Summary
Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.
Abstract
Mezenkimal kök hücrelerin (MSC' ler) hücre yenilenmesi ve tedavisi üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntem koklear epitel ile birlikte kültürden sonra MSC göç ve morfolojik değişiklikleri izler. Corti'nin organı, reissner'ın diseksiyon sırasında üretilen zarının bir kısmına basılarak plastik bir kapak kapağı üzerinde hareketsiz hale getirildi. Cam silindirle sınırlı olan MSC'ler, silindir çıkarıldığında koklear epitellere doğru göç etti. Baskın lokalizasyonları, Corti organının modiolusunda, sinir liflerine benzer bir yönde hizalanmış olarak gözlendi. Bununla birlikte, bazı MSC'ler limbus bölgesinde lokalize edildi ve yatay olarak uzatılmış bir şekil gösterdi. Ayrıca saç hücresi bölgesine göç arttırıldı ve kanamycin tedavisinden sonra MSC'lerin morfolojisi çeşitli formlara dönüştü. Sonuç olarak, bu çalışmanın sonuçları, KOKLEAR epitel ile MSC'lerin kokültürünün hücre nakli yoluyla terapötiklerin gelişimi ve çeşitli durumları ve faktörleri inceleyebilen hücre yenilenmesi çalışmaları için yararlı olacağını göstermektedir.
Introduction
İşitme kaybı doğuştan ortaya çıkabilir veya yaşlanma, ilaçlar ve gürültü de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden giderek kaynaklanabilir. İşitme kaybı genellikle tedavi etmek zordur, çünkü işitmeden sorumlu saç hücreleri hasar gördükten sonra bozulmuş işlevi geri yüklemek çok zordur1. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, dünya nüfusunun %6,1'ini oluşturan dünya genelinde 461 milyon kişinin işitme kaybı olduğu tahmin edilmektedir. İşitme kaybı olanların %93'ü yetişkin, %7'si çocuk.
İşitme kaybını tedavi etmek için bir dizi yaklaşım denenmiştir; özellikle MSC'leri kullanan bir rejenerasyon yaklaşımı umut verici bir tedavi olarak ortaya çıkmıştır. Doku hasar gördüğünde, MSC'ler doğal olarak dolaşım sistemine salınır ve rejenerasyon2'yidestekleyen bir mikroçevre oluşturmak için çeşitli moleküller salgıladıkları yaralanma bölgesine göç eder. Bu nedenle, hasarlı hücre fonksiyonu 3,4,5'inrestorasyonunu geliştirmek için organları hedeflemek için dışarıdan implante edilmiş MSC'lerin göçü ve daha sonra güçlü bağışıklıkdüzenlemesine, anjiogenez ve anti-apoptoza neden olan moleküllerin salgılanması yoluyla hasarlı dokuları tedavi etmek için bir yöntem geliştirmek önemlidir.
MSC'lerin hasarlı dokulara göç ettiği takip süreci aşılması gereken en önemli engel olabilir. MSC'ler, bağlama/yuvarlama, aktivasyon, tutuklama, transmidigrasyon/diapedez ve geçiş 6,7,8sıralı adımlarına sahip sistemik bir homingmekanizmasınasahiptir. Şu anda, bu adımları iyileştirmenin yollarını belirleme çabaları devam ediyor. Genetik modifikasyon, hücre yüzey mühendisliği, in vitro astarlama ve manyetik rehberlik gibi çeşitli stratejiler test edilmiştir6,7. Buna ek olarak, MSC'leri hasarlı koklea bölgesine yerle bir ederek işitsel saç hücrelerinin korunmasını ve yenilenmesini teşvik etmek için çeşitli girişimlerde bulunulmuştır. Bununla birlikte, VIVO'daki MSC'leri izlemek zaman alıcı ve emek yoğundur ve son derece özel beceriler gerektirir9.
Bu sorunu çözmek için, hücrelerin birkaç saat boyunca geçişini fotoğraflayan zaman atlamalı konfokal mikroskopi yoluyla kokleadaki MSC'lerin homingini gözlemlemek için bir yöntem geliştirilmiştir (Şekil 1). 20. yüzyılın başlarında geliştirilmiştir ve son zamanlarda belirli hücrelerin göçlerini incelemek için güçlü bir araçhaline gelmiştir.
Şekil 1: Grafiksel özet. (A) Corti'nin parçalanmış organı, uzunlayıp kullanılarak plastik bir kapakçık üzerine yapıştıktan sonra, kapak kapağı 35 mm cam tabanlı konfokal mikroskobik bir kabın üzerine yerleştirilir ve (B) cam silindir yerleştirilir. (C) Cam silindirin içini orta ile doldurduktan sonra, (D) orta ile GFP etiketli MSC'ler silindirin dışına dikkatlice eklenir. (E) Bir gecede inkübasyondan sonra, (F) cam silindir çıkarılır ve konfokal mikroskopla görüntüler alınır. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; MSC'ler = mezenkimal kök hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ICR farelerini içeren tüm araştırma protokolleri Wonju Tıp Fakültesi'ndeki Yonsei Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları'na göre gerçekleştirildi. Bu protokolde, hamile ICR fareleri yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık bir döngüde tutuldu.
1. Koklea diseksiyonu
- Ultraviyole ışığını ~30 dakika açarak laminer akış dokusu kültür davlumbazını sterilize edin ve kullanmadan önce tüm yüzeyleri% 70 etanol ile püskürtün. Yüzeylerin kurumasını bekleyin.
- Diseksiyon aletlerini 10 dakika boyunca% 70 etanol içine yerleştirin ve kullanmadan önce kurutun.
- Doğum sonrası 3-4 günlük farelerin kafasını kesmek için bir çalışma bıçağı kullanın (Şekil 2A).
- Kafatasını laminer akış başlığına bir stereomikroskopun altına yerleştirin ve dokuyu% 70 etanol içine batırın.
- Etanol çıkarmak için dokuyu doku diseksiyon çözeltisine (1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1 mM HEPES) hızlı bir şekilde batırın.
- Kafatasının orta çizgisini cerrahi bir bıçakla kesin (Şekil 2B,C).
- Cildi ön olarak aşağı çekerek ve kulağın dış işitsel kanalını keserek kafatasını ortaya çıkarın (Şekil 2D).
- Ön kısımdan kafatasının arka kısmına göz çizgisi boyunca kesin (Şekil 2E).
- Kafatasını açın ve künt forps ile beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın (Şekil 2F,G).
- Mikro kümes uçlarını kullanarak kokleayı temporal kemikten ayırın (Şekil 2H).
- Kokleayı doku diseksiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
- Koklear otik kapsülün tümünü dikkatlice parçalara ayırın, sadece iç koklear yumuşak doku bırakın(Şekil 2I,J).
- Kokleanın modiolularını başka bir çift asa ile kümes ve koklear kanal ile tutun ve iki dokuyu yavaşça ayırın (Şekil 2K).
- Stria vascularis ve tectorial membranları nazikçe soyup çıkararak çıkarın (Şekil 2L,M).
- Sterilize edilmiş bir plastik kapak kapağını yeni doku diseksiyon çözeltisine yerleştirin ve ardından Basilar zarının aşağı doğru yüzleştiğinden emin olarak Corti organını 9 mm çapında bir kapak kapağına yerleştirin (Şekil 2N-P).
- Reissner'ın zarını ve kalan modiolus dokusunups ile kapak kılıfına bastırarak dokuyu hareketsiz hale verin (Şekil 2N-P).
- Gömülü doku ile kapak sapını 35 mm çapındaki bir konfokal kabın ortasına aktarın.
- Cam klonlama silindirini, koklear eksplant ile çanağın ortasına yerleştirin ve silindirin içine 100 μL eksizyon kültürü ortamı (DMEM / F12,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 N2 takviyesi, ampisilin (10 μg / mL))10 ekleyin (Şekil 2Q).
- Plaka 5 ×10 3 hücre fare kemiği iliği türevi yeşil floresan protein (GFP)-etiketli MSC'ler 2 mL kültür ortamında (%45 DMEM + %45 DMEM/F12, %10 FBS, %1 N2 takviyesi, 10 μg/mL ampisilin) cam silindirin dışında (Şekil 2R).
- MSC'ler % 80-90 birleştiğinde, tripin-etilenediamin tetraasetik asit ile ayırarak bunları geçiştirin.
- Konfokal kabı dikkatlice nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın ve % 5 CO2 atmosferinde 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Silindirin içindeki ve dışındaki tüm ortamı aspire edin ve ardından cam silindiri konfokal tabaktan çıkarın.
- Konfokal yemeğe 2 mL taze kültür ortamı ekleyin ve doku kültürü çanağini analize hazır olana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
Şekil 2. Bir fare kokleasının diseksiyonu ve Corti ve MSC organlarının kokültürü. (A) Farenin kafasının kesilmesi, (B) ve (C) başın orta çizgi sagittal diseksiyonu, (D) ve (E) beynin koronal diseksiyonu, (F) ve (G) beyin ve temporal kemiğin çıkarılması, (H) koklea, (I) kemik koklear duvarının çıkarılması, (J) koklear kanalın modiolustan ayrılması, (L) stria vascularis (SV) ve spiral ligamentin (SL) Corti'nin organından ayrılması, (M) tectorial membranının çıkarılması, (N-P) kokleanın plastik bir kapak kaymasına sabitlenmesi, (Q) konfokal çanaktaki kapak ve cam silindirin yeri, (R) MSC'lerin aşılanması. Beyaz ölçek çubuğu (A-E) = 1 cm; turuncu (F, G, P) ve sarı ölçek çubuğu (H,I) = 1 mm; yeşil ölçek çubuğu (J-O) = 0,5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Zaman atlamalı görüntüleme
- Burada sunulan deneyler için, sahne üstü inkübatör sistemine sahip bir konfokal mikroskopi sistemi kullanın.
- Konfokal mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın.
- Konfokal mikroskop sahnesine yerleştirilen sahne üstü inkübatörün koşullarını 37 °C ve %5 CO2 atmosfere ayarlayın.
- Numune kabını bulaşık sabitleme kabına yerleştirin, bulaşık sabitleme kapağıyla örtün ve odayı üst ısıtıcı kapağıyla kapatın.
- Corti ve MSC'lerin organını görüş alanında yerelleştirmek için yakınlaştırmayı ve odağı ayarlayın.
- Görüntü işleme yazılımını açın. Bul seçeneğinin altında, 20x Plan-Apochromat hedefi (sayısal diyafram 0,8) ve 0,5x kırpma alanıseçin.
- Edinmealtında, akıllı kuruluma tıklayın ve EGFP'yi seçin.
- Satın Almaaltındaki kanal sekmesini açın ve lazer gücünü% 0.2, iğne deliğini 44 μm, ana kazancı 750 Vve dijital kazancı 1.0olarak ayarlayın.
- Görüntüleme kurulumualtında ESID'ye tıklayın ve ESID kazancını 4'e ve dijital kazancı 7,5olarak ayarlayın.
- 210 fayans üretmek için Fayans ve kazık tıklayın.
- Odak stratejisini açın ve odak modunuseçin.
- Zaman serisialtında, süreyi 24 saat ve aralığı 10 dk olarak ayarlayın.
- Edinmealtında, çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel, tarama hızını 8, yönü çift yönlü, ortalamayı 4xve piksel başına bitleri 16olarak ayarlayın.
- Denemeye başlamak için denemeyi başlat'a tıklayın.
3. Görüntü dosyası değişikliği
- İşlemealtında, dikişetıklayın ve minimum kaplamayı% 5'e ve maksimum kaymayı% 10'aayarlayın.
- Film dışa aktarma, sıkıştırılmamışolarak ayarlayın ve hızı 7,5olarak ayarlayın.
4. İmmünasyon
- Ortamı dikkatlice emiş edin ve numuneyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Örneği PBS'de %4 formalin ile 15 dakika sabitlayın ve numuneyi PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
- Numuneyi PBS'de %0,1 Triton X-100'de 10 dakika permeabilize edin ve 5 dakika pbs ile 3 kez yıkayın.
- 250 μL phalloidin-iFluor 647 reaktifi (PBS'de 1:1000 seyreltme) ekleyin ve numuneyi çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Numuneyi PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- Kapak kapağını cam slayda aktarın ve 2 damla montaj çözeltisi ekleyin.
- Slayda hafifçe bir kapak kılıfı yerleştirin.
- Kapak kapağını berrak oje ile kapatın ve hücreler gözlemlenene kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
- Slaydı, phalloidin için 650/665 nm ve EGFP için Ex/Em=488/507 nm'de uygun bir filtreye sahip bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MSC'lerin üç boyutlu modda in vitro geçişi, iki boyutlu (2D) mod11'degeçişi gözlemlemek için bir Transwell sistemi veya geleneksel yara iyileştirme yöntemi ile değerlendirilmiştir. Corti'nin organı Boettcher hücreleri, Claudius hücreleri, Deiters hücreleri, sütun hücreleri, Hensen hücreleri, dış saç hücreleri, iç saç hücreleri, sinir lifleri, basilar membran ve retiküler lamina12gibi çeşitli hücrelerden oluşan karmaşık bir yapıdır. MSC'ler bu tür karmaşık hücrelerden oluşan dokuya nakledildiğinde, hücrelerin nerede işe alınıp stabilize edildiğini belirlemek için teknoloji kullanımı, MSC'ler kullanılarak hücre tedavisi ve yenilenme mekanizmasını anlamak için çok önemlidir. Ek olarak, MSC'lerin hasarın varlığında veya yokluğunda nasıl lokalize olduğunu belirlemek için, yara iyileştirme yöntemi gibi bir 2D yöntem, hücrelerin bir yönde rastgele aşağı doğru hareket ettiği bir Transwell sisteminden daha uygundur.
Bu çalışmada, MSC'lerin iki boyutlu yolu, MSC'ler ile Corti'nin organı arasında bariyer olarak bir cam silindir kullanılarak ve MSC'ler takıldıktan sonra silindiri çıkararak yara iyileştirme yönteminde izlendi. Corti'nin organı kültürlendiğinde, fibroblastlar en dış katmanda bulunan dış saç hücrelerinden çok hızlı bir şekilde dışa doğru büyüdü (Şekil 3, Video 1). Bu nedenle, GFP etiketli MSC'lerin çoğu hızlı büyüyen fibroblastlar tarafından itilmiş gibi görünüyordu (Video 1). Bununla birlikte, bazı GFP etiketli MSC'ler fibroblast tabakasına nüfuz etti ve Corti organına başarıyla göç etti (Şekil 3, Video 1).
Şekil 3. Corti ve GFP etiketli MSC'lerin organının konfokal görüntüsü. Cam silindirin çıkarılmasından ve ek 4 saat inkübasyondan sonra fiksasyon ve boyama yapıldı. Ölçek çubuğu =100 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; MSC'ler: mezenkimal kök hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Corti ve GFP etiketli MSC'lerin organının zaman atlamalı konfokal mikroskopisi. Cam silindirin çıkarılmasından ve ek 4 saat inkübasyondan sonra fiksasyon ve boyama yapıldı. Ölçek çubuğu =100 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; MSC'ler: mezenkimal kök hücreler. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
72 saat inkübasyondan elde edilen sonuçlar, MSC'lerin Corti'nin organına göç ettiğini ve esas olarak modiolusta ve modiolulardan ayrılan koklear sinir liflerinin toplandığı bölgede lokalize olduğunu gösterdi; MSC'lerin morfolojisi sinir liflerininkine benzer radyal bir şekle değiştirildi (Şekil 4B). İlginç bir şekilde, hücreler saç hücresi bölgesi yerine limbus çizgisi boyunca doğrusal bir şekle dönüştürülmüştür(Şekil 4E, oka bakın). Corti organının apikal ve bazal uçları, MSC'lerin basilar zarın medial tarafına taşınmasını önlemek için birleştirilmiş olsa da, MSC'ler çeşitli hücre katmanlarına ve fiziksel bariyerlere nüfuz ederek sinir lifi toplama alanında göç edebildi ve büyüyebildi (Şekil 4E). 16 saat boyunca 1 mM kanamycin ile tedavi ile saç hücrelerinde hasar indüklendiğinde ve kanamycin çıkarıldıktan sonra hücreler 72 saat daha kültürlendiğinde, MSC'ler sadece modiolus'ta değil, dış saç hücrelerinde de lokalize edildi (Şekil 4C,D).
Şekil 4. Corti ve GFP etiketli MSC'lerin organının konfokal görüntüleri. (A) Cam silindirin çıkarılması ve 16 saat ek kuluçkadan sonra fiksasyon ve lekelenme sonrası görüntü alınmıştır. Ölçek çubuğu =200 μm. (B) MSC'ler ağırlıklı olarak modiolus bölgesinde, ölçek çubuğu =20 μm'de dağıtıldı. Cam silindirin tabaktan çıkarılmasından sonra, hücreler 16 saat boyunca 1.0 mM kanamycin ile daha da inkübe edildi, 72 saat boyunca kanamycin içermeyen ortamla kültürlendi ve daha sonra sabitlendi ve lekelendi. Görüntüler (C) dış saç hücresi bölgesi, ölçek çubuğu = 20 μm; (D) modiolus bölgesi, ölçek çubuğu= 50 μm; ve (E) tüm koklea, ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu sonuçlar, bu çalışmada gösterilen deneysel sistemin MSC'leri kullanarak hücre terapötik stratejileri geliştirmek için yararlı bir test aracı olacağını ve özellikle çeşitli faktörlerin neden olduğu işitme kaybını incelemek için uygulanabileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hasarlı hücrelerin yenilenmesini teşvik etmek için MSC'lerin hasarlı bölgelere nakli kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve terapötik etki açıktır. MSC'lerin transplantasyonu ve daha sonra farklılaşması, 3-nitropropionik asit13tarafından indüklenen işitme kaybı olan sıçanlarda işitmeyi geri getirdiği bildirilmiştir. Lee ve arkadaşları insanlara trans-venöz olarak MSC'ler uygulamış olsalar da, işitmede önemli bir iyileşme sağlayamadılar14. Yakın zamana kadar MSC transplantasyonu ile kemirgen modelinde işitmeyi geri kazandırmak için 12'ye yakın deney yapıldı. Heterojenlik nedeniyle sonuç biraz belirsiz olsa da, MSC'lerin işitmeyi teşvik edebileceğine dair bazı göstergeler vardır.
Kemoattraction ile ilgili çeşitli büyüme faktörleri ve kemokinler, heterojenlik veya homojenlikten bağımsız olarak, nakledilen kök hücrelerin hasarlı bölgelere göçünde rol oynar15. Kemokinler doku homeostazı, immün yanıtlar ve yara iyileşmesi için hücre göçünün önemli düzenleyicileridir. In vivo ve in vitro deneysel koşullar arasındaki farklar nedeniyle kemokin kaynaklı kemoattraction in vivo ile in vitro olduğu gibi çalışmayabilir. İn vitro deneysel koşulların kendi sınırlamaları olmasına rağmen, hücrelerin verimli göçünü, işe alımını ve yenilenmesini teşvik etmek için in vivo çalışmalar yapmak çok zordur16.
İşitme restorasyonu için nakledilen MSC'lerin takibi rejeneratif tıp araştırmalarında önemli olsa da, özellikle işitmeyi içeren in vivo deneyler çoğu durumda emek yoğundur ve bu nedenle büyük örnek boyutlarıyla yapılması son derece zordur. Bu nedenle, sonuçların homojenliği düşüktür ve önyargı şiddetlidir. Bu nedenle, bu tür göçe dayalı olayları ilk olarak in vitro koşullar altında incelemek verimli olacaktır. Hücre göçü ile ilgili in vitro çalışmaların çoğu Transwell veya yara iyileştirme yöntemleri kullanılarak gerçeklenmiştir.
Yaralanma bölgelerini tanıyan ve onlara doğru hareket eden göç eden kök hücreleri izlemek için MSC'lerle kokleae çıkarmanın bir coincubation yöntemi kuruldu. Çoğu çalışma, eksplantasyondan sonra β-mercaptoethanol ile kaplanmış cam kapaklara bir Corti organı takma yöntemi kullanmıştır. Burada da aynı yöntem kullanılsa da dokuları incelemek zordu çünkü genellikle kapak kılıfından kopmuş veya yuvarlanmışlardı. Bu nedenle, dokunun izlenmesini kolaylaştırmak için yeni bir deneme yapıldı. İlk olarak, plastik bir kapak kılıfının üzerine corti'nin bir organı yerleştirildi ve daha sonra doku, Reissner'ın diseksiyon sırasında üretilen zarının kalan kısmınaps kullanılarak basılarak kapak kapağına hareketsiz hale bırakıldı.
Bu, Corti organının kapak kılıflarına kararlı bir şekilde bağlanmasını sağladı, böylece bir görüntü konfokal mikroskopi ile başarıyla elde edilebilirdi. Burada sunulan doku kültürü yöntemi ucuz ve zaman kazandıran bir yöntem olsa da diseksiyonda yeterlik gelişiminin gelişmesi biraz zaman alır. Bilinen doku kültürü yöntemleri arasında kapak kapağının poli-L-ornitin ve laminin16ile kaplanması ile dokunun bağlanması; yapışkan veya kaplama malzemeleri gerektirmeyen organotipik hücre kültürü kesici uçlarının uygulanması17 böylece yapışkan madde ihtiyacını ortadan kaldırır, bu da eksplant hasarını azaltır; ve deniz midyelerinden çıkarılan proteinlerden oluşan bir doku yapıştırıcısı kullanarak10. Bu protokol ne kaplama malzemeleri, ne organotipik membranlar ne de doku yapıştırıcıları gerektirir; ucuz bir plastik kapak kisli yeterlidir. Corti organının doku kalınlığının Z yığını ile birlikte 8 mm x 8 mm'lik bir alan düşünülürse daha iyi görüntüler elde edilebilir. Depolanacak büyük miktarda veri ve zaman atlamalı için uygun zaman göz önüne alındığında, Corti'nin organı yerine MSC'lere odaklanan tüm hücre hareketinin görüntüleri elde edildi.
Şekil 4'te gösterilen sonuçlar, çekilen görüntüler 2 mm uzunluğunda olduğunda hem Corti'nin hem de MSC'lerin organının net video görüntüleri olarak görselleştirilebileceğini ve Z yığınının bir zaman atlamalı ile birleştirilebileceğini gösteriyor gibi görünüyor. Burada, MSC'ler ve explant ile bir ortak kültür deneyi yapılmasına rağmen, bu ayar gelecekteki çalışmalar için farklı hücre türlerine veya koşullarına uygulanabilir. Örneğin, kokleanın hasarını koruyan ilaçların veya ekzozomların etkilerini incelemek için bu protokolün uygulanmasına yardımcı olacaktır. Embriyonik kök hücreler (ESC'ler) veya indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) fonksiyonel ve morfolojik olarak mekanosensitive saç hücresi benzeri hücrelere yenilenebilir18. Bu nedenle, bu protokol iPSC'lerin veya ESC'lerin işitsel saç hücrelerine veya destek hücrelerine farklılaştırılmasını incelemek için uygulanabilir. Bu ex vivo yöntemi işitmeyi geri yüklemek için rejeneratif tıbba yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) ve Hallym Üniversitesi Araştırma Fonu'ndan (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
- Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
- Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
- Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
- Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
