Summary

Funktionaliseret spirosyklisk heterocyklussyntese og cytotoksicitetsanalyse

Published: February 09, 2021
doi:

Summary

Her beskriver vi et bioassay ved hjælp af 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT) for at teste tidligere syntetiserede spirocykliske oximer.

Abstract

Spirocykliske heterocykler er for nylig blevet rapporteret i litteraturen for at være potentielle lægemidler til kræftbehandling. Syntesen af disse nye ortogonale ringsystemer er udfordrende. En effektiv metode til syntetisering af disse forbindelser blev for nylig offentliggjort, der beskrev fastfasesyntesen i fire trin snarere end de tidligere rapporterede fem trin. Fordelen ved denne kortere syntese er eliminering af brugen af giftige reagenser. Regenererende Michael (REM) linkerbaseret harpiks med lav belastning viste sig at være afgørende i syntesen, da versioner med høj belastning forhindrede tilsætning af reagenser indeholdende omfangsrige phenyl- og aromatiske sidekæder. Det kolorimetriske 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay blev anvendt til at undersøge cytotoksiciteten af mikromolære koncentrationer af disse nye spirocykliske molekyler in vitro. MTT er let tilgængelig kommercielt og producerer relativt hurtige, pålidelige resultater, hvilket gør dette assay ideelt til disse spirocykliske heterocykler. Ortogonale ringstrukturer samt furfurylamin (en forløber i syntesemetoden indeholdende et lignende 5-mands ringmotiv) blev testet.

Introduction

Småmolekylehæmning af interaktionen mellem E3 ubiquitin-ligase mus dobbelt minut 2 homolog (MDM2) med p53 er kendt for at genoprette p53-medieret induktion af tumorcelleapoptose 1,2,3. MDM2 er en negativ regulator af p53-vejen og er ofte overudtrykt i kræftceller 4,5,6,7,8,9. Nylige krystallografiske og biokemiske undersøgelser har afsløret, at små molekyler indeholdende en spirocyklisk ramme effektivt kan hæmme MDM2-p53-interaktioner10. Den spirocykliske ramme (figur 1, skraveret i blåt) betragtes som et privilegeret motiv, da derivatisering af dette stive ortogonale ringsystem har ført til opdagelsen af nye terapeutiske lægemidler. Adgang til denne interessante arkitektur udgør en udfordring, når man bruger traditionelle organiske synteseteknikker. Selvom de terapeutiske virkninger af spirocykliske molekyler i biologiske systemer er blevet undersøgt, er syntese af disse molekyler stadig en besværlig proces. Uønskede sideprodukter, brug af barske forhold og farlige overgangsmetaller er ofte problematiske.

Den potentielle anvendelse af det spirocykliske motiv i lægemiddeludvikling førte til udviklingen af en protokol, der anvendte fastfasesyntese til at generere et bibliotek af molekyler med motivet ud over andre udskiftelige funktionelle grupper11,12. Adskillelsen af produkter og reaktanter mellem trin kunne opnås ved blot at anvende en REM-linker fastgjort til en harpiksperle og en fastfasefilterbeholder. Dette ville reducere trin og potentielt øge udbyttet. Denne syntetiske tilgang kan producere en lang række potentielle lægemiddelkandidater. Imidlertid ville effektiviteten af disse molekyler i et biologisk system kræve yderligere undersøgelse.

For at bestemme cytotoksiciteten af disse spirocykliske forbindelser blev MTT-assayet13,14 anvendt. Denne metode måler cellelevedygtighed og kan bruges til indirekte at bestemme cellecytotoksicitet. Forskellige koncentrationer af hæmmerne blev tilsat til dyrkede celler i en 96-brøndsplade, og andelen af levende celler blev målt ved kolorimetrisk analyse af omfanget af reduktion af gul MTT ved mitokondrie dehydrogenaser til den lilla formazanforbindelse (figur 2). Aktiviteten rapporteres oftest som en IC 50-værdi – den koncentration, hvor cellevækst hæmmes med50% i forhold til en ubehandlet kontrol. Dette papir beskriver protokollen for MTT-analysen og de foreløbige resultater af disse nye spirocykliske molekyler.

Protocol

BEMÆRK: Flere kemikalier og biologiske reagenser, der anvendes i denne protokol, er giftige og kræftfremkaldende. Se relevante sikkerhedsdatablade (MSDS) inden brug. Brug passende personlige beskyttelsesudstyr (sikkerheds- og sundhedsadministrationsgodkendte sikkerhedsbriller, korrekte handsker, laboratoriefrakker, bukser i fuld længde og sko med lukket tå), inden eksperimentet startes. Derudover skal du vedtage passende sikkerhedspraksis ved udførelse af syntese og håndtering af giftige kemikalier og reagenser (r?…

Representative Results

Spirocykliske oximer 6 og 7 blev syntetiseret ved hjælp af en modificeret protokol (figur 1). Michael tilsætning af furfurylamin til en REM-linker 1b gav polymerbundet harpiks 2. Reaktionens forløb blev overvåget ved infrarød (IR) spektroskopi ved at detektere forsvinden af den α,β-umættede ester ved 1722 cm-1 (figur 3). Spirocyklisk bundet harpiks 4 blev dannet fra 2 via et forbigående mellemprodukt 3. Methanolhydrolyse af 4 producerede 3-[(…

Discussion

Syntesen af de spirocykliske forbindelser var baseret på tidligere forskning udført af dette laboratorium, men med nogle ændringer (figur 1)11,12. Forløbet af hvert reaktionstrin blev overvåget ved IR-spektroskopi. Michael tilføjelse af REM-linker 1 med furfurylamin gav polymerbundet 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Fra den foregående rappo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra fakultetets forskningsråd til KSH (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. og J.F.M. er modtagere af Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. og B.M.R. er modtagere af STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Vi er taknemmelige for Dr. Matthew Berezuk og Dr. Philip Cox for vejledning om bioassays.

Materials

CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651) ATCC CRL-1651 African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane Sigma-Aldrich 152951 Alkyl-halide
Allylbromide Sigma-Aldrich 337528 Alkyl-halide
Benzylbromide Sigma-Aldrich B17905 Alkyl-halide
Cisplatin Cayman Chemical 13119 Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997 Solvent
Dimethylformamide (DMF) Sigma-Aldrich 227056 Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855 Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine Genesee Scientific 25-500 Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum) Sigma-Aldrich F4135 Cell culture media
Furfurylamine Acros Organics 119800050 reagent 
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566 Alkyl-halide
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) EMD Millipore Calbiochem 475989-1GM Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) Genesee Scientific 25-507 Cell culture media
REM Resin Nova Biochem 8551010005 Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene Sigma-Aldrich N26806 Nitro-olefin reagent
Toluene Sigma-Aldrich 244511 Solvent
Triethylamine (TEA) Sigma-Aldrich T0886 Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl) Sigma-Aldrich 386529 Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel Chemglass CG-1861-02 Glassware with filter
96 Well plate reader Promega (Turner Biosystems) 9310-011 Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer Bruker N/A Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5 Thermo Scientific IQLAADGAAGFAHDMAZA Instrument
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific 757950819 Instrument

References

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
  2. Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
  3. Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
  4. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
  5. Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
  6. Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
  7. Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
  8. Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  9. Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
  10. Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
  11. Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).
  13. Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
  14. . MTT assay protocol Available from: https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol (2020)

Play Video

Cite This Article
Gray, A. N., Ramirez, B. M., Mawugbe, S. K., Mar, J. F., Wong, Y. C., Huang, K. S. Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay. J. Vis. Exp. (168), e61950, doi:10.3791/61950 (2021).

View Video