우리는 청색 꼬리 댐을 사용하여 주문 오도나타 (잠자리와 담석)의 곤충에 전기 포기 매개 RNA 간섭에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(이쉬누라 세네갈렌시스: 코나그리니대 : 지고피테라) 및 파이드 스키머 드래곤 플라이(Pseudothems zonata: Libelluldaei)
잠자리와 저주 (오도나타 순서)는 변태와 가장 조상 곤충 중 하나를 나타냅니다, 그들은 그들의 서식지를 변경하는, 형태학, 그리고 푸팔 단계없이 지상파 / 공중 성인에 수생 애벌레에서 크게 행동. 오도나타 성인은 잘 발달 된 색상 비전을 가지고 있으며 남녀, 단계 및 종에 걸쳐 신체 색상과 패턴의 놀라운 다양성을 보여줍니다. 오도나타에 대한 많은 생태학적 및 행동 연구가 수행되었지만, 분자 유전 연구는 주로 오도나타에 유전자 기능 분석을 적용하는 데 어려움으로 인해 부족했습니다. 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi)은 Lepidoptera에서 보고된 바와 같이 오도나타에서 덜 효과적입니다. 이 문제를 극복하기 위해 생체 내 전기 포기와 결합된 RNAi 방법을 성공적으로 확립했습니다. 여기서 우리는 다음과 같이 전기 화 매개 RNAi 방법의 비디오를 포함하는 상세한 프로토콜을 제공합니다 : 애벌레의 준비, 종 식별, dsRNA / siRNA 용액 및 주사 바늘의 준비, 유충의 얼음 감기 마취, dsRNA / siRNA 주입, 생체 내 전기 화, 성인이 출현 할 때까지 개별 양육. 전기화 매개 RNAi 방법은 댐셀프(자고피테라 하위 오더)와 잠자리(하위 오더 아니스옵테라)에 적용가능하다. 이 프로토콜에서는, 우리는 잠자리 종의 또 다른 예로, 우리는 청꼬리 이쉬누라 세네갈렌시스 (코에나그로니다)에 대한 방법을 저주 종과 파이드 스키머 잠자리 의사 세포염 조나타 (리벨룰리대)의 예로 제시한다. 대표적인 예로, 멜라닌 합성 유전자 멀티구리 산화제 2를표적으로 하는 RNAi의 결과를 보여준다. 이 RNAi 방법은 오도나타의 변형, 형태 발생, 색상 패턴 형성 및 기타 생물학적 특징에 관여하는 다양한 유전자 기능에 대한 이해를 용이하게 할 것입니다. 더욱이, 이 프로토콜은 RNAi가 비효율성 과 낮은 침투로 인한 유전자 억제에 덜 효과적인 비모델 유기체에 일반적으로 적용될 수 있다.
잠자리와 담석 (오도나타 질서)은 “변태”1,2를나타내는 곤충의 가장 조상 그룹 중 하나입니다. 변태에 의해, 그들은 그들의 서식지를 변경, 형태, 그리고 행동 수생 애벌레에서 지상파/공중 성인3. 오도나타 성인은 잘 발달 된 색상 비전을 가지고 있으며 남녀, 단계 및 종3,4,5에걸쳐 신체 색상과 패턴의 놀라운 다양성을 나타냅니다. 오도나타에 대한 많은 생태 및 행동 연구가 실시된반면,6,7,분자 유전 연구는 주로 오도나타에 유전자 기능 분석을 적용하는 데 어려움에 의해 방해되고 있다.
상기 종래의 RNA 간섭(RNAi) 방법은, 이중 좌초 RNA(dsRNA)가 관심 있는 유전자의 기능을 억제하기 위해 주입되는8,오도나타 곤충9에서효과가 없는 것으로 밝혀졌으며, 레피도프테라곤충(10)에보고된 바와 같이. 한편, 이전 보고서는 전기포기 매개 RNAi가 레피도프테란 종, 특히 표피 조직11,12,13에서효과적이라고 제안했다. 우리는 최근에 전기 포기 매개 RNAi가 작은 잠자리 난노피라 피그마에아 (리벨룰리대: 아니스옵테라)9에서효과적으로 작동한다는 것을 것을을 발견했습니다 9, 그러나 N. pygmaea는 상대적으로 희소한 종이고 따라서 분자 유전 연구 결과에 적합하지 않습니다.
대부분의 오도나타 종은 두 개의 하위 오더중 하나, 자고피테라 (담터리) 또는 아니노테라 (진정한 잠자리)3중하나에 분류된다. 여기서 우리는 청색 꼬리에 초점을 맞추고 이쇠누라 세네갈렌시스 (코에나그로니대; 그림 1A) 대표적인 지고펫 종과 파이드 스키머 드래곤플라이 슈도테마시스 조나타(리벨룰리대; 그림 1B) 대표적인 아니시옵터종. 두 종은 쓰쿠바시를 포함하여 일본의 자연 및 도시 연못에서 가장 흔한 오도나타 종 중 하나이며, 우리는 현장에서 두 종의 많은 애벌레를 수집 할 수 있습니다. 최근에는 오도나타 애벌레의 발달및 형태발생에 대한 지속적인 모니터링을 가능하게 하는 I. 세네갈렌시스의개별 애벌레를 위한 실험실 사육 시스템을 구축하였으며,14.
본 보고서에서, 우리는 I. 세네갈렌시스 및 P. 조나타에서전기화 매개 RNAi에 대한 정제 된 방법 및 비디오 프로토콜을 제공합니다. 일본에서는 유전적으로 가까운 I. 세네갈렌시스와 이쉬누라 아시아티카가종종 교활하게15개,애벌레16에서구별하기 어렵다. 우리는 또한 2개의 Ischnura 종제한 단편 길이 다형성 (RFLP)에 의해 구별될 수 있는 방법을 설명합니다.
전기포기 매개 RNAi의 효과를 평가하기 위해, 유전자 발현9의녹다운 시 창백한 자염색의 가시형을 고려하여 다중구리 산화제 2 유전자(MCO2; laccase2라고도함)를 대표적인 표적 유전자로 선별한다. MCO2는 다양한 곤충종(17,18)에서표피의 어둡게 하는 데 필수적인 것으로 알려져 있다.
RNAi 치료의 치사성
우리는 RNAi 처리의 치사성이 오도나타 애벌레의 양육 역사 그리고 상태에 강하게 달려 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 현장에서 수집 직후 유충은 일반적으로 건강하고 전기 포기 매개 RNAi 치료 후 낮은 사망률을 나타낸다. 대조적으로, 오랜 기간 동안 실험실에서 자란 애벌레 (예를 들어, 한 달) 성인 출현의 낮은 성공률을 겪는 경향이 있습니다. I. 세네갈렌시스에서,현장에서 채취한 애벌레 대신, 계란으로부터 실험실에서 사육된 애벌레는14개,실험실에서 자란 애벌레를 사용하는 RNAi의 성공률은 현장에서 채취한 애벌레를 사용하는 것보다 상당히 낮은 경향이 있다(많은 개인이 변형 시 사망)하는 경향이 있다. 또한, 빈번한 애벌레 먹이주기와 깨끗한 물 사육은 성인 출현의 성공률을 높이고 RNAi 치료의 치사율을 감소시키는 데 중요합니다.
RNAi 처리의 효율성
전술한 바와 같이, RNAi 표현형의 수준, 즉 표피 탈색의 크기 및 위치, 종종 동일한 RNAi 치료를 실시하는 개인 들 간의 상당한 변화를 나타내었다 (예를 들어, 도 4),그러나 표현성 침투의 수준은 오도나타 종 사이에 현저하게 다른 것으로 보인다. 관찰된 페노티픽 영역은 P. 조나타(그림 6)와 N. 피그마야9보다 I. 세네갈렌시스(그림 4-5)에서더 크고 두드러졌다. 이러한 차이는 애벌레 표면에 표기의 두께때문일 수 있으며, I. 세네갈렌시스의 표절이 P. 조나타 및 N. 피그마에아의표피보다 얇다는 점을 고려하면). 우리가 조사한 한, siRNA와 dsRNA의 효과 사이에 명확한 차이가 인식되지않았다(도 4, 표 1).
RNAi에 대한 적절한 개발 단계
RNAi를 효율적으로 수행하는 데 적절한 애벌레 스테이징이 중요하다는 점에 유의해야 합니다. 성인 색소 침착의 억제는 N. pygmaea9에대한 이전 보고서와 일치하는 단계 D (성인 출현 약 3 일 전에) MCO2 RNAi에 의해 발생했다. 단계 C와 D단계에서 주사할 때 관찰된 RNAi 표현형은 A 단계와 B 단계에서 치료된 것보다 눈에 띄지 않았으며, 이는 C와 D 단계가 유전자 발현을 충분히 억제하기에는 너무 늦을 수 있음을 나타낸다. RNAi 처리를 위한 적당한 타이밍은 유전자 발현의 타이밍에 달려 있고, MCO2 유전자는 다른 곤충17,18에서와같이 성인 출현9도중 일시적으로 높은 발현을 전시합니다. 악취부 Plautia stali에서, MCO2 유전자의 RNAi 녹다운은 주사 후 4일부터 관찰되었다27,이는 현재의 결과와 일치한다.
I. 세네갈렌시스에 대한 우리의 이전 연구는, 단계 B 후, 성인 출현에 대한 일 최종 인스타 애벌레의 대다수 중 상대적으로 작은 변화를 나타낸다, 단계 B가 성인 출현을 향한 과정의 발병에 대응할 수 있음을 시사, 그 후 변태에 대한 발달 과정은 고정 및 조정 방식으로 진행14. 상처에 의한 형태학적 이상은 종종 애벌레가 C 단계와 D 단계에서 RNAi 처리되었을 때 관찰되었다(도 7B, 7C). 이것은 이 단계 도중 변태의 극적인 진행과 연관될 확률이 높습니다, RNAi 처리가 단계 C에서 그리고 에 피해야 한다는 것을 건의합니다. 요약하자면, 스테이지 A 또는 B(또는 애벌레 날개가 크게 확장되기 전에 무대에서) RNAi 실험에 최종 인스타 애벌레를 사용하는 것이 좋습니다.
전기포기 매개 RNAi 방법의 유용성과 우수성
종래의 RNAi는 간단하고 강력한 실험 방법이지만, 나비10,진딧물(28) 및 잠자리9와 같은 일부 곤충 계보는 낮은 RNAi 효율을 나타내며, 유전자 기능 분석의 확립이 주요 과제이다. 이 연구에서는, 전기포기 매개 RNAi가 적절한 발달 단계에서 치료하는 경우 적어도 표피에서 거의 100% 효율을 가진 잠자리에서 국소 유전자 억제를 유도할 수 있음을 발견했습니다(표1). 최근에는 CRISPR/Cas9 계 유전자 녹아웃이 다양한 곤충에 성공적으로 적용되어 비모델유기체(29)를위한 강력한 분자 유전 도구를 제공하고 있다. 여기서, 그러나, 우리는 CRISPR / Cas9는 확실히 중대하지만 전기 화 매개 RNAi 방법은 어떤 면에서 CRISPR / Cas9보다 우수 할 수 있음을 지적한다.
첫째, 전기포기 매개 RNAi 방법에서 RNAi 표현형이 나타나는 신체 부위는 전포화 시 양성 전극의 위치에 의해 실험적으로 쉽게 제어될 수 있다. 또한, 유전자 발현이 억제되는 영역은 양성 전극이 배치된 영역 주위에서 제한되기 때문에 RNAi 표현형은 동일한 개인에서 나란히 대조군 표현형과 쉽게 비교할 수 있다. 둘째, 주입된 계란이 녹아웃 표현형을 관찰하기 위해 성인기에 사육되어야 하는 CRISPR/Cas9 방법에 비해, 전기기 분과 매개 RNAi는 유전자 녹다운 표현형이 일반적으로 훨씬 짧은 시간에 관찰될 수 있다는 점에서 우수하다. 예를 들어, 나는 세네갈렌시스에 대해 3 ~4 개월, 계란에서 성인14,30까지 P. 조나타에 대해 1 ~ 2 년이 걸립니다. 그러나, 성인 표피 내에서 RNAi 표현형을 관찰하기 위해서는, DsRNA 주입에서 최종 인스타 애벌레로 의한 후 1개월 미만이 소요되며, 단계 B에서 성인 출현까지 I. 세네갈렌시스와 P. zonata(그림 7). 셋째, 전기포기 매개 RNAi 방법은 CRISPR/Cas9 방법에 필요한 작은 계란에 미세 주입보다 쉬운 큰 애벌레로 dsRNA 주입을 수반한다. 또한, 전기기 분과 매개 RNAi는 새로 낳은 알을 수집하기 어려운 곤충 종에 적용됩니다. 예를 들어, P. zonata의 암컷은 비행 중 수면에 떠있는 식물에 알을 낳기 때문에 현장과 실험실에서 계란을 수집하기가 어렵습니다. 따라서, 우리는 이 프로토콜이 통상적인 RNAi 방법이 효율적으로 작동하지 않는 비모델 유기체에 일반적으로 적용될 수 있기를 기대합니다.
The authors have nothing to disclose.
모리야마 미노루에게 기술적인 조언과 지원, 오도나타 애벌레를 수집한 비누로타와 스즈키 류타로, 그리고 원고에 대한 유용한 의견을 주신 미사 신야에게 감사드립니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP18J21561 GO 및 JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 및 JP20H04936에서 RF에 의해 지원되었다.
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |