Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D-клеточная печать гипоксического рака на чипе для рекапитуляции патологической прогрессии солидного рака

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61945
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1,3
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University
* These authors contributed equally

Summary

Гипоксия является отличительной чертой микроокружения опухоли и играет решающую роль в прогрессировании рака. В этой статье описывается процесс изготовления гипоксического рака на чипе на основе технологии 3D-печати клеток для повторения патологии рака, связанной с гипоксией.

Abstract

Рак микроокружения оказывает значительное влияние на прогрессирование заболевания. В частности, гипоксия является ключевым фактором выживания при раке, инвазии и хеморазистанции. Хотя для изучения патологии рака, связанной с гипоксией, было разработано несколько моделей in vitro, сложное взаимодействие микроокружения рака, наблюдаемое in vivo, еще не было воспроизведено из-за отсутствия точного пространственного контроля. Вместо этого были предложены подходы к 3D-биофабрикации для создания микрофизиологических систем для лучшей эмуляции экологии рака и точной оценки противоопухолевого лечения. Здесь мы предлагаем подход к 3D-клеточной печати для изготовления гипоксического рака на чипе. Вызывающие гипоксию компоненты в чипе были определены на основе компьютерного моделирования распределения кислорода. Концентрические кольца Рак-строма были напечатаны с использованием биолинь, содержащих клетки глиобластомы и эндотелиальные клетки, для рекапитуляции типа солидного рака. Полученный чип реализовал центральную гипоксию и усугубил злокачественность при раке с образованием репрезентативных патофизиологических маркеров. В целом, ожидается, что предлагаемый подход к созданию микрофизиологической системы с твердым раком и миметикой преодолеет разрыв между моделями in vivo и in vitro для исследований рака.

Introduction

Микроокружение рака является критическим фактором, стимулирующим прогрессирование рака. Множественные компоненты, включая биохимические, биофизические и клеточные сигналы, определяют патологические особенности рака. Среди них гипоксия тесно связана с выживаемостью при раке, пролифрацией и инвазией1. Из-за неограниченного роста и деления раковых клеток питательные вещества и кислород непрерывно истощаются, и генерируется гипоксический градиент. В условиях низкого содержания кислорода клетки активируют молекулярный каскад, связанный с гипоксией индуцируемым транскрипционным фактором (HIF). Этот процесс индуцирует некротическое ядро, запускает метаболические изменения и инициирует гиперплазию кровеносных сосудов и метастазирование2,3. Впоследствии гипоксия в раковых клетках вызывает разрушение соседних нормальных тканей. Кроме того, гипоксия тесно связана с терапевтической устойчивостью солидных опухолей многофакторными способами. Гипоксия может сильно препятствовать лучевой терапии, так как радиочувствительность ограничена из-за активных форм кислорода1,4. Кроме того, снижается уровень рН раковых микросред, что уменьшает накопление препарата1. Поэтому воспроизведение патологических особенностей, связанных с гипоксией in vitro, является перспективной стратегией для научных и доклинических результатов.

Моделирование конкретной микросреды рака имеет важное значение для понимания развития рака и изучения соответствующих методов лечения. Хотя животные модели широко используются из-за их сильной физиологической значимости, существуют вопросы, связанные с видовых различиями и этическими проблемами5. Кроме того, хотя обычные 2D- и 3D-модели позволяют манипулировать раковыми клетками в режиме реального времени для углубленного анализа, их архитектурная и клеточная сложность не может быть полностью повторена. Например, модели раковых сфероидов широко используются, так как агрегация раковых клеток в сфероиде может естественным образом генерировать гипоксию в ядре. Кроме того, большое количество клеточных сфероидов однородного размера было получено с использованием многоязычных систем6, 7наосновепластика или силикона. Однако более низкая гибкость в отношении захвата точной гетерогенной структуры раковых тканей с помощью обычных платформ потребовала создания передовой технологии биофабрикации для создания высокобиомиметической платформы для улучшения исследований рака8.

3D микрофизиологические системы (MPS) являются полезными инструментами для рекапитуляции сложной геометрии и патологического прогрессирования раковых клеток9. Поскольку раковые клетки ощущают биохимический градиент факторов роста и хемокиных веществ и механическую гетерогенность, воспроизводимую в системе, важные особенности развития рака могут быть исследованы in vitro. Например, жизнеспособность рака, метастатическая злокачественность и лекарственная устойчивость в зависимости от изменяющихся концентраций кислорода были изучены с использованием MPSs10,11. Несмотря на последние достижения, создание гипоксических состояний моделей in vitro зависит от сложных процедур изготовления, включая соединение с физическими газовыми насосами. Поэтому необходимы простые и гибкие методы построения специфических для рака микросред.

Технология 3D-печати клеток привлекла значительное внимание из-за ее точного контроля пространственного расположения биоматериалов для рекапитуляции нативных биологических архитектур12. В частности, эта технология преодолевает существующие ограничения моделей 3D-гипоксии благодаря своей высокой управляемости и возможности построения пространственных особенностей микроокружения рака. 3D-печать также облегчает автоматизированное производство с помощью послойного процесса, тем самым обеспечивая быстрое, точное и воспроизводимое построение сложных геометрий для имитации фактических архитектур тканей. В дополнение к преимуществам существующих стратегий производства 3D MPS, патофизиологические особенности прогрессирования рака могут быть воспроизведены путем паттернов биохимических, клеточных и биофизических компонентов13,14.

Здесь мы представляем стратегию 3D-печати клеток для гипоксического рака на чипе для рекапитуляции гетерогенности твердого рака(рисунок 1)15. Параметры изготовления были определены с помощью вычислительного моделирования образования центральной гипоксии в системе. Концентрические кольца Рака-Стромы были напечатаны с использованием коллагеновых биоинков, содержащих клетки глиобластомы и эндотелиальные клетки, чтобы имитировать патофизиологию глиобластомы, типа солидного рака. Образование радиального градиента кислорода усугубляет злокачественность рака, что свидетельствует об усилении агрессивности. Кроме того, мы указываем будущие перспективы применения чипа к доклиническим моделям, специфичным для пациента. Ожидается, что предлагаемый подход к созданию твердой миметической микрофизиологической системы рака преодолеет разрыв между моделями рака in vivo и in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Компьютерное моделирование образования градиента кислорода

  1. Генерация 3D-геометрической модели для гипоксической печати рака на чипе
    1. Запустите программное обеспечение 3D CAD.
    2. Набросок геометрической модели гипоксического рака на чипе. Нажмите на Sketch и выберите нужную плоскость, чтобы нарисовать геометрию. Обратитесь к чертежу(рисунок 2A)для детального масштабирования каждой детали.
    3. Установите толщину геометрии, нажав на Feature-Protrusion Boss/Base. Введите желаемую толщину (см. рисунок 2A)в пустое поле и выберите зеленый значок галочки, чтобы сформировать 3D-геометрию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер рака на чипе определяется на основе желаемых объемов среды и гидрогеля. В настоящем эксперименте желаемые объемы среды и гидрогеля составляли приблизительно 1 500 мкл и 500 мкл соответственно, исходя из предыдущего практического опыта разрешения биопринтера на основе экструзии.
    4. Сохраните файл геометрии в формате 3D CAD (.prt или .stl).
  2. Определение клеточной плотности для индукции гипоксического ядра
    1. Запустите программу моделирования физической диффузии.
    2. Нажмите на LiveLink и выберите используемую программу САПР. Нажмите «Синхронизировать», чтобы импортировать геометрию гипоксического рака на чипе в программе моделирования. Поскольку внутреннее пространство камеры будет заполнено питательной средой в реальных экспериментальных условиях, кислород будет диффундировать через внутреннее пространство камеры и клеточную конструкцию, которая будет состоять из нагруженных клетками гидрогелей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущему исследованию для получения подробной информации о физических параметрах15.
    3. Определите импортированную 3D-геометрию как контрольный объем пространства, в котором кислород диффундирует, а клетки потребляют кислород(рисунок 2B).
    4. Запустите компьютерный анализ для газодиффузионного анализа в соответствии с руководством пользователя и ранее установленными методами16,17.
    5. Из результатов компьютерного анализа экспортируйте данные о расчетной концентрации кислорода по поперечному сечению A-A' в каждый момент времени, следуя руководству пользователя. Управляющее уравнение основано на первом законе Фика, выраженном в Eq. (1)(Рисунок 2C).
      Equation 1
      где c — концентрация, D — коэффициент диффузии кислорода, N-клетка — плотность клеток, Equation 2 — максимальная скорость поступления кислорода, а Km — постоянная Михаэлиса-Ментена. Константы применялись так, как описано в предыдущей публикации15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая точка времени означает пошаговую точку для наблюдения за изменением диффузии кислорода с течением времени.
    6. Оцените, достигает ли минимальный уровень кислорода порога гипоксии и повторите процесс компьютерного анализа с увеличением или снижением плотности клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите, что градиент гипоксии образуется в конструкции, если уровень кислорода 80% в области гидрогеля составляет менее 0,02 мМ через 24 ч.
    7. Подтвердите количество клеток, необходимых для генерации градиента кислорода, индуцируя гипоксию в центральной области, из первого закона Фика на шаге 1.2.5 и результатов моделирования из шага 1.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе номер ячейки составлял 2 × 106 ячеек / каждая конструкция.

2. Клеточная культура раковых клеток и стромальных клеток

  1. Подготовка среды клеточной культуры во избежание физиологического стресса
    1. Для клеток U-87 MG (увековеченная клеточная линия глиобластомы человека) поместите 12 мл высокоуглекозаточной модифицированной среды Eagle от Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычий сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина в колбу для клеточной культуры T-75 в увлажненный инкубатор с температурой 37 ° C, 5% CO2 в течение 30 минут, чтобы свести к минимуму тепловое и щелочное воздействие среды на клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глиобластома была выбрана в качестве типа солидного рака, потому что она имеет агрессивные характеристики в гипоксической среде. Другие различные виды рака могут быть применены к этой модели.
    2. Для эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVECs) поместите 12 мл среды роста эндотелиальных клеток в колбу для культуры клеток Т-75 в 5%CO2 увлажненный инкубатор при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HUVEC были выбраны, потому что это одна из наиболее репрезентативных эндотелиальных клеточных линий. Различные типы стромальных клеток также могут быть применены к этой модели.
  2. Быстрое оттаивание криоконсервных раковых клеток и стромальных клеток и их поддержание
    1. Переместите криовиалы, содержащие 5 x10 5 U-87 MG клеток и HUVEC, из контейнера с жидким азотом в ламинарную проточную тумба. Немедленно ослабьте и запрягьте колпачок, чтобы освободить внутреннее давление.
    2. Аккуратно поместите криоконсервированную клетку на водяную баню при 37 °C в течение 2 минут, не допуская крышку из воды. Промыть флаконы 70% этанолом под ламинарным потоком, чтобы предотвратить загрязнение.
    3. Переместите размороженные клетки в колбы, содержащие подготовленную питательную целлюлозу клеток, описанную на этапе 2.1, и поместите клеткосодержащие колбы в 5%CO2 увлажненный инкубатор при 37 °C для восстановления клеток.
    4. Обновляйте питательные среды каждые 2 дня и поддерживайте рост клеток.
    5. После 24 ч оттаивания замените питательную целлюлозу клеток, чтобы избежать цитотоксичности диметилсульфоксида (ДМСО), который использовался для замораживания клеток. Используйте HUVEC, который прошел менее 6 проходов.

3. Приготовление коллагенового прегелевого раствора

  1. Солюбилизация коллагеновой губки соляной кислотой (HCl) 0,1 Н
    1. Подготовьте раствор 0,1 Н HCl и процедить его шприцевым фильтром 0,2 мкм.
    2. Для 3 мл 1% (мас./об.) нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля готовят коллагеновые губки, нарезанные на 5 х 5 мм2 штуки и весом 30 мг.
    3. Переложите нарезанные кусочки коллагена в стерильный стеклянный флакон 10 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте в 1,5 раза больше объема необходимого гидрогеля коллагена, учитывая потерю гидрогеля из-за липкой характеристики раствора коллагена.
    4. Добавьте 2,4 мл 0,1 N HCl в коллагенсодержащий стеклянный флакон и инкубирует его на коромысле при 15 об/мин и 4 °C в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем раствора 0,1 N HCl составлял четыре пятых от конечного объема требуемого гидрогеля коллагена. В этом случае было приготовлено 3 мл коллагена.
    5. После пищеварения просейте непереваренные частицы коллагена с помощью клеточного ситечкового фильтра 40 мкм. Храните кислый раствор коллагена при 4 °C и используйте в течение 7 дней.
  2. Коррекция pH для 1% нейтрализованного раствора коллагена
    1. Центрифугировать кислый раствор коллагена при 1224 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Добавьте 30 мкл фенольных красных растворов в качестве показателя рН к конечной концентрации 1% (v/v) и 300 мкл 10x фосфат-буферного солевого (PBS) буфера до конечной концентрации 10% (v/v) в растворе коллагена прегеля.
    3. Нейтрализуют рН до 7 с помощью 1 N гидроксида натрия (NaOH), проверяя изменение цвета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из формулы, моли H+ = молярность H+ x объем H+ = моли OH-= молярность OH- x объем OH-, добавьте 240 мкл NaOH.
    4. Добавьте дистиллированную воду для получения общего объема 3 мл.
    5. После корректировки pH храните 1% (мас./об.) нейтрализованный раствор коллагена при 4 °C и используйте в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предварительно проверить гелеобразование нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля, сделайте 50 мкл капель коллагена на небольшой посуде с использованием пипетки с положительным смещением и инкубировать их в инкубаторе 37 °C в течение 1 ч. Обратитесь к следующим трем методам для проверки перекрестной связи капель коллагена.
    6. Проверьте, изменился ли цвет коллагена на непрозрачный белый с прозрачного цвета.
    7. Наклоните контейнер и проверьте, прилип ли коллаген к дну контейнера.
    8. Налейте 1x PBS на капли и проверьте, не нарушена ли конструкция коллагена в растворе.

4.3D печать газопроницаемого барьера

  1. 3D-печать жертвенной поли (этилен-винилацетатной) (PEVA) формы
    1. Сгенерируйте 3D-геометрию жертвенной формы PEVA, определенной на шаге 1, с помощью программного обеспечения 3D CAD(рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-геометрия и детальный масштаб модели, включая размеры, единицы измерения и типы линий, были показаны на рисунке 2A.
    2. Конвертируйте файл 3D CAD в формат STL, нажав на файл | Сохранить тип файла как STL. Кроме того, нажмите на опцию | Форма вывода в виде ASCII для генерации G-кода.
    3. Нажмите на файл | Откройте STL-файл и выберите сохраненный STL-файл, чтобы импортировать сгенерированный STL-файл. Нажмите на Модель Slice STL-CAD обменника, чтобы автоматически сгенерировать G-код жертвенной формы PEVA(рисунок 3B,C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Путь печати генерируется с соединением пересекающихся точек между фундаментальной фигурой STL-файла и плоскостью нарезки (т.е. слоем). По сути, фундаментальной фигурой фрагмента в STL-файле является треугольник, содержащий 3D-координаты. После получения пересекающихся точек между треугольником и слоем генерируется G-код для печати путем соединения каждой точки без перекрывающегося контура на слое18. Любой алгоритм генерации G-кода на борту программного обеспечения может быть использован для создания путей печати для изготовления чипа.
    4. Подготовьте стерильный клей и гидрофильный гистологический слайд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофильное слайд-стекло имеет решающее значение для постоянного связывания полидиметилсилоксана (PDMS) на стекле и адгезии коллагеновых конструкций, инкапсулирующих раковые клетки и стромальные клетки.
    5. Печать жертвенной формы PEVA на слайде с помощью прецизионного сопла 50 G при пневматическом давлении 500 кПа при 110 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина линии зависит от скорости подачи, датчика сопла и температуры материала. Было использовано сопло 50 G и применена скорость подачи 400 для создания ширины линии 500 мкм для жертвенной стенки. Датчик сопла, пневматическое давление и скорость подачи определяются с практическими результатами19. Жертвенная стенка должна быть достаточно толстой, чтобы удерживать раствор PDMS, что является следующим этапом изготовления.
  2. Литье полидиметилсилоксана (PDMS) барьера
    1. Однородно смешайте 6 мл эластомера на основе PDMS и отверждающего агента 0,6 мл в течение 5 мин в пластиковом резервуаре. Это может изготовить 6 гипоксических раковых чипов, учитывая потерю из-за липкой характеристики PDMS.
    2. Загрузите смешанный раствор PDMS в одноразовый шприц объемом 10 мл и подойдите к шприцевой головке с пластиковым коническим наконечником дозирования 20 г.
    3. Наполните жертвенную форму PEVA смешанным раствором PDMS в шприце. Смешанный PDMS наполнит жертвенную форму PEVA выпуклой поверхностью. Высота барьера PDMS будет выше, чем у пресс-формы PEVA.
    4. Отверждите барьер PDMS в печи при 40 °C в течение более 36 ч, чтобы избежать плавления PEVA. Не повышайте температуру до более чем 88 °C, что является температурой плавления PEVA.
    5. Отсоедините жертвенную форму PEVA парой прецизионных пинцетов и стерилизуйте газопроницаемый барьер при 120 °C в автоклаве.

5. Получение инкапсулированных в клетки коллагеновых биоин

  1. Отслоение подготовленных раковых клеток и стромальных клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая жизнеспособность клеток, весь процесс печати должен быть завершен как можно скорее после отсоединения ячеек.
    1. Промывайте раковые и стромальные клетки 10 мл 1x PBS с помощью серологической пипетки; лечить 2 мл 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с помощью пипетки и инкубировать их в течение 3 мин при 37 °C.
    2. Нейтрализовать трипсинизированные клетки 3 мл клеточной культуральной среды; собирать суспензии клеток в конические трубки по 15 мл и центрифугу при 516 х г в течение 5 мин при 20 °С.
    3. Аспирировать супернатант медленно; повторно суспендируют клеточные гранулы в 5 мл клеточной культуры и подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра.
    4. Переведите 5 x 106 клеток каждого типа клеток в новые конические трубки по 15 мл и центрифугируют их при 516 x g в течение 5 мин при 20 °C.
    5. Аспирировать супернатант и поместить его на влажный лед.
  2. Смешивание каждого типа клеток с 1% нейтрализованным раствором прегеля коллагена
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать термического затвердевания 1% нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля, этот процесс следует выполнять на влажном льду.
    1. Повторно суспендируют каждый тип клеточных гранул, собранных на этапе 5.1.4, с 20 мкл клеточной культуры каждая.
    2. Добавьте 1 мл 1% нейтрализованного раствора коллагена прегеля в каждую из повторно суспензионных клеток и перемешайте их однородно, используя пипетку с положительным смещением. Конечная концентрация каждого типа клеток составит 5 х 106 клеток/мл.
    3. Переложите инкапсулированные коллагеновые биончасти в одноразовые шприцы объемом 3 мл с помощью положительной одноразовой пипетки и храните шприцы при 4 °C до 3D-печати клеток.

6.3D клеточная печать концентрических колец рак-строма

  1. 3D-клеточная печать коллагеновых биосинов, инкапсулирующих раковые клетки и стромальные клетки
    1. Сгенерируйте 3D-геометрию концентрических колец рак-строма, определенных на шаге 1.2, с помощью программного обеспечения 3D CAD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры концентрических колец стромы рака определяются с помощью смоделированных параметров. Окончательные размеры параметров размеров показаны на рисунке 3A.
    2. Преобразуйте файл 3D CAD в формат файла STL и сгенерируйте G-код концентрических колец рак-строма с помощью обменника STL-CAD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к примечанию на шаге 4.1.2 для алгоритма генерации G-кода.
    3. Загрузите инкапсулированные в ячейки коллагеновые биоинки, содержащиеся в одноразовых шприцах по 3 мл, на головку 3D-принтера и установите температуру головки и пластины на 15 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если температура головки и пластины принтера достигает более 37 °C, биочернило становится сшитым и больше не печатается.
    4. Загрузите сгенерированный путь печати в управляющая программа 3D-принтера.
    5. Нажав на кнопку «Пуск», распечатайте коллагеновые биочернила, инкапсулирующие раковые клетки и стромальные клетки на газопроницаемом барьере после загруженного G-кода пластиковой иглой 18 г при пневматическом давлении около 20 кПа при 15 °C.
    6. В конце каждой операции печати вручную поместите стерилизованную стеклянную крышку 22 мм x 50 мм поверх газопроницаемого барьера для создания гипоксического градиента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните две группы в зависимости от наличия стеклянной крышки (GR+) и отсутствия (GR-) этой группы для проверки генерации гипоксического градиента.
    7. После генерации трех гипоксических раковых веществ на чипах перенесите чипы в инкубатор при 37 °C в течение 1 ч, чтобы сшивать коллагеновые биочернила.
  2. Завершение процесса изготовления и обслуживания гипоксического рака на чипе
    1. После завершения всех процессов 3D-клеточной печати гипоксического рака на чипе аккуратно потрите покровные стекла поверх газопроницаемых барьеров с помощью скраппера для плотного склеивания(рисунок 4A,B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покровное стекло и газопроницаемый барьер собираются с помощью гидрофобного склеивания без химических клеев, просто соскребая склееную часть между защитным стеклом и барьером PDMS.
    2. Введите 1,5 мл среды роста эндотелиальных клеток в каждый чип. Чтобы избежать отслоения раковой конструкции, вводят питательную среду клеток с одной стороны чипа. Наклоните чип, чтобы позволить среде клеточного культуры течь с помощью пипетки.
    3. Обновляйте питательные среды каждый день в течение недели. Используйте пипетку для аспирации клеточной культуры; не используйте напорный насос.

7. Оценка жизнеспособности клеток после печати

  1. Подготовка образцов и обработка кальцеином AM и раствором EthD-1
    1. Согрейте 1x PBS на водяной бане при 37 °C.
    2. Готовят пробирный раствор, добавляя 0,75 мкл кальциина ацетоксиметила (кальциин АМ) и 3 мкл гомодимера этидия (EthD-1) к 1,5 мл предварительно нагретого PBS.
    3. Осторожно аспирировать все носители из чипа с помощью пипетки.
    4. Промойте раковую конструкцию с помощью предварительного PBS. Заполните 1,5 мл PBS в чип с помощью пипетки и дайте ему постоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы избежать деформации конструкции рака, введите 1x PBS с одной стороны чипов и наклоните чипы, чтобы позволить 1x PBS течь.
    5. Аспирировать PBS из чипа; обработать раствор для анализа 1,5 мл и инкубировать чип при 37 °C в течение 20 мин, используя фольгу для защиты от света. Используйте пипетку для аспирации 1x PBS; не используйте всасывающий насос.
  2. Визуализация жизнеспособности клеток с помощью флуоресцентного микроскопа
    1. Просмотр и захват меченых клеток с помощью флуоресцентного микроскопа(рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Calcein AM отмечает живые клетки с зеленой флуоресценцией (длина волны ~ 488 нм). EthD-1 представляет собой сигнал мертвых клеток с красной флуоресценцией (длина волны ~594 нм).
    2. Подсчитайте количество живых и мертвых клеток с помощью программного обеспечения для визуализации, программы обработки изображений с открытым исходным кодом и рассчитайте жизнеспособность с цифрами.

8. Иммунофлуоресценция для подтверждения образования центральной гипоксии и ее влияния на злокачественность рака

  1. Фиксация, пермеабилизация и блокирование раковой конструкции
    1. Приготовьте 1x PBS, 4% параформальдегида (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 и 2% (мас./об.) бычий сывороточный альбумин (BSA) при комнатной температуре.
    2. Тщательно аспирировать все носители из чипа с помощью пипетки и промыть чип три раза с помощью 1x PBS. Чтобы избежать деформации конструкции рака, введите 1x PBS с одной стороны чипов и наклоните чипы, чтобы позволить 1x PBS течь. Между каждым этапом промывки дайте чипу постоять с 1x PBS в течение 5 минут, чтобы удалить остаточные растворы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x PBS был аспирирован с использованием пипетки, а не напорного насоса.
    3. Добавьте 500 мкл 4% PFA к раковой конструкции на чипе с помощью пипетки; оставьте его на 15 минут и промыть три раза 1x PBS, чтобы исправить клетки в раковой конструкции.
    4. Лечите раковую конструкцию 500 мкл 0,1% Triton X-100 с помощью пипетки при комнатной температуре в течение 5 мин и трижды промывайте 1x PBS для солюбилизации и пермеабилизации клеточной мембраны.
    5. Лечите раковую конструкцию 500 мкл 2% BSA с помощью пипетки при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы блокировать реактивные эпитопы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте чип парафиновой пленкой для предотвращения испарения.
    6. Через 1 ч промыть чип три раза с 1x PBS.
  2. Лечение первичными антителами, вторичными антителами и DAPI и визуализация структуры с использованием конфокального микроскопа.
    1. Готовят контрольные антитела изотипа и коктейль первичных антител путем разведения антител в 1x PBS к каждой желаемой рабочей концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные детали антител перечислены в Таблице материалов. Следует использовать те же рабочие концентрации контрольных антител изотипа, что и первичных антител.
    2. Осторожно аспирировать все 1x PBS из чипа с помощью пипетки и обработать чип 200 мкл раствором первичного антитела при 4 °C в течение ночи. Накройте стружку парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение.
    3. Аспирировать раствор первичного антитела и промыть чип три раза 1x PBS.
    4. Разбавляют вторичные антитела и DAPI в 1x PBS до нужной рабочей концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае используется вторичное флуоресцентно-конъюгированное вторичное антитело Green в соотношении 1:200. DAPI использовался в соотношении 1:1000.
    5. Осторожно аспирировать все 1x PBS из чипа с помощью пипетки и обработать чип 200 мкл вторичным раствором антитела-DAPI при 4 °C в течение 3 ч. Накройте чип парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение, а затем оберните его алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
    6. Аспирировать раствор вторичного антитела-DAPI и промыть чип три раза 1x PBS.
    7. После завершения этапа окрашивания перенесите раковую конструкцию в конфокальную посуду, аккуратно захватив щипцами.
    8. Визуализируйте и захватывайте меченые клетки с помощью конфокального микроскопа(рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина волны конфокального микроскопа была скорректирована в зависимости от типа флуоресцентных маркеров. Конкретные детали антител перечислены в Таблице материалов. Чтобы эффективно определить положение клетки, было бы лучше сначала наблюдать окрашенные ЯДРА КОНСТРУКЦИИ DAPI. Длины волн обнаружения возбуждения/излучения флуоресцентных сигналов составляли 358/461 нм (DAPI, синий), 494/517 нм (зеленый) и 590/617 нм (красный). Увеличение было 4x, 10x и 20x, скорректированное от самого низкого к самому высокому.

9. Статистический анализ

  1. Подсчет ячеек с помощью программы обработки изображений
    1. Запустите программу обработки изображений, чтобы подсчитать количество живых и мертвых клеток.
    2. Откройте файлы флуоресцентных изображений. Нажмите на файл | Откройте и импортируйте изображения TIFF.
    3. Преобразуйте изображения в 16-битные изображения в градациях серого. Нажмите на | изображений Тип | 16-битные оттенки серого.
    4. Отрегулируйте пороговое значение, нажав на image | Отрегулируйте | Пороговое значение, а затем выберите черный цвет ячеек.
    5. Разрежьте объединенные ячейки, нажав на | Двоичные | Водораздел для точного подсчета клеток.
    6. Подсчитайте количество ячеек, нажав на Анализ, а затем на Анализ частиц три раза; рассчитать среднее значение и представить данные как среднее ± стандартной погрешности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентные маркеры были проанализированы путем сравнения интенсивности флуоресценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Гипоксический рак на чипе был разработан с использованием автоматизированной технологии 3D-печати клеток для повторения гипоксии и патологии, связанной с раком(рисунок 1). Транспортировка и потребление кислорода моделировались с использованием 3D-геометрии. Чип был разработан в виде концентрических колец для имитации радиальной диффузии и истощения кислорода в раковых тканях(рисунок 2A). После определения контрольного объема пространства, где кислород рассеивался и потреблялся клетками, соответствующая клеточная плотность для генерации центральной гипоксии определялась с помощью вычислительного анализа конечных элементов(рисунок 2B,C).

Код пути 3D-печати для гипоксического рака на чипе был сгенерирован на основе предыдущих результатов(рисунок 3). Файлы CAD жертвенной формы PEVA и раковых конструкций были преобразованы в формат файла STL(рисунок 3A,B). Путь печати был закодирован и перенесен в систему мультипечати с помощью встроенной программной программы(рисунок 3C).

Гипоксический рак на чипе был изготовлен с использованием технологии 3D-печати клеток. Чтобы резюмировать структурную, биохимическую и биофизическую гетерогенность твердого рака, был установлен ступенчатый процесс изготовления для конструкции рака и газопроницаемого барьера, который является единственным способом, которым кислород может проникать в систему(рисунок 4A). Для воспроизведения анатомических особенностей солидного рака(рисунок 4B)была создана компартментированная концентрическая кольцевая структура рака рака . Гетерогенная геометрия раковой ткани была реализована in vitro с использованием технологии 3D-клеточной печати. Жизнеспособность клеток оценивали после печати, чтобы подтвердить химическое и механическое напряжение во время процесса изготовления. Соотношение живых клеток, окрашенных зеленым цветом, было значительно выше, чем у мертвых клеток, окрашенных красным цветом. Количественно жизнеспособность клеток после печати составила более 96,92%, ± 2,46%(Рисунок 4C). Этот результат подтверждает, что производственные условия были подходящими для раковых клеток и стромальных клеток.

Две группы сравнивали в зависимости от наличия(GR+) и отсутствия (GR-) градиента кислорода для проверки влияния гипоксического градиента на прогрессирование рака(рисунок 5A). В обоих условиях зрелые CD31+ эндотелиальные клетки существовали в периферических областях, что указывало на то, что пространственно узорчатая живая конструкция была получена с использованием технологии 3D-биопечати. По сравнению сGR-состоянием, gr+ условие показало гипоксический градиент, указывающий на постепенную экспрессию HIF1α(рисунок 5B),где наблюдались SHMT2+ псевдопализируемые клетки и SOX2+ плюрипотентные клетки, что представляло собой агрессивную патофизиологическую особенность солидного рака(рисунок 5C). А именно, патологические особенности глиобластомы были рекапитулированы при инженерном гипоксическом состоянии15.

Figure 1
Рисунок 1:Схема развития гипоксического рака на чипе. Эта цифра была изменена из Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Вычислительное моделирование образования градиента кислорода на гипоксическом раке на чипе. (A) 3D-геометрия гипоксического рака на чипе. (B)Схема с указанием области для анализа распределения кислорода. Эта цифра была изменена из Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). (C) Изображение струйной цветовой карты профиля распределения кислорода. Эта цифра была изменена из Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Генерация кода пути 3D-печати для гипоксического рака на чипе. (A) 3D-геометрия жертвенной формы PEVA. (B) Изображение жертвенной формы PEVA в формате STL. (C)G-код жертвенной формы PEVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:3D-клеточная печать гипоксического рака на чипе. (A) Схема процесса изготовления гипоксического рака на чипе. (B)Напечатанная гипоксическая структура концентрических колец рака-стромы; шкалы представляют собой 200 мкм.(C)Флуоресцентное изображение 3D-клеточной печатной конструкции рака для оценки жизнеспособности; Шкалы представляют 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Генерация гипоксического градиента и оценка патологических особенностей инженерного твердого рака. (А)Экспериментальные группы при двух различных условиях кислородопроницаемости. (B)Репрезентативные иммуноокрашивающие изображения генерации градиента кислорода с использованием HIF1α; шкала баров представляет собой 200 мкм.(C)Репрезентативные иммуноразнашивающие изображения патологических особенностей гипоксического рака с использованием SHMT2, SOX2 и CD31; шкала составляет 200 мкм. Эта цифра была изменена из Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании мы описываем процесс изготовления гипоксического рака на чипе на основе технологии 3D-печати клеток. Формирование гипоксического градиента в проектируемом чипе было предсказато с помощью компьютерного моделирования. Среда, которая может индуцировать гетерогенный гипоксический градиент, была воспроизведена с помощью простой стратегии, сочетающей 3D-печатный газопроницаемый барьер и стеклянную крышку. Связанные с гипоксией патологические особенности глиобластомы, включая псевдопалисад и небольшую популяцию раковых стволовых клеток, были рекапитулированы в гипоксических градиентных условиях чипа.

Для повышения производительности и повторяемости два основных этапа изготовления были последовательно модифицированы по сравнению с ранее опубликованной моделью15. Во-первых, барьер PDMS был создан косвенно, чтобы преодолеть плохую печатаемость PDMS, содержащего отверждающий агент, который отверждается в режиме реального времени, а не с помощью метода одношаговой прямой печати. Поэтому биосовместимый PEVA, имеющий более высокую печатаемость, был адаптирован для изготовления жертвенной формы, а PDMS был добавлен для создания газопроницаемого барьера. Во-вторых, тип слайд-стекла был изменен на слайд-стекло с гидрофильным покрытием, которое благоприятно для поддержки осаждения биочернил и точности формы. Наконец, стало возможным построение средних резервуаров на обоих концах чипа, эффективный средний обмен.

Критические факторы на каждом этапе изготовления гипоксического рака на чипе с помощью 3D-биопечати должны тщательно контролироваться. Во время литья высота PDMS должна быть больше, чем у жертвенной формы PEVA, иначе стружка, затянутая покровным стеклом, становится рыхлой, что негативно сказывается на гипоксической генерации сердечника. Во время печати коллагена, термочувствительного гидрогеля, температура печатательной головки должна поддерживаться на уровне 15 °C, чтобы предотвратить засорение сопла из-за явления перехода золь-геля. Если гидрогель становится временно сшитым, заблокированное сопло можно легко очистить с помощью высокого пневматического давления и острой иглы. Однако, если блокировка тяжелая, гидрогель следует приготовить снова. Кроме того, процесс печати клеток должен быть завершен в течение 1 ч, учитывая жизнеспособность клеток.

Технология 3D-биопечати облегчает разработку гипоксического рака на чипе, который может быть использован для изучения основного механизма рака и прогнозирования терапевтической резистентности различных солидных опухолей15. В частности, использование технологии 3D-биопечати на основе экструзии позволило быстро и повторяющееся производство с высоким уровнем свободы. Кроме того, воспроизводимость и быстрые временные рамки для моделирования рака позволяют фармацевтической области создавать набор данных кандидатов на комбинацию лекарств для лечения рака. Однако из-за ограниченного разрешения технологии печатный гипоксический рак на чипе выпускается в диапазоне нескольких сотен микрометров, требующих большого количества материалов. Кроме того, трудно разработать высокопроизводительную платформу для скрининга лекарств под космическими ограничителями20. Поэтому технология должна быть усовершенствована для разработки моделей, способных поддерживать многопараметрические исследования с ограниченными ресурсами и пространственной протяженностью.

Разработанный гипоксический рак на чипе может быть применен к тканеспецифическому моделированию рака с использованием тканеспецифических материалов, таких как гидрогель, полученный из децеллюляризированного внеклеточного матрикса (ECM). Поскольку биохимические и физиологические вариации ECM влияют на клеточные функции, может быть реализована превосходная эмуляция многочисленных типов рака с органоспецифическим раковым микросредой21. Кроме того, комбинируя с другими инженерными тканевыми конструкциями, включая инженерные кровеносные сосуды, которые оказывают критическое влияние на развитие рака, можно изучать динамические патофизиологические изменения ангиогенных, иммуногенных и метастатических свойств. Кроме того, персонализированная терапия рака может быть выполнена с помощью разработанного чипа путем использования клеток, полученных от пациента15. Тестирование чувствительности к лекарственным средствам до начала клинического лечения было бы значительным шагом для повышения эффективности терапии в процессе поиска подходящей терапевтической схемы для отдельного пациента во времени. Ожидается, что модель рака для конкретного пациента с источником, полученным от пациента, улучшит профилирование пациента для прогнозирования различий в патофизиологии и хемосенсибиливности каждого пациента. В предыдущем исследовании специфические для пациента терапевтические эффекты против различных комбинаций лекарств были предсказаны в разумные сроки (1-2 недели) с использованием 3D-печатного гипоксического рака на чипе, что приводит к относительно быстрым выводам по сравнению с другими методами, предполагая потенциал для специфической для пациента доклинической модели15.

Таким образом, 3D-клеточная печать рака на чипе благоприятна для рекапитуляции гетерогенной раковой микросреды. Имитированные микроокружения приводят к патологической прогрессии рака, включая формирование некротического ядра в результате гипоксии. Этот протокол может быть применен к тестированию противоопухолевых препаратов и моделям рака, специфичным для пациента. В связи с этим мы ожидаем, что этот высоко контролируемый подход может быть полезен для построения различных моделей рака.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не раскрывают информацию.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF), финансируемым Министерством образования (No 2020R1A6A1A03047902 и NRF-2018H1A2A1062091) и правительством Кореи (MSIT) (No. NRF-2019R1C1C1009606 и NRF-2019R1A3A3005437).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
Human umbilical vein endothelial cells Promocell C-12200
U-87 MG cells ATCC ATCC HTB-14
Disposable
0.2 μm syringe filter Sartorius 16534-K
10 mL disposable syringe Jung Rim 10ml 21G32
10 mL glass vial Hubena A0039
10 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91010
15 mL conical tube SPL lifescience 50015
18G plastic needle Musashi engineering PN-18G-B
20G plastic tapered dispense tip Musashi engineering TPND-20G-U
22x50 glass cover MARIENFIELD 0101142
25 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90125
3 mL disposable syringes HENKE-JET 4020-X00V0
40 µm cell strainer Falcon 352360
5 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91005
50 mL conical tube SPL lifescience 50050
50 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90150
50N precision nozzle Musashi engineering HN-0.5ND
Aluminum foil SINKWANG
Capillary tips Gilson CP1000
Cell-scrapper SPL lifescience 90030
Confocal dish SPL lifescience 200350
Parafilm Bemis PM996
Pre-coated histology slide MATSUNAMI MAS-11
Reservoir SPL lifescience 23050
T-75 cell culture flask SPL lifescience 70075
Equipment
3DX printer T&R Biofab
Autoclave JEIOTECH AC-12
Centrifuger Cyrozen 1580MGR
Confocal laser microscopy Olympus Life Science FV 1000
Fluorescence microscope FISHER SCEINTIFIC O221S366
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Hand tally counter KTRIO
Hemocytometer MARIENFIELD 0650030
Incubator Panasonic MCO-170AIC
Laminar flow cabinet DAECHUNG SCIENCE CB-BMMS C-001
Metal syringe IWASHITA engineering SUS BARREL 10CC
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Oven JEIOTECH OF-12, H070023
Positive displacement pipette GILSON NJ05652
Refrigerator SAMSUNG CRFD-1141
Voltex Mixer DAIHAN scientific VM-10
Water bath DAIHAN SCIENTIFIC WB-11
Water purifier WASSER LAB DI-GR
Materials
0.25 % Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
10x PBS Intron IBS-BP007a
4% Paraformaldehyde Biosesang
70% Ethanol Daejung 4018-4410
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Anti-HIF-1 alpha antibody Abcam ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antibody Abcam ab88664
Anti-SOX2 antibody Abcam ab75485
Bovine Serum Albumin Thermo scientific J10857-22
Collagen from porcine skin Dalim tissen PC-001-1g
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermofisher D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2 Promocell C22011
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Theromofisher A-11001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Theromofisher A-11012
High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) Hyclone SH30243-0
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 311413-100ML
Live/dead assay kit Invitrogen L3224
Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control Abcam ab170190
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Poly(ethylene-vinyl acetate)  Poly science 06108-500
Polydimethylsiloxane Dowhitech sylgard 184
Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control Abcam ab37415
Sodium hydroxide solution Samchun S0610
Triton X-100 Biosesang TRI020-500-50
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a COMSOL AB
IMS beamer in-house software
SolidWorks Package Dassault Systems SolidWorks Corporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
  2. Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
  3. Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
  4. Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
  5. Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
  6. Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  7. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
  8. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  9. Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  10. Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
  11. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  13. Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
  14. Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengineering. 4 (1), 10 (2017).
  15. Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
  16. Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
  17. Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
  18. Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
  19. Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
  20. Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
  21. Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).

Tags

Биоинженерия Выпуск 167 3D-печать клеток 3D микрофизиологическая система орган-на-чипе твердый рак микроокружение гипоксия градиент кислорода патология
3D-клеточная печать гипоксического рака на чипе для рекапитуляции патологической прогрессии солидного рака
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang,… More

Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang, J., Cho, D. W., Yi, H. G. 3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer. J. Vis. Exp. (167), e61945, doi:10.3791/61945 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter