Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Метод РНК-интерференции при электропорации в Одоната

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61952
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2
1Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 2Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 3Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

Summary

Мы предоставляем подробный протокол для электропорации опосредованного РНК-интерференции в насекомых порядка Odonata (стрекозы и damselflies) с использованием синехвостый damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Зигоптера) и pied skimmer стрекоза (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Abstract

Стрекозы и damselflies (порядок Odonata) представляют собой один из самых предков насекомых с метаморфозами, в которых они меняют свою среду обитания, морфологии и поведения резко от водных личинок до наземных / воздушных взрослых без куколки этапе. Взрослые Odonata имеют хорошо развитое цветовое зрение и показывают замечательное разнообразие цветов и узоров тела между полами, стадиями и видами. Хотя было проведено много экологических и поведенческих исследований Odonata, молекулярно-генетические исследования были скудными главным образом из-за трудностей в применении генного функционального анализа к Odonata. Например, РНК-интерференция (РНК) менее эффективна в Одонатах, как сообщается в Lepidoptera. Чтобы преодолеть эту проблему, мы успешно создали метод РНК в сочетании с электропорацией in vivo. Здесь мы предоставляем подробный протокол, включающий видео электропорации опосредованного метода РНК следующим образом: подготовка личинок, идентификация видов, подготовка раствора dsRNA/siRNA и иглы для инъекций, ледяная анестезия личинок, инъекция dsRNA/siRNA, электропорация in vivo и индивидуальное воспитание до появления взрослых. Метод РНК, опосредованный электропорацией, применим как к плотинам (подзарядка Зигоптера), так и к стрекозам (подзаказ Anisoptera). В этом протоколе, мы представляем методы для синехвостый damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) в качестве еще одного примера damselfly видов и pied скиммер стрекоза Pseudothemis zonata (Libellulidae) в качестве еще одного примера стрекоз видов. В качестве репрезентативных примеров мы показываем результаты РНК, ориентированных на ген синтеза меланина multicopper oxidase 2. Этот метод РНК облегчит понимание различных функций генов, участвующих в метаморфозах, морфогенезе, формировании цветовых паттернов и других биологических особенностях Одонаты. Кроме того, этот протокол может быть в целом применим к не-модель организмов, в которых РНК является менее эффективным в подавлении генов из-за неэффективности и низкого penetrance.

Introduction

Стрекозы и damselflies (порядок Odonata) являются одними из самых предков групп насекомых, которые проявляют "метаморфозы"1,2. По метаморфозы, они меняют свою среду обитания, морфологии и поведения резко от водных личинок наземных / воздушныхвзрослых 3. Odonata взрослых имеют хорошо развитое цветовое зрение и представляют собой замечательное разнообразие в цветах тела и узоры между полами, этапами ивидами 3,4,5. Хотя многие экологические и поведенческие исследования на Odonata былипроведены 6,7, молекулярно-генетические исследования были затруднены главным образом трудности в применении генного функционального анализа Odonata.

Обычный метод РНК-интерференции (РНК), при котором двухструновая РНК (dsRNA) вводится для подавленияфункции гена интереса 8, оказался неэффективным у насекомых Одоната9, как сообщается в Lepidopteranнасекомых 10. С другой стороны, предыдущие доклады показали, что электропорация опосредованных РНК эффективен в Lepidopteran видов, особенно в эпидермальныхтканях 11,12,13. Недавно мы обнаружили, что электропорация опосредованное РНК эффективно работает в крошечной стрекозе Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, но N. pygmaea является относительно редким видом и поэтому не подходит для молекулярно-генетических исследований.

Большинство видов Одоната классифицируются на любой из двух подзарядок, Зигоптера (damselflies) или Anisoptera (истинные стрекозы)3. Здесь мы сосредоточились на синехвостый damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Рисунок 1A) в качестве представителя вида Зигоптеран и скиммерной стрекозы Pseudothemis zonata (Libellulidae; Рисунок 1B) в качестве представителя анизопротеранского вида. Эти два вида являются одними из наиболее распространенных видов одоната в естественных и городских прудов в Японии, в том числе в цукуба-Сити, и мы можем собрать много личинок двух видов в этой области. Недавно мы создали лабораторную систему выращивания отдельных личинок I. senegalensis, которая позволила непрерывно контролировать развитие и морфогенез личинок Одонатыв деталях 14.

В этом отчете мы предоставляем усовершенствованную методику и видео протокол для электропорации опосредованного РНК в I. senegalensis и P. zonata. В Японии, I. senegalensis и Ischnura asiatica, которые генетически близки, часто встречаются симпатрически15, и они трудно различить вличинках 16. Мы также описываем, как два вида Ишнуры можно отличить по полиморфизму длины фрагмента ограничения (RFLP).

Для оценки эффективности электропорации опосредованных РНК, мы выбираем многокопперный оксидазы 2 ген (MCO2; также известный как laccase2) в качестве репрезентативного гена цели, из-за видимого фенотипа бледнее кутикулы цвета при нокдауне экспрессиигена 9. MCO2, как известно, имеет важное значение для затемнения эпидермиса в различныхвидах насекомых 17,18.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема протоколов показана на рисунке 1.

1. Подготовка личинок стрекоз или damselflies.

  1. Собирайте личинок в поле с помощью ручной сетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки I. senegalensis часто цепляются за водные растения, плавающие на поверхности воды, в то время как личинки P. zonata часто остаются среди листового помета на дне. В городе Цукуба, последние личинки звезды I. senegalensis находятся в основном с марта по июнь, и те из P. zonata с мая по июнь. Личинки I. senegalensis могут быть вырасти из яиц влаборатории 14, но личинки, собранные в полевых условиях, имеют явно более высокий уровень успеха взрослого появления.
  2. Идентификация видов путем ограничения длины фрагмента полиморфизма (RFLP) продуктов, усиленных ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только в том случае, если вид трудно определить по внешнему виду личинок, как в I. senegalensis.
    1. Держите один из хвостовой жабры личинки с помощью хлипов. Затем личинка падает с самой хвостовой жабры (вызывая аутотомию).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки zygopteran damselflies обычно имеют три хвостовой жабры (Рисунок 1A). Когда они подвергаются нападению хищника, они могут снять свои собственные хвостовой жабры, чтобы избежать. Если хвостовая жабры недоступна, часть ноги рассекается.
    2. Положите один хвостовой жабры в 100 л раствора PBS 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4, и 0,02% KH2PO4 (w/v) и гомогенизировать с ручной смеситель с помощью депозита пестик.
    3. Спин вниз смесь на 5000 х г в течение 10 секунд, и предметом 0,5 МКЛ супернатанта для ПЦР-усиления с помощью полимеразы ДНК и грунтовки для усиления внутреннего транскрибируется космический 1 (ITS1) области ядерной ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните ПЦР в соответствии с протоколом производителя. Сочетание ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') и 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') грунтовки могут усилить ITS1 региона почти во всех видах Odonata19.
    4. Инкубировать смесь 1 МКЛ ПЦР-усиленный продукт, 0,3 МКЛ из 10x M Буфер, 0,1 МКЛ фермента ограничения DraI, и 1,6 мл воды при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите лучшие ферменты ограничения, в зависимости от сочетания видов. Если нет никаких ограничений ферментов, пригодных для идентификации видов, подтвердите секвенирование ДНК.
    5. Загрузите 2 мл продуктов с погрузочным красителем на 2% агарозного геля и запустите электрофорез.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно определить виды при использовании 1% или 1,5% агарозы гель.
    6. Проверьте шаблон электрофорез для идентификации вида(рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модели РФПЛ зависят от видов и популяций. В популяции Цукуба, I. asiatica имеет большую полосу 400-500 bp, в то время как I. senegalensis имеет большую полосу около 200 bp и дополнительную полосу менее 100 bp (наконечник стрелы на рисунке 2). Область ITS1 существует в нескольких копиях в геноме, а в видах Ишнура микроспутник полиморфизм в регионе ITS1 часто присутствует в одном и том же человеке, влияя на структуру RFLPs.
  3. Задняя собранные личинки в лаборатории до использования для РНК.
    1. Поместите каждую личинку отдельно в каждый колодец из 12-хорошо пластины с примерно 3 мл воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки I. senegalensis должны храниться индивидуально, потому что они часто каннибализируют друг друга, в то время как личинки P. zonata могут храниться в группе, потому что они редко каннибализируются.
    2. Кормите личинок I. senegalensis креветками Артемия рассол каждый день и личинками P. zonata с кровяными червями и/или червями Tubifex по крайней мере два раза в неделю, пока они не вырастут до подходящей стадии развития для РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частое кормление имеет решающее значение для увеличения успеха взрослого появления.
    3. Изменение воды, как только она становится грязной с фекалиями или остатками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частые изменения воды также имеет важное значение для увеличения успеха взрослого появления.
    4. Судите о соответствующем этапе развития РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные личинки instar I. senegalensis можно классифицировать на пять стадийразвития 14,20. Первый этап (этап А, до того, как крылья начнут расширяться) или второй этап (этап B) окончательных личинок instar подходит для экспериментов РНК, при рассмотрении четкого фенотипа РНК после появления взрослых (см. Обсуждение). В P. zonata, окончательные личинки instar перед расширением крыла (соответствующие этапу A I. senegalensis) были использованы в этом исследовании.

2. Подготовка раствора dsRNA/siRNA и инъекционных игл для РНК.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите либо небольшую мякать РНК (siRNA) (шаг 2.1) или двухместную РНК (dsRNA) (шаг 2.2) в качестве решения для РНК.

  1. Приготовление раствора siRNA
    1. Дизайн siRNA использованием siDirect версия программы 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21, следуя руководящим принципам ранее сообщалось в Lepidopteranнасекомых 22.
    2. Получение коммерчески синтезированной siRNA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности siRNA ориентации MCO2 гена I. senegalensis, используемых в этом исследовании были следующими: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' для чувства пряди и 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' для антисенсовой нити. В качестве отрицательного контроля, последовательности siRNA ориентации расширенного зеленого флуоресцентного белка(EGFP) ген были следующими: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' для чувства пряди и 5'- UUG AAG UUC АКК UUG AUG CCG -3' для антисенсовойнити 11.
    3. Разбавить siRNA до 100 МКм с инъекционным буфером 100мМCH 3 COOK, 2 мМ Мг (CH3COO)2, 30 мМ HEPES-KOH, рН 7,4"22.
    4. Хранить при -80 градусов по Цельсию до использования.
  2. Подготовка раствора dsRNA.
    1. Выберите область 300-400 bp для dsRNA, используя версию программы primer3 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 и спроектировать наборы грунтовок.
    2. Получить коммерчески синтезированные наборы грунтовок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для производства шаблонов для синтеза dsRNA, грунтовки наборы, используемые в этом исследовании были следующими: (5'- GCC TGT CAG CTT CTT CTT CC -3' для вперед грунтовки и 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' для обратного грунтовки) для генов MCO2 I. senegalensis (IsMCO2, присоединение нет. LC589180) и (5'- CCG CAC AGC TCA CCA TTC AA -3' для форварда грунтовки и 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' для обратного грунтовки) для генов MCO2 P. zonata (PzMCO2, присоединение нет. LC589179). В качестве отрицательного контроля, грунтовка набор для dsRNA ориентации β-лактамаза (бла) ген на вектор клонирования были (5'- CTA TGT GGC GG GTA TTA T -3' для вперед грунтовки и 5'- CAG AAG TGG TCC TGC AAC T -3' для обратного грунтовки).
    3. Извлекайте РНК из личинок Odonata, используя коммерчески доступный комплект для извлечения РНК и выполняйте синтез cDNA с использованием обратной транскриптазы в соответствии с протоколом производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: библиотека cDNA, подготовленная для анализа секвенирования РНК, также может быть использована.
    4. Усильте целевые последовательности с помощью синтезированного cDNA и разработанного грунтовки и клонировать их в вектор клонирования, используя коммерческую лигону в соответствии с протоколом производителя.
    5. Превратите плазмиду в компетентные клетки кишечной палочки и подберите одну колонию после ночной инкубации.
    6. PCR-усилить область вставки с помощью грунтовки на векторе.
    7. Подтвердите клонированную последовательность секвенированием Сэнгера.
    8. PCR-усилить вставку с помощью векторных праймеров, содержащих T7 полимеразы промоутерпоследовательности 24, 25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, следующие грунтовки были использованы: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA TCA TCA GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') и T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA TCA GGA GAC GG GGG GG TG CGA T - 3') 25.
    9. Очистить продукт ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с протоколом производителя, очистить ДНК с 50 йл дистиллированной воды, и сконцентрировать eluted раствор ДНК примерно до 10 йл с помощью центробежного испарителя.
    10. Синтезировать dsRNA с помощью транскрипции in vitro в соответствии с протоколом производителя. Используйте в общей сложности 1000 нг шаблон ДНК и elute синтезированных dsRNA с 100 йл элюционного буфера.
    11. Измерьте концентрацию dsRNA с помощью спектрофотометра и подтвердите качество dsRNA электрофорезом на 1,5% агарозного геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна полоса может быть замечена, когда синтез dsRNA является успешным.
    12. Разбавить dsRNA до 1000 нг/ЗЛ с элюционным буфером и хранить при -20 градусов по Цельсию до использования.
  3. Подготовка инъекционных игл
    1. Потяните стеклянную капиллярную крышку с помощью стеклянной иглы шкив.
    2. Поместите кончик вытянутой капиллярной камеры на двустороннюю клейкую ленту и сломаем кончик капилляра типсами.
    3. Установите капилляр для инжектора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Легче обрабатывать капилляры, если вы носите нитриле перчатки.
    4. Загрузите раствор siRNA/dsRNA к подготовленному капилляру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте капилляры неоднократно, так как кончик вводили капилляр может стать забиты грязью, потому что личинки, собранные в поле жили в грязи.

3. инъекция siRNA/dsRNA

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура немного отличается для damselflies (шаг 3.1) и стрекоз (шаг 3.2).

  1. Инъекция личинке Зигоптеран (damselfly) (например, I. senegalensis).
    1. Обезболивать личинку, покрытую влажной бумагой на дробленом льду в течение 50-70 секунд(рисунок 3A-C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность ледяной анестезии зависит от состояния личинки; если личинка начинает двигаться после 70 секунд ледяной анестезии, применяется дополнительная 70 секунд ледяной анестезии. Для личинок, которые редко перемещаются (например, P. zonata), эта процедура не является существенной.
    2. Прикрепите два штыря по обе стороны проторакса и закрепите личинку на фиксированном стенде (например, кусок пенополистирола)(рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте положение и количество булавок, в зависимости от места инъекции.
    3. Растянуть меж сегментальную мембрану между 7-м и 8-м сегментом брюшной полости для РНК в брюшной полости или между протораксом и синтораксом (сплавленный мезоторакс и метаторакс) для РНК в грудной клетке с помощью рук и хлипок.
    4. Держите меж сегментальную мембрану растянутой вручную.
    5. Вставьте кончик подготовленного капилляра в растянутую межрегиональную мембрану(рисунок 3D, 3F).
    6. Впрыснуть 1 МКЛ раствора siRNA/dsRNA.
  2. Инъекция анизоптерана (стрекоза) личинки (например, P. zonata).
    1. Протрите воду с поверхности личинки бумажным полотенцем.
    2. При необходимости прикрепите два штыря по обе стороны проторакса и закрепите личинку на фиксированном стенде (например, кусок пенополистирола)(рисунок 3H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте положение и количество булавок, в зависимости от места инъекции. В случае P. zonata, не важно, чтобы исправить личинки с булавками на этом шаге.
    3. Растянуть меж сегментальную мембрану между 4-м и 5-м сегментом брюшной полости вручную.
    4. Сделайте небольшое отверстие с тонкой иглой в межрегиональной мембране между 4-м и 5-м сегментом брюшной полости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура необходима для многих видов анизоптерана (стрекоза), потому что межклогементальная мембрана слишком трудно вставить стеклянный капилляр непосредственно.
    5. Вставьте кончик подготовленного капилляра в подготовленное отверстие(рисунок 3I).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 3H, часть спинной стороны личинок соответствует брюшной стороне взрослого, так фенотип появляется венралько при лечении, как показано на рисунке 3H-J.
    6. Впрыснуть 1 МКЛ раствора siRNA/dsRNA.

4. электропорация in vivo

  1. При необходимости добавьте дополнительные булавки, чтобы зафиксировать личинку на фиксированном стенде (например, кусок пенополистирола).
  2. После инъекции раствора siRNA/dsRNA нанесите две капли ультразвукового геля на поверхность личинки с помощью хлипов.
  3. Поместите электроды на ультразвуковой гель, с положительным электродом на стороне, впрыснутой раствором siRNA/dsRNA и отрицательным электродом на противоположной стороне(рисунок 3E, 3G, 3J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь непосредственно к эпидермису личинки, чтобы избежать жгучего эффекта электропорации.
  4. Создайте 10-ти раз электропорации импульсов (280 мс / с каждый) с помощью электропоратора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте напряжение электропорации, в зависимости от вида, стадий и тканей. В этом исследовании, 25 V был применен к I. senegalensis и 45 V P. zonata.
  5. Протрите оставшийся гель на поверхности бумажным полотенцем.
  6. Держите обработанные личинки опираясь на мокрое бумажное полотенце в течение примерно одного дня для восстановления и передать их в случае воспитания на следующий день.

5. Фенотипический анализ по конкретным сайтам

  1. Храните I. senegalensis индивидуально в чашке Петри (5 см в диаметре), содержащей приблизительно 10 мл воды и листок бумажного полотенца, и держите P. zonata в пластиковой клетке с одноразовой нетканой сеткой (клетка14).
  2. Для I. senegalensis, после того, как личинки перестают есть, переместить их индивидуально в пластиковую клетку с одноразовой нетканой сеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не помойте две или более личинок в одной клетке. В противном случае, они будут каннибализировать друг друга сразу же после того, как они становятся взрослыми.
  3. После появления взрослого, наблюдать и фотографировать фенотип вокруг области, где положительный электрод был помещен для электропорации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотип появляется только в патчах. Фенотипы часто трудно распознать сразу после появления из-за неполной пигментации.
  4. Для изучения эффективности РНК (например, количественного РТ-ПЦР), если фенотип виден, вскрыть область и сравнить ее с областью без фенотипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни фенотипа РНК, а именно размер и расположение деколоризации кутикулы, часто демонстрируют значительные различия между отдельными лицами (см. рисунок 4).
  5. Держите появились взрослые в 100% EtOH для будущих анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет тела вида Odonata быстро исчезает после смерти, поэтому важно хранить их в этаноле, прежде чем они умрут. Этанол иногда обесцвечивает насекомых, в таких случаях, что насекомые заморожены, прежде чем они умирают.

Representative Results

Мы применили вышеуказанный протокол к электропорации опосредованного РНК ориентации гена MCO2 и отрицательного контроля генов(EGFP для siRNA и бла для dsRNA) (i) в брюшной полости I. senegalensis (Рисунок 4), (ii) в грудной клетке I. senegalensis (Рисунок 5), и (iii) в брюшной полости P. zonata (Рисунок 6). Результаты экспериментов РНК обобщены в таблице 1. Поскольку отрицательно заряженная siRNA/dsRNA включается только в положительно заряженные клетки, фенотипы РНК наблюдались по всему региону, где положительный электрод был помещен для электропорации.

В обоих I. senegalensis и P. zonata, ингибирование пигментации меланина (т.е. черный, коричневый и красновато-коричневый) появились в пятнах вокруг региона, где положительный электрод был помещен (белые наконечники стрел и пунктирные линии на рисунке 4, Рисунок 5, и рисунок 6), когда MCO2 РНК была выполнена в сочетании с электропорацией (таблица1), как сообщалось ранее в N. pygma. В отличие от этого, никаких фенотипических эффектов не наблюдалось вокруг места электропорации, когда ген управления вводился(EGFP siRNA или bla dsRNA)(рисунок 4,рисунок 5 , и рисунок 6, Таблица 1). Кроме того, введение гена MCO2 без электропорации не повлияло на пигментациювзрослых (рисунок 4, таблица 1), что указывает на то, что электропорация необходима для РНК в Одоната. Следует отметить, что синий, зеленый и желтый окраски не влияют на РНК гена MCO2, который участвует в синтезе меланина в кутикуле, которые правдоподобно отражают тот факт, что эти цвета тела приписываются пигментных гранул, присутствующих в эпидермальных клетках, которые видны черезпрозрачную кутикулу 26. Как показано на рисунке 4, никаких замечательных фенотипических различий были признаны между лицами, подвергаемых лечению siRNA и лечения dsRNA, в то время как значительные различия в размерах и местоположении фенотипа РНК наблюдались среди различных лиц, подвергаемых одному и тому же лечению РНК (например, сравнить два примера ISMCO2 dsRNA на рисунке 4).

Чтобы определить стадию развития, наиболее подходящую для лечения РНК, мы сравнили фенотипические последствия лечения РНК на пяти морфологических стадиях (этап А-Е) в конечной личинке звезды I. senegalensis (рисунок 7A). Ингибирование пигментации меланина, вызванной MCO2 РНК наблюдалось у всех возникающих взрослых при введении на этапах А и В(рисунок 7C). При введении на стадиях C и D, подавление пигментации меланина, безусловно, наблюдается в некоторых появились взрослые, но другие взрослые выставлены ненормальной окраски, вызванной ранами (Рисунок 7B).

Figure 1
Рисунок 1: Электропорация-опосредованное методы РНК в Одонате. А. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) как представитель damselfly видов. Б. Pseudothemis zonata (Libellulidae) как представитель вида стрекоз. К. Общая схема протоколов. Синие и оранжевые коробки указывают протоколы для I. senegalensis и P. zonata, соответственно. Фиолетовые ящики указывают на общие протоколы, применяемые к обоим видам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативный результат полиморфизма длины фрагмента ограничения (RFLP) на основе идентификации видов для видов Ишнура. Arrowhead указывает на I. senegalensis-специфическойгруппы. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-базовая пара лестницы маркера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Электропорация-опосредованное метод RNAi в Odonata. А-С. Ледяная анестезия I. senegalensis. Наконечники стрел указывают на личинку. А. Положить личинку на дробленый лед с мокрой бумагой. Б. Увеличенный вид личинки на льду. К. Личинка, покрытая мокрой бумагой на льду. Д-Г. Метод РНК для I. senegalensis. Д. Инъекция в грудную клетку. Е. Электропорация на грудной клетке. Ф. Инъекция в живот. Г. Электропорация на животе. Х-Джей. Метод РНК для P. zonata. Х. Создание небольшое отверстие на животе. Я. Инъекция в живот. Дж. Электропорация на животе. Стрелки указывают на точку сделать отверстие или инъекции. Вопрос, -: Положительные/отрицательные боковые электроды. Цифры указывают на брюшной сегмент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Дорсальные виды фенотипов РНК на животе I. senegalensis. Белые наконечники стрел указывают на регионы подавленной меланизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Боковой и спинной мнения фенотипов РНК на грудной клетке I. senegalensis. Белые наконечники стрел и пунктирные линии указывают на области подавленной пигментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Вентальные виды фенотипов РНК в брюшной полости P. zonata. Белые наконечники стрел и пунктирные линии указывают на регионы подавленной меланизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Этап зависит IsMCO2 РНК эффекты во время окончательного личинки instar I.senegalensis. А. Морфологические изменения в сложных глазах на пяти морфологических стадиях (этап A-E) и количество дней для взрослого появления в этом исследовании. Номера в скобках из предыдущего отчета14. Б. Аномальная пигментация из-за ран. Стрелка указывает на место электропорации. К. Влияние РНК на пяти морфологических стадиях на пигментацию взрослых в I. senegalensis. Номер на баре указывает количество лиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Видов И.Сенегаленис П.Зоната
Инъекционный регион Живота Грудной клетки Живота
siRNA/dsRNA siRNA dsRNA dsRNA dsRNA
Целевой ген IsMCO2 EGFP IsMCO2 IsMCO2 Бла IsMCO2 Бла PzMCO2 PzMCO2 Бла
Электропорация + + + - + + + + - +
Инъекционные личинки 22 25 30 6 53 12 20 17 5 9
Появились взрослые 7 6 13 4 40 11 14 11 2 5
Взрослые с менее пигментными регионами (коэффициент) 7
(100%)		 0
(0%)		 13
(100%)		 0
(0%)		 0
(0%)		 10
(91%)		 0
(0%)		 11
(100%)		 0
(0%)		 0
(0%)

Таблица 1. Влияние РНК на пигментацию взрослых в I. senegalensis и P. zonata. Результаты на этапе А показаны в I. senegalensis. IsMCO2: мультикоппер оксидазы 2 гена I. senegalensis, EGFP: Улучшенный зеленый флуоресцентный ген белка, бла: бета-лактамазы ген от pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: мультикоппер оксидазы 2 гена P. zonata. Результаты для контрольных генов представляют общее количество экспериментов, проведенных авторами на сегодняшний день.

Discussion

Летальность лечения РНК

Мы обнаружили, что летальность лечения РНК сильно зависит от истории воспитания и состояния личинок Одонаты. Личинки вскоре после сбора в поле, как правило, здоровы и демонстрируют низкие показатели смертности после электропорации опосредованного лечения РНК. В отличие от этого, личинки, подрастаемые в лаборатории в течение длительного периода времени (например, один месяц), как правило, страдают от низких показателей успеха взрослого появления. В I. senegalensis, вместо личинок, собранных в полевых условиях, личинки, вырастиеные в лаборатории изяиц, могут быть использованы 14, но показатели успеха РНК с использованием лабораторно-хозяйских личинок, как правило, значительно ниже (многие люди умерли во время метаморфоз), чем те, которые используют собранные на местах личинки. Кроме того, частое кормление личинками и выращивание чистой воды имеют важное значение для повышения успешности взрослого возникновения и снижения летальности лечения РНК.

Эффективность лечения РНК

Как описано выше, уровни фенотипа РНК, а именно размер и расположение деколоризации кутикулы, часто проявляли значительные различия между лицами, подвергаемыми той же обработке РНК (например, рисунок 4), но уровни фенотипического пенетранса, кажется, удивительно отличаются между видами Одонаты. Наблюдаемые фенотипические регионы были больше и заметнее в I. senegalensis (рисунки 4-5),чем в P. zonata (рисунок 6) и N. pygmaea9. Эта разница может быть связана с толщиной кутикулы на поверхности личинки, учитывая, что кутикула I. senegalensis тоньше, чем кутикула P. zonata и N. pygmaea). Насколько мы рассмотрели, не было признано четкой разницы между эффектами siRNA и dsRNA(рисунок 4, таблица 1).

Соответствующий этап развития РНК

Следует отметить, что правильная постановка личинок важна для эффективного выполнения РНК. Ингибирование пигментации взрослых было вызвано MCO2 РНК до стадии D (примерно за 3 дня до появления взрослого), что согласуется с предыдущим докладом о N. pygmaea9. Фенотипы РНК, наблюдаемые при введении на стадиях C и D, были менее заметными, чем те, которые лечились на стадиях А и В, которые указывают на то, что этапы C и D могут быть слишком поздно, чтобы достаточно подавить экспрессию генов. Подходящее время для лечения РНК зависит от сроков экспрессии генов, и ген MCO2 проявляет преходящую высокую экспрессию во время появлениявзрослых 9, как и удругих насекомых 17,18. В stinkbug Plautia stali, РНК нокдаун гена MCO2 наблюдался с 4-го дня послеинъекции 27, что соответствует нынешним результатам.

Наше предыдущее исследование на I. senegalensis показало, что после этапа B, дней до появления взрослых проявляют относительно небольшие различия между большинством окончательных личинок instar, предполагая, что этап B может соответствовать началу процесса к появлению взрослых, после чего процессы развития метаморфозы продолжаются в префиксированной искоординированной манере 14. Морфологические аномалии, вызванные ранами, часто наблюдались, когда личинки лечились РНК на стадиях C и D(рисунок 7B, 7C). Это, вероятно, будет связано с резким прогрессированием метаморфозы на этих стадиях, предполагая, что лечение РНК следует избегать от стадии С и далее. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы окончательные личинки instar на этапе A или B (или на этапе, прежде чем личиночиное крыло значительно расширить) должны быть использованы для экспериментов РНК.

Полезность и превосходство метода РНК, опосредованного электропорацией

Обычный РНК является простым и мощным экспериментальным методом, но некоторые линии насекомых,как бабочки 10, тля28 и стрекозы9 демонстрируют низкую эффективность РНК, для которых создание анализа функции генов является серьезной проблемой. В этом исследовании мы обнаружили, что электропорация опосредованного РНК может вызвать локальное подавление генов у стрекоз с почти 100% эффективностью, по крайней мере в эпидермис, если лечить на соответствующих стадиях развития (Таблица 1). В последнее время, CRISPR / Cas9 основе генов нокауты были успешно применены к различным насекомым, обеспечивая мощный молекулярно-генетический инструмент для не-модель организмов29. Здесь, однако, мы узнаем, что CRISPR/Cas9, безусловно, велик, но электропорация опосредованного метода РНК может быть выше CRISPR/Cas9 в некоторых отношениях.

Во-первых, в методе РНК, опосредованном электропорацией, область тела, где появляются фенотипы РНК, может легко контролироваться экспериментально положением положительного электрода при электропорации. Кроме того, поскольку область, где экспрессия генов подавляется ограничена вокруг области, где положительный электрод был помещен, фенотипы РНК можно легко сравнить с контрольными фенотипами бок о бок в одном и том же человеке. Во-вторых, по сравнению с методом CRISPR/Cas9, в котором инъекционные яйца должны быть воспитаны до совершеннолетия, чтобы наблюдать нокаут фенотипы, электропорация опосредованного РНК превосходит в том, что ген нокдаун фенотипы обычно можно наблюдать в гораздо более короткое время. Например, это занимает от трех до четырех месяцев для I. senegalensis и от одного до двух лет для P. zonata от яицдо взрослых 14,30. Однако, для того, чтобы наблюдать фенотипы РНК в рамках взрослого эпидермиса, это занимает менее одного месяца от инъекции dsRNA в окончательные личинки instar на этапе B для взрослых появление как для I. senegalensis и P. zonata (Рисунок 7). В-третьих, метод РНК, опосредованный электропорацией, влечет за собой инъекцию dsRNA в крупные личинки, что проще, чем микроинъекция в крошечные яйца, необходимые для метода CRISPR/Cas9. Кроме того, электропорация опосредованная РНК применима к видам насекомых, чьи недавно откладанные яйца трудно собрать. Например, самки P. zonata откладывают яйца на плавающие растения на поверхности воды во время полета, и поэтому трудно собрать их яйца как в поле, так и в лаборатории. Таким образом, мы ожидаем, что этот протокол может быть в целом применим к не модели организмов, в которых обычный метод РНК не работает эффективно.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Минору Морияму за техническую консультацию и поддержку, Бин Хирота и Рютаро Судзуки за сбор личинок Одонаты и Мису Синю за полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI Грант номера JP18J21561 GO и JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287, и JP20H04936 в РФ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Violamo VTC-P12 For rearing larvae before injection
Brine shrimp eggs JAPAN PET DESIGN 4975677012396
Calibrated micropipette (1-5 µL) Drummond 2-000-001-90
Deposit pestle 1.5 mL Thermo Fisher Scientific K749520-0090
Digital high defenition microscope camera Leica Microsystems MC170HD
Disposable non-woven mesh HAKUGEN EARTH DSC-105A
DNA Ligation Kit Ver.2.1 Takara Bio 6022
DraI Takara Bio 1037A
Electrode (1mmφ) NEPAGENE CUY650P1
Electroporator CellProduce Cure-gene
Forceps KOWA Forceps Industry K-10 No1
Glass needle puller NARISHIGE PN-3
Hand mixer AS ONE 1-229-02
Hand net HOGA IS33-3B
HEPES FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 346-01373 For injection buffer
Insect pin capitate No. 3 Shiga Konchu Fukyusha N230 For fixing larvae
KCl FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 163-03545 For PBS
KH2PO4 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 169-04245 For PBS
KOAc FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 160-03175 For injection buffer
KOH FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 168-21815 For injection buffer
Laboratory Jack (150x150) AS ONE 1-4642-11 For adjusting the position of the manipulator
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type GE Healthcare 2369385
Manipulator Muromachi Kikai Co., Ltd. SJ-1 For adjusting the position of the injector and the capillary
MEGAscript RNAi kit Thermo Fisher Scientific AM1626
Mg(OAc)2 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 130-00095 For injection buffer
Na2HPO4 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 197-02865 For PBS
NaCl FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 191-01665 For PBS
Petri dish (5 cm diameter) Iwaki 1010-060 For rearing injected larvae
Pneumatic Injector NARISHIGE IM-12
pT7Blue T-Vector Novagen 69820
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
RNAiso Plus FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 9109
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74106
Shiga micro insect pin with stainless headless Shiga Konchu Fukyusha N251 For making a small hole
Stereoscopic microscope Leica Microsystems S8APO
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010
TaKaRa Ex Taq Takara Bio RR001B For PCR-amplification from plasmid
Tks Gflex DNA Polymerase Takara Bio R060B For PCR-amplification from caudal gill

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
  2. Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
  3. Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
  4. Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
  5. Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
  6. Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
  7. Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
  8. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
  9. Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
  10. Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
  11. Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
  12. Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
  13. Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
  14. Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
  15. Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
  16. Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
  17. Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
  18. Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
  19. Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S. Interspecific hybrids in Japanese Odonata. Tombo. 60, 1-49 (2018).
  20. Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
  21. Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
  22. Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
  24. Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
  25. Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
  26. Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
  27. Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
  28. Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
  29. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  30. Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).

Tags

Биология развития Выпуск 168 РНК-интерференция РНК виво электропорация Ген нокдаун Стрекоза Дамсели Одоната Ишнура сенегаленсис,Псевдотемис зоната
Метод РНК-интерференции при электропорации в Одоната
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi,… More

Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata. J. Vis. Exp. (168), e61952, doi:10.3791/61952 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter