; לכן, כפפות ומשקפיים מומלץ בעת טיפול בתאים אנושיים. גם אם CD34שנרכש + תאים לבדוק שלילי עבור וירוס הפטיטיס B (HBV), וירוס הפטיטיס C (HCV), וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV1), ניטור זהיר צריך להתבצע על פי הנחיות מוסדיות אם מתרחשת שכיחות חשיפה. פעל בהתאם להנחיות המוסדיות בעת סילוק חומרים החשופים לתאים אנושיים.
4. מיון HSCs
- סמן את התאים בנוגדנים מצומדים בפלואורוכרום. יש לערבב 50 μL של מאגר כתמים בתוספת 10 μL של אנטי CD34-FITC, 2 מיקרו-ל של אנטי-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 מיקרו-ל של אנטי-CD90-PE-Cy7 ו-10 מיקרו-ל של אנטי-CD45RA-PE. להחזיר את גלולת התא בתערובת הנוגדנים. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- הוסף 1 מ"ל של חיץ כתמים לשטוף את הנוגדנים. צנטריפוגה הצינורות ב 340 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את הסופרנט.
- Resuspend גלולת התא ב 0.5 מ"ל של חיץ כתמים + 0.1% פרופידיום יודיד. להעביר את ההשעיה לתוך צינור 5 מ"ל באמצעות מסנן 40 מיקרומטר.
- שער HSCs פנוטיפי בתוך PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- שבר באמצעות FACS אריה-IIIu ולמיין את התאים לתוך צינור 1.5 מ"ל מלא 500 μL של מדיה תרבותית (איור 3). באמצעות אסטרטגיית הגטינג המוצגת באיור 3, ~ 10% מהתאים CD34+ צפויים להיות HSCs פנוטיפיים.
הערה: אסטרטגיית gating מבוצעת כמתואר קודםלכן 16 תוך השמטת מכתים סמן שושלת בהתחשב בביטוי הנמוך של סמני שושלת ב CD34 + CD38- שבר מאנשים בריאים17 . - צנטריפוגה התאים ממוינים ב 340 × g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. בזהירות לשאוף את supernatant כדי להבטיח כי גלולה נשאר שלם.
- אחסן את התאים הממוינים בקרח עד לתרבות.
הערה: פיצוי פלואורסצנטי של חפיפה ספקטרלית צריך להתבצע במהלך הניסוי הראשון.
5. תרבות התאים
- העבר 200 μL של מדיה תרבות המכיל ציטוקינים מוכנים בשלב 2 לתוך שטוח למטה 96-באר צלחות.
- כדי למנוע אידוי של המדיום, למלא את כל בארות שאינם בשימוש עם 100-200 μL של PBS.
- התחדשו ב- HSCs הממוינים במדיית תרבות ללא ציטוקינים ב- 60 תאים/μL.
- Aliquot 600 HSCs / באר (10 μL של השעיית תא) לתוך כל באר. ניתן לשנות את מספר התא. פחות מ-300 תאים יובילו לשינוי טכני גדול יותר, ולכן יש צורך ביותר בארות לכל תנאי כדי לזהות הבדלים ביולוגיים. Culturing יותר מ 1000 תאים בבאר אחת יש להימנע בגלל ציטוקינים / מחסור בחומרים מזינים או הצטברות של ציטוקינים שליליים / כימוקינים.
- תרבית את התאים באינקובטור מרובה גזים לח ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 ו 1% O2 אטמוספרה.
- עבור תרבויות מעל 7 ימים, מומלץ להחליף מחצית מנפח המדיה כל 3-4 ימים. בזהירות לשאוף 100 μL של מדיה על ידי pipetting ולהוסיף 100 μL של מדיה תרבות שהוכן לאחרונה המכיל ציטוקינים לכל באר. יש לחמם מראש את המדיה התרבותית ב-37 מעלות צלזיוס.
6. ניתוח של פנוטיפים סמן באמצעות ציטומטריית זרימה
הערה: למרות שהתאים צריכים להיות מנותחים לאחר 7 ימים של תרבות, משך התרבות ניתן לשנות.
- השלך 170 μL של המדיום באמצעות פיפטה 8 ערוצים.
- תווית התאים עם תערובת הנוגדנים. יש לערבב 0.5 μL של אנטי-CD34-FITC, 0.1 מיקרו-ל' של אנטי-CD38-PerCP-Cy5.5, 0.25 מיקרו-ל' של אנטי-CD90-PE-Cy7, 0.5 מיקרו-ל' של אנטי-CD45RA-PE ו-9 מיקרו-μL של מאגר כתמים לבאר. מוסיפים 10 μL של התערובת לצלחת 96-באר להדגיר את התאים במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- כדי לשטוף את הנוגדנים, להוסיף 100 μL של חיץ כתמים לבארות צנטריפוגה הצלחות ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס באמצעות תאוצה נמוכה והאטה בינונית.
- בזהירות לשאוף 100 μL של supernatant כדי לשמור על התאים בתחתית בארות, ולאחר מכן resuspend התאים ב 200 μL של חיץ כתמים + 0.1% v / v של PI + 1% v / v של מיקרוספרות פלואורסצנטיות (למשל, פלואורוספירות Flow-Check).
- הגדר את מכשיר ציטומטריית הזרימה. להשיג נתונים עבור הדגימות במצב מהיר עם מצב מדגם מעורב על נפחי ספיגה של 100 μL.
- יצא את הנתונים בתבנית FCS ונתח אותם באמצעות תוכנה כגון FlowJo. ניתן לקבוע מספרי תאים באמצעות ספירת החרוזים הפלואורסצנטית. לדוגמה, אם החוקר מוסיף 2000 חרוזים לבאר וספירת החרוזים היא 700, הכפל את מספר התא של כל שבר ב- 2000/700 כדי להעריך את מספר התא הכולל של השבר בבאר.
הערה: מיקרוספרות פלואורסצנטיות רעילות לתאים בתרבית בגלל נוכחות של פורמלדהיד. זה עלול לגרום למוות תאי במהלך הניתוח. צמצם את מספר הבארות (<50 בארות) שנותחו ברציפות כדי למנוע הטיה.
7. השתלת HSCs אנושיים
הערה: פעילות אכלוס מחדש של תאים תרבותיים מאומתת על ידי השתלה לעכברים immunodeficient. כל ההליכים חייבים להיות מאושרים על ידי ועדות ניסוי בעלי חיים או המקבילים שלהם.
- כתורמים, הכינו מספר מספיק של עכברי NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) של 8-12 שבועות. כמו עכברי NOG רגישים מאוד לזיהום, לשמור על כלובי הרבייה נקי ככל האפשר להאכיל את העכברים עם דיאטה מעוקרת ומים.
- תרבות מספר הולם של HSCs להשתלה כמתואר בשלב 5. לדוגמה, כאשר 5000 HSCs (יום 0 שווה ערך) מושתלים ל 6 עכברים נמען, תרבות 35,000-40,000 HSCs ב 40 בארות של צלחת 96-באר (200 μL של מדיה תרבותית לבאר) או ב 8 בארות של צלחת 24-באר (1 מ"ל של מדיה תרבות לבאר). תרבות התאים במשך 2 שבועות עם חצי מדיה משתנה כל 3-4 ימים באינקובטור מרובה גז לח ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2 ו 1% O2. ניתן לשנות את משך התרבות.
- הקרנת עכברי NOG ב 2.5 Gy ב 6-24 שעות לפני ההשתלה.
- לאסוף את HSCs תרבית בצינורות 1.5 מ"ל. צנטריפוגה הצינורות ב 340 ×גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בזהירות לשאוף את supernatants ו resuspend התאים במאגר כתמים קרח קר סטרילי בצפיפות תאים של 5000 HSCs (יום 0 שווה ערך) לכל 200 μL. להעביר את ההשעיה ל 3 צינורות פוליפרופילן מ"ל. כדי לעקר את מאגר הכתמים, סנן אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- לפני ההשתלה, הרדמה את העכברים על ידי sevoflurane או שאיפת isoflurane.
- כדי להשתיל 5000 של HSCs תרבותי (יום 0 שווה ערך), להזריק 200 μL של השעיית התא לתוך וריד הזנב או סינוס מסלולית רטרו של עכברי NOG מוקרן בשלב 7.1 באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 27-מד. HSCs מח עצם מבודד טרי או מופשר ניתן להשתיל כפקד. כפפות צריך להיות מעוקר עם 70% v / v אתנול בין כל הליך.
8. ניתוח התדירות של תאים שמקורם בבני אדם בדם ההיקפי
- כדי לבחון אכלוס מחדש של תאים אנושיים, לאסוף את הדם ההיקפי ב 1, 2, ו 3 חודשים לאחר ההשתלה.
- לפני איסוף הדם ההיקפי, הרדמה את העכברים על ידי שאיפת sevoflurane.
- לאסוף 40-80 μL של דם היקפי מן הסינוס רטרו מסלולית באמצעות צינורות נימי זכוכית heparinized ולהשעות מדגם זה ב 1 מ"ל של PBS + הפרין (1 U / mL) ב 1.5 צינורות מ"ל.
- צנטריפוגה השעיית הדם ב 340 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS + 1.2% w / v dextran (200 kDa) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- להעביר את supernatant לצינור אחר 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 340 × גרם במשך 3 דקות.
- עבור תמוגה של תאי דם אדומים, resuspend התאים ב 0.17 M NH4Cl במשך 5 דקות.
- צנטריפוגה התא השעיה 340 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend התאים ב 50 μL של חיץ מכתים המכיל 0.3 μL של נגד עכבר Fc-block. דגירה מדגם זה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- הוסף את הנוגדנים הבאים עבור כתמי סמן פני השטח: 0.3 μL של העכבר CD45-PE-Cy7, 0.3 μL עכבר Ter-119-PE-Cy7, 0.3 μL של CD45-BV421 אנושי, 0.3 μL של CD13-PE אנושי, 1.2 μL של CD33-PE אנושי, 0.3 μL של CD19-APC אנושי, 0.3 μL של CD3-APC-Cy7 אנושי. דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של חיץ כתמים צנטריפוגה ב 340 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 200 μL של מאגר כתמים + 0.1% v / v של PI.
- להעביר את המתלה התא לצלחת שטוחה שטוחה 96-טוב ולרכוש נתונים באמצעות cytometer זרימה במצב מהיר עם מצב מדגם לערבב על נפח ספיגה של 100 μL.
- יצא את הנתונים בתבנית FCS לניתוח באמצעות תוכנה כגון FlowJo.
- תארגן את ציטומטר הזרימה. לרכוש נתונים עבור הדגימות במצב מהיר עם מצב מדגם לערבב על נפח ספיגה של 100 μL.
- יצא את הנתונים בתבנית FCS לניתוח באמצעות תוכנה כגון FlowJo.
Representative Results
לאחר 7 ימים של culturing HSCs מטוהרים, עד 80% מהתאים הציגו פנוטיפים סמן של CD34+CD38- (איור 4A). מספר התאים הכולל היה תלוי בריכוז הציטוקינים (איור 4B). ריכוזים גבוהים יותר של SCF ו- TPO גרמו לכניסה למחזור התא, התפשטות ובידול (איור 4B). מספר HSCs פנוטיפיים המאופיינים בפנוטיפי סמן של CD34+CD38-CD90+CD45RA- גדל ביחס לריכוזי SCF או TPO (איור 4B), בעוד התדירות בקרב כלל התאים ירדה (איור 4C). המספרים הכוללים של התאים היו שווים ב- SCF של 1.5 ng/mL וב- 4 ng/mL TPO ובשילובי 3 ng/mL SCF 3 ו- 2 ng/mL TPO, דבר המצביע על כך ש- HSCs הם רגיעה במהלך הפעלת מחזור תאים מינימלית. בהתחשב בהבדלים האינדיבידואליים, ציטוקינים מומלץ עבור כל תורם מח עצם.
לאחר 3 חודשים של השתלת HSCs מח עצם למבוגרים מתורבתים, ניתן להעריך את התדירות שלהם בדם ההיקפי של תאי CD45+ murine CD45- Ter119 אנושיים. שלושה שושלת, כולל תאי CD19+ B, תאים מיאלואידיים CD13/CD33+ ותאי CD3+ T, שוחזרו בעכברי NOG שהושתלו ב- HSCs שהופשרו זה עתה או ב- HSCs מתורבתים (איור 5).
איור 1. מבט כולל על ההליך. סיכום גרפי של ההליך כלל מיון, culturing, וניתוח תאי גזע hematopoietic אנושי (HSCs). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. הליך לאידוי מתנול מתמיסת השומנים. A) גליל גז חנקן עם ווסת גז. ב) נוהל להעברת גז חנקן דרך תמיסת השומנים המומסת במתנול. ג) שומנים הדבקים בתחתית צינור הזכוכית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. אסטרטגיית גטינג למיון HSCs. העלילות מציגות CD34מגודר +CD38-CD90+CD45RA- תאים. כ-10% מהתאים CD34+ היו HSCs פנוטיפיים.
איור 4. מספרי תאים מייצגים לאחר 7 ימים של פולחן. א) נציג פלואורסצנטיות מופעל תא מיון העלילה לאחר culturing HSCs ב SCF (3 ng/mL) ו TPO (2 ng/mL). שבר 1 הועשר עבור תאים חיים, שבר 2 הועשר לתאים מתים, וחלק 3 הועשר לפסולת. מספרים הצבועים בוורוד מציינים את התדירות (%) של השבר המגודר. ב) מספר כל HSCs, CD34+CD38- תאים, ו CD34+CD38-CD90+CD45RA- תאים לאחר culturing 600 HSCs בתנאי ציטוקינים המצוין. קווים מקווקווים אדומים מציינים את המספר ההתחלתי של תאי קלט. S: SCF, T: TPO. ממוצע ± סטיית תקן, n = 4. המספרים הבאים S ו- T מציינים את הריכוז (ng/mL) של כל ציטוקינים. ג) תדירות של CD34+CD38- ו- CD34+CD38-CD90+CD45RA- תאים בתנאי ציטוקינים שצוינו. S: SCF, T: TPO. ממוצע ± סטיית תקן, n = 4. קווי השגיאה עבור תאים המחורבתים ב- SCF (1 ng/mL) וב- TPO (0 ng/mL) הושמטו עקב הערכים הגבוהים שלהם (37.7 ו- 47.9, בהתאמה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. נציג FACS חלקות של עכברים תורמים לאחר 3 חודשים של השתלה. בסך הכל 5000 מופשר טרי (לוחות עליונים) ו 2 שבועות מתורבת HSCs (3 ng/mL SCF ו 3 ng/mL TPO; לוחות תחתונים) הושתלו לתוך עכברי NOG. hCD19 מסמן תאי B אנושיים, hCD13 ו hCD33 מסמנים תאים מיאלואידיים אנושיים, ו- hCD3 מסמן תאי T אנושיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
לאחרונה, מספר שיטות להרחבת HSCs עם בידול מינימלי דווחו18,19,20,21. למרות שיטות אלה מצוינים, HSCs נאלצים להפעיל את מחזורי התא שלהם בנוכחות רמות גבוהות של ציטוקינים, אשר שונה ממצב in vivo שבו HSCs להראות רכיבה מינימלית. פרוטוקול זה שימושי לשמירה על HSCs כמו רגיעה, כפי שנצפה vivo, על ידי recapitulating microenvironment מח העצם.
על ידי culturing HSCs אנושי תחת ציטוקינים נמוכים, שומנים עשירים, תנאים היפוקסיים, HSCs הראו רכיבה מינימלית תוך שמירה על פנוטיפים סמן שלהם. השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא הכנת מדיום המכיל ריכוז גבוה של חומצות שומן וכולסטרול וריכוזי ציטוקינים נמוכים ותרבות תחת היפוקסיה (שלב 1, שלב 2 ושלב 4). ללא כולסטרול ו/או חומצות שומן, שיעור התחזוקה של HSCs תחת ריכוזי ציטוקינים נמוכים מקטין22. Culturing של תאים בתנאים היפוקסיים חשוב גם, כפי שדווח בעבר23.
תנאי התרבות היו דומים לאלה המשמשים HSCs מורין, למעט ריכוזי ציטוקינים. HSCs מורין לשרוד ללא TPO, ואילו HSCs אנושי דורשים לפחות 2 ng/mL של TPO עם 3 ng/mL של SCF22. כמו ריכוז של TPO הוא הרבה יותר גבוה מזה בסרום אנושי (~ 100 pg/mL), התנאים המשמשים בפרוטוקול זה עשוי להיות חסר גורמים ספציפיים כדי לתמוך בהישרדות של HSCs אנושי. FLT3 מתבטא HSCs אנושי24. תוספת של FLT3LG ligand שלה מקטין מעט את הדרישה עבור TPO כדי לשמור על HSCs22.
HSCs אנושי דורש ריכוז גבוה יותר של כולסטרול לעומת HSCs מורין, ככל הנראה בגלל חוסר היכולת לגרום לביטוי של אנזימים סינתזה כולסטרול רגישות lipotoxicity תחת ריכוזים גבוהים (>400 מיקרוגרם / מ"ל) של חומצות שומן22. למרות שרק השילוב של חומצות פלמיטיות, אולאיות, לינולאיות וסטאריות נבדק, אשר נמצאות בשפע בסרום האנושי, יש להעריך שילובים אחרים של שומנים כדי להפחית ליפוטוקסיות ולשפר את קצב השמירה על HSCs תפקודיים.
למרות שפעילות אכלוס מחדש של HSCs אנושיים תרבותיים בעכברים immunodeficient לאחר שבועיים של תרבות אושרה22, מערכת תרבות זו אינה מסכמת באופן מלא את פונקציות הנישה של HSCs ב vivo. הביטוי של CD45RA דווח להגדיל את קיבולת אכלוס מחדש הוא נחות מזה של HSCs22מיון טרי . עם זאת, ניתן לייעל את ריכוזי החומרים המזינים, כגון גלוקוז, חומצת אמינו, פירובט ואינסולין, המתווסף למדיום ברמות סופראפיזיולוגיות. מזהמים ב- BSA עלולים גם לסכן את התחזוקה של HSCs18,25. בנוסף, חלק מהתאים המתורבתים עוברים מוות תאי, בעוד שאחרים עוברים חלוקת תאים; לפיכך, ייתכן שהתחזוקה של מספר התא הכולל לא תציין את המצב המרגיע של כל תא.
למרות מגבלות אלה, תנאי התרבות המתוארים בפרוטוקול שפותח במחקר זה יסייעו לקדם את המחקר וההנדסה של HSCs, במיוחד בתנאים כמעט פיזיולוגיים. תנאי תרבות השומרים על HSCs עם בידול מינימלי ופעילות רכיבה על אופניים יתאימו לבדיקת תרכובות ביולוגיות וכימיות הפועלות במיוחד על HSCs, מניפולציה HSCs באמצעות התמרת lentivirus או עריכת גנום ללא אובדן גזע, ומבהיר את הצעד הראשוני של טרנספורמציה הנגרמת על ידי גנים הקשורים לוקמיה.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים הקשור למחקר זה.
Acknowledgments
אנו מודים למ. הרגוצ'י וס. טמקי על התמיכה הטכנית וניהול המעבדות ולק. שירושיטה על הצילומים. HK נתמך בחלקו על ידי מענק KAKENHI מ MEXT / JSPS (מענק מס '19K17847) והמרכז הלאומי לבריאות ורפואה גלובלית. KT נתמך בחלקו על ידי מענקי KAKENHI מ MEXT / JSPS (מענק מס '18H02845 ו 18K19570), המרכז הלאומי לבריאות ורפואה גלובלית (מענק מס '26-001 ו 19A2002), AMED (מענק מס '. JP18ck0106444, JP18ae0201014, ו JP20bm0704042), קרן המחקר הרפואי אונו, קרן המחקר הרפואי Kanzawa, קרן טקדה למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
| NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
| Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
| Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
| Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
| Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
| Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
| Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
| Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
| Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
| Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
| Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
| Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
| Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
| DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
| Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
| Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
| Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
| Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
| Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
| Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
| EDTA 2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
| Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
| Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
| Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
| Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
| Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
| Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
| FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
| VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
| Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
| Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
| Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
| Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
| Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |
References
- Scala, S., Aiuti, A. In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions. Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).
- Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. Awakening dormant haematopoietic stem cells. Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Sun, J., et al. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).
- Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis. Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).
- Pineault, N., Abu-Khader, A. Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation. Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Cohen, S., et al. Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study. Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).
- Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Mendelson, A., Frenette, P. S. Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration. Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Xie, W., et al. Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes. Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Bai, T., et al. Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel. Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Kobayashi, H., et al. Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).
- Kikushige, Y., et al. Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival. Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).
- Ieyasu, A., et al. An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
