Her beskriver vi et bioassay ved hjælp af 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT) for at teste tidligere syntetiserede spirocykliske oximer.
Spirocykliske heterocykler er for nylig blevet rapporteret i litteraturen for at være potentielle lægemidler til kræftbehandling. Syntesen af disse nye ortogonale ringsystemer er udfordrende. En effektiv metode til syntetisering af disse forbindelser blev for nylig offentliggjort, der beskrev fastfasesyntesen i fire trin snarere end de tidligere rapporterede fem trin. Fordelen ved denne kortere syntese er eliminering af brugen af giftige reagenser. Regenererende Michael (REM) linkerbaseret harpiks med lav belastning viste sig at være afgørende i syntesen, da versioner med høj belastning forhindrede tilsætning af reagenser indeholdende omfangsrige phenyl- og aromatiske sidekæder. Det kolorimetriske 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay blev anvendt til at undersøge cytotoksiciteten af mikromolære koncentrationer af disse nye spirocykliske molekyler in vitro. MTT er let tilgængelig kommercielt og producerer relativt hurtige, pålidelige resultater, hvilket gør dette assay ideelt til disse spirocykliske heterocykler. Ortogonale ringstrukturer samt furfurylamin (en forløber i syntesemetoden indeholdende et lignende 5-mands ringmotiv) blev testet.
Småmolekylehæmning af interaktionen mellem E3 ubiquitin-ligase mus dobbelt minut 2 homolog (MDM2) med p53 er kendt for at genoprette p53-medieret induktion af tumorcelleapoptose 1,2,3. MDM2 er en negativ regulator af p53-vejen og er ofte overudtrykt i kræftceller 4,5,6,7,8,9. Nylige krystallografiske og biokemiske undersøgelser har afsløret, at små molekyler indeholdende en spirocyklisk ramme effektivt kan hæmme MDM2-p53-interaktioner10. Den spirocykliske ramme (figur 1, skraveret i blåt) betragtes som et privilegeret motiv, da derivatisering af dette stive ortogonale ringsystem har ført til opdagelsen af nye terapeutiske lægemidler. Adgang til denne interessante arkitektur udgør en udfordring, når man bruger traditionelle organiske synteseteknikker. Selvom de terapeutiske virkninger af spirocykliske molekyler i biologiske systemer er blevet undersøgt, er syntese af disse molekyler stadig en besværlig proces. Uønskede sideprodukter, brug af barske forhold og farlige overgangsmetaller er ofte problematiske.
Den potentielle anvendelse af det spirocykliske motiv i lægemiddeludvikling førte til udviklingen af en protokol, der anvendte fastfasesyntese til at generere et bibliotek af molekyler med motivet ud over andre udskiftelige funktionelle grupper11,12. Adskillelsen af produkter og reaktanter mellem trin kunne opnås ved blot at anvende en REM-linker fastgjort til en harpiksperle og en fastfasefilterbeholder. Dette ville reducere trin og potentielt øge udbyttet. Denne syntetiske tilgang kan producere en lang række potentielle lægemiddelkandidater. Imidlertid ville effektiviteten af disse molekyler i et biologisk system kræve yderligere undersøgelse.
For at bestemme cytotoksiciteten af disse spirocykliske forbindelser blev MTT-assayet13,14 anvendt. Denne metode måler cellelevedygtighed og kan bruges til indirekte at bestemme cellecytotoksicitet. Forskellige koncentrationer af hæmmerne blev tilsat til dyrkede celler i en 96-brøndsplade, og andelen af levende celler blev målt ved kolorimetrisk analyse af omfanget af reduktion af gul MTT ved mitokondrie dehydrogenaser til den lilla formazanforbindelse (figur 2). Aktiviteten rapporteres oftest som en IC 50-værdi – den koncentration, hvor cellevækst hæmmes med50% i forhold til en ubehandlet kontrol. Dette papir beskriver protokollen for MTT-analysen og de foreløbige resultater af disse nye spirocykliske molekyler.
Syntesen af de spirocykliske forbindelser var baseret på tidligere forskning udført af dette laboratorium, men med nogle ændringer (figur 1)11,12. Forløbet af hvert reaktionstrin blev overvåget ved IR-spektroskopi. Michael tilføjelse af REM-linker 1 med furfurylamin gav polymerbundet 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Fra den foregående rappo…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra fakultetets forskningsråd til KSH (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. og J.F.M. er modtagere af Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. og B.M.R. er modtagere af STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Vi er taknemmelige for Dr. Matthew Berezuk og Dr. Philip Cox for vejledning om bioassays.
CELLS | |||
COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
CHEMICALS | |||
1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas |
GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |