Summary
يصف هذا البروتوكول تطبيقات تعطيل العينة باستخدام جلطات الفيبرين، والحد من الانجراف، والسماح بإضافة الكواشف وغسلها أثناء التصوير الحي. يتم نقل العينات إلى قطرة من الفيبرينوجين تحتوي على وسيطة الثقافة على سطح غطاء، وبعد ذلك يتم تحريض البلمرة عن طريق إضافة الثرومبين.
Abstract
Drosophila هو نظام نموذجي مهم لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يمكن استخراج الأعضاء والأنسجة المختلفة من مراحل النمو المختلفة للذبابة مثل الأقراص التصويرية أو الدماغ اليرقاني أو غرف البيض للإناث البالغات أو الأمعاء البالغة والاحتفاظ بها في الثقافة للتصوير بالمنظار الدقيق الفاصل زمنيا ، مما يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا الخلية والتطور. هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكولنا الحالي لتشريح أدمغة يرقات دروسوفيلا ، ثم نقدم نهجنا الحالي لشل وتوجيه أدمغة اليرقات والأنسجة الأخرى على غطاء زجاجي باستخدام جلطات فيبرين. تتطلب طريقة التجميد هذه إضافة الفيبرينوجين والثرومبين إلى وسيط الثقافة. وهي مناسبة للتصوير الفاصل الزمني عالي الدقة على المجاهر المقلوبة لعينات متعددة في طبق الثقافة نفسه ، وتقلل من الانجراف الجانبي الناجم في كثير من الأحيان عن حركات مرحلة المجهر في المجهر الزائر متعدد النقاط ويسمح بإضافة وإزالة الكواشف أثناء التصوير. كما نقدم وحدات الماكرو حسب الطلب التي نستخدمها بشكل روتيني لتصحيح الانجراف واستخراج ومعالجة معلومات كمية محددة من تحليل الفاصل الزمني.
Introduction
لا يزال دروسوفيلا نظاما نموذجيا مهما لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية وقد برع في تطوير المعرفة في العديد من التخصصات لعقود. ميزة واحدة تجعلها تبرز بشكل خاص هي أنها مناسبة بشكل خاص للتصوير الحي. القدرة على رصد العمليات دون الخلوية أو سلوك الخلايا والأنسجة في الوقت الحقيقي لا تزال تسهم في توليد المفاهيم الرئيسية ذات الصلة بيولوجيا الخلية والتنموية. وقد وضعت العديد من البروتوكولات الناجحة من قبل مجموعات مختلفة للحفاظ على هذه العينات Drosophila على قيد الحياة وصحية لدراسة سلوك العينة وجزيئات الفلورسنت الحية. يمكن استخراج الأعضاء والأنسجة من الذبابة مثل أقراص التصوير1،2، الدماغ اليرقات3،4،5،6، أو غرف البيض من الإناث البالغات7،8،9، أو الأمعاء البالغة10 على سبيل المثال وأبقى في الثقافة للتصوير بالمنظار الدقيق الفاصل زمنيا. يتمثل أحد التحديات الرئيسية للتصوير الحي في ضمان إبقاء العينة قريبة من سطح التصوير للحصول على الدقة المثلى وغير متحركة دون المساس بسلامة العينة التي يمكن أن تكون حساسة للتأثيرات الميكانيكية. لدراسة الخلايا الجذعية العصبية ، وتسمى الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية في الدماغ اليرقات Drosophila ، على سبيل المثال ، يمكن تحقيق إبقاء عينات قريبة من سطح التصوير من خلال تغطيتها مع وسائل الإعلام الثقافية في غرف التصوير مختومة11،12،13. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يسمح بسهولة تبادل وسائل الإعلام مما يحد من المجال التجريبي للمناورة. بدلا من ذلك، يمكن إعداد العينات ووضعها على coverlips تعامل لزيادة التصاق الخلايا والسماح متعددة النقاط زيارة المجهر والتصوير الموسع للخلايا الحية في أطباق الثقافة المفتوحة، التي يحتمل أن تسمح تبادل وسائل الإعلام، ولكن لا توفر وسيلة سهلة لمنع الانجراف عينة أو فقدان خلال تبادل وسائل الإعلام14،15.
طريقة جلطة فيبرين وضعت أصلا لدراسة الخلايا المنوية الحية رافعة ذبابة16 مناسبة خصيصا للتغلب على هذه المشاكل. يذوب الفيبرينوجين في وسط الثقافة ذات الصلة ، ويتم وضع العينات وتوجيهها في قطرة من هذا المحلول على غرفة تصوير كافية على السطح الزجاجي قبل إضافة Thrombin ، مما يؤدي إلى تكوين سريع لجلطة فيبرين غير قابلة للذوبان ، وهي شبكة ليفية لزجة تلتزم بالسطح الزجاجي والعينات مع ضمان وصول العينة إلى وسيط الثقافة. ويمكن بعد ذلك تبادل الوسط دون اضطراب وضع الجلطة أو العينة. تبادل الثقافة المتوسطة أثناء التصوير هو، على سبيل المثال، مرغوب فيه عندما يتم إضافة مثبطات كما هو الحال في الطريقة الأصلية أو لغسل أو نبض مطاردة التجارب أو عندما الأصباغ الفلورية هي أن تضاف أثناء تصوير الخلايا الحية مع الحفاظ على الخلايا والأنسجة في مكانها. جلطات الفيبرين مناسبة لتصوير أنسجة الدروزوفيلا وكذلك الخلايا الفردية13،17. يمكن استخدام جلطات الفيبرين كذلك للمساعدة في توجيه العينات ، وذلك بسبب شكلها أو خصائص أخرى عادة لا تكون موجهة بالطريقة المطلوبة عن طريق تعديل موضع العينة داخل جلطة فيبرين وشكل الجلطة نفسها.
هنا نقدم تحديثا على أساليب التصوير الحالية القائمة على تجلط فيبرين وتوفير أدوات لتحليل الصور القائمة على التقسيم والتركيز على استخدام هذه الطريقة لدراسة الانقسامات الأرومية العصبية في الدماغ ذبابة النامية. نحن نستخدم بشكل روتيني طريقة جلطة فيبرين لمتابعة عينات متعددة في جلطات مختلفة في نفس طبق الثقافة. وهذا يسمح 1) تصوير الأحداث دون الخلوية مثل السلوك المركزي أو توطين ميرنا يعيش18،19، 2) رصد سلوك العينات على العلاج الدوائي من الأنماط الجينية المختلفة تحت نفس إعدادات التصوير باستخدام زيارة متعددة النقاط المجهر20، 3) دراسة آثار تثبيط حاد من الانزيمات21 و iv) التقليل من الانجراف لدراسة التغيرات في اتجاه انقسام الخلايا داخل بيئتها الفسيولوجية على المستهدفة الليزر الاستئصال22. في حين أن الآثار غير المرغوب فيها من ثروبين وفيبرينوجين وتجلط فيبرين تحتاج إلى اختبار تجريبي لكل عينة، هذه الطريقة هي من حيث المبدأ مناسبة لشل أي نوع من العينة التي سيتم تحليلها عن طريق التصوير بالخلايا الحية وفي Drosophila وقد استخدمت بنجاحلدراسةجوانب متعددة من بيولوجيا الخلايا العصبية 5،19،20، ولكن أيضا ديناميات توقعات cytosensor من الخلايا الجذعية خط الجرثومية الإناث23 والتغيرات في القطبية على تثبيط APKC الحاد للخلايا بصيلات الخلايا الإناث Drosophila 21.
يؤدي التصوير الفلوري الفاصل زمنيا إلى إنشاء مجموعات بيانات ثلاثية الأبعاد معقدة تم حلها زمنيا وتتطلب طرقا لاستخراج هذه المعلومات الكمية. هنا نصف تطورنا الإضافي ل24 ماكرو المستندة إلى ImageJ والتي يمكن استخدامها لتصحيح الانجراف في الهايبرستاكس ووحدات الماكرو ImageJ المصنوعة خصيصا التي تسمح بالكم شبه الآلي للفلورسنس متعدد القنوات في قشرة الخلية التي تم تطويرها لتحديد البروتينات القشرية في الخلايا العصبية لأدمغة يرقات Drosophila أو الخلايا العصبية الفردية في زراعة الخلايا الأولية.
Protocol
1. إعداد الكواشف
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في هذا البروتوكول ما لم يتم شرح خلاف ذلك في درجة حرارة الغرفة.
- لإعداد حل من 1x PBS-BSA (0.1٪ ث / v), حل 1 ملغ من الألبومين المصل البقري (BSA) في 1 مل من برنامج تلفزيوني. لإعداد حل الأسهم من Thrombin 1,000 وحدة·مل-1, حل 1,000 وحدة من Thrombin في 1 مل من PBS-BSA (0.1٪ ث / v). جعل aliquots من 10 ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر.
- لإعداد الوسط الثقافي لأدمغة دروسوفيلا، قم بإذابة 1 غرام من الجلوكوز في 1 لتر من وسط شنايدر في ظروف معقمة. تصفية وتخزين في 4 °C لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- لإعداد محلول فيبرينوجين، حل 10 ملغ من فيبرينوجين في 1 مل من الثقافة المتوسطة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا تم استخدام وسيطة ثقافة مختلفة عن تلك التي تم إعدادها في الخطوة 1.2 وجلطات فيبرين بالفعل في هذه الخطوة، فإن وسيط الثقافة يحتوي على الأرجح Thrombin النشط، والذي يحتاج إلى تعطيل مسبقا. مصدر محتمل للثرومبين هو مصل الأبقار الجنينية، والتي يمكن تعطيلها عن طريق تسخين المصل إلى 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. - لإعداد حل طلاء من PBS-BSA (5٪ ث / v)، حل 50 ملغ من ألبوم مصل البقر (BSA) في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
- على سبيل المثال الكاشف المستخدمة في الخطوة 4، وإعداد حل الأسهم من NAPP1 10 MM عن طريق حل 1 ملغ NAPP1 في 315 ميكرولتر ديميثيل سلفوإكسيد.
2. تشريح أدمغة يرقات دروسوفيلا
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة تحت منظار تشريح.
- استخدم فرشاة لنقل يرقات L3 إلى طبق زجاجي بوروسيليكات 9-well يحتوي على PBS. يحرك لفصل معظم طعام الذبابة عن اليرقات ونقله إلى بئر آخر يحتوي على وسيط ثقافي.
- استخدام ملقط (على سبيل المثال، دومون #55) لفهم يرقة عبر قطرها بالكامل، في منتصف طول جسمها (انظر الشكل 1A، B). أثناء حمل اليرقة ، قم بنقلها إلى بئر آخر من لوحة البوروسيليكات التي تحتوي على 200 ميكرولتر من وسط الثقافة الطازجة.
- لا تطلق اليرقة. لقطع اليرقة إلى نصفين عبر قطرها بالكامل(الشكل 1B)، إما طحن المنطقة الممسكة مع الحركة الجانبية لنصائح ملقط(الشكل 1A، اللوحة العليا) أو الشريحة طرف واحد من زوج آخر من ملقط بين اثنين من نصائح ملقط عقد اليرقة(الشكل 1A، لوحة القاع). لا تقطع اليرقة إلى نصفين عن طريق سحب أحد أطرافها ، لأنها يمكن أن تلحق الضرر بالدماغ عن طريق سحبها عبر الأعصاب التي تعبر طول الجسم (الخطوط الحمراء في الشكل 1B).
- استخدام ملقط لعقد اليرقة من قبل لطيف وزوج آخر من ملقط لتقشير وبصرف النظر عن لطيف دون سحب على الدماغ(الشكل 1C). كرر حتى تكون الأعصاب الناشئة من الدماغ مرئية ويمكن الوصول إلى الأعضاء التي تربط الدماغ بأجزاء الفم كما هو موضح في الشكل 1D.
- استخدام ملقط لعقد الأعصاب الناشئة من الدماغ. مع الزوج الآخر من ملقط, استخدام أي من التقنيات المبينة في الشكل 1A لقطع الاتصال بين الدماغ إلى أجزاء الفم, فصل الدماغ من بقية لطيف (الشكل 1D).
- استخدام ملقط لعقد الدماغ من محاور عصبية الخروج من الحبل العصبي البطني. التقط الأعضاء المصورة باللون الرمادي في الشكل 1E عن طريق سحبها بلطف بعيدا عن الدماغ.
ملاحظة: لا تسحب أقراص العين/الهوائي (الأصفر الداكن) لفصلها عن الدماغ. العلاقة بين هذه الأنسجة قوية جدا بحيث لا يمكن كسرها عن طريق سحب دون الإضرار الدماغ. - في حين لا يزال استيعاب الأعصاب لعقد وتوجيه الدماغ، وفهم العلاقة بين العين / هوائي الأقراص التصويرية (الأصفر الداكن) والدماغ مع الزوج الآخر من ملقط (الشكل 1F). استخدام أي من التقنيات المبينة في الشكل 1A لقطع هذا الاتصال دون سحب على الدماغ. تحقق ما إذا كان الدماغ هو تطهيرها بشكل مناسب من الأنسجة الأخرى (الشكل 1G) وليس معطوبا (الشكل 1H). تجاهل الدماغ إذا كان يظهر علامات الضرر.
- Pipette حل الطلاء مع P20 داخل وخارج لمعطف تلميح ماصة. ماصة الدماغ مع طرف المغلفة جنبا إلى جنب مع 3 ميكرولتر من المتوسطة (الشكل 2A, يسار) وماصة بها في بئر أخرى تحتوي على 200 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة نظيفة.
- كرر الخطوات 2.2-2.8 حتى يتم تشريح ما يكفي من الأدمغة ، واستبدال وسط ثقافة البئر التي يتم فيها تشريحها.
الشكل 1: تشريح أدمغة يرقات D. melanogaster. (أ)تقنية لقطع دون سحب باستخدام ملقط. يمكن قطع العينة (أخضر شاحب) عن طريق الأرض بين نصائح من ملقط (لوحة أعلى) أو عن طريق تشغيل غيض من زوج من تلميح ملقط على طول نصائح من زوج من ملقط عقد العينة (لوحة أسفل). (B–F) خطوات لعزل الدماغ اليرقات دون الإضرار به (انظر النص). الأحمر: الدماغ. أصفر داكن: أقراص العين/الهوائي. النص الأزرق: إجراءات لتنفيذ مع ملقط المقابلة. (G) مظهر الدماغ المعزول مع عدم وجود ضرر مرئي. D هو الجانب الظهري وV هو الجانب البطني على المنظر الجانبي. (H) الأضرار الشائعة الناجمة عن سحب الدماغ بشكل مفرط أثناء تشريح. اللوحة العلوية: انفصال سلك العصب البطني. اللوحة السفلية: تشوه الفص. الخلفي هو اليسار والموظم هو الحق في جميع الألواح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. تعطيل على غطاء مع جلطات فيبرين
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة تحت منظار تشريح.
- استخدام ماصة P20 مع طرف المغلفة كما هو الحال في الخطوة 2.8 لنقل العقول تشريحها إلى بئر آخر من لوحة borosilicate تحتوي على 200 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة + فيبرينوجين (الشكل 2A).
- ماصة في دماغ واحد جنبا إلى جنب مع 9 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة + فيبرينوجين. مع نهاية طرف لمس تقريبا الجزء السفلي غطاء الزجاج من طبق ثقافة الخلية 35 ملم، ماصة من محتويات (ثقافة المتوسطة والدماغ) مما يجعل الثقافة المتوسطة لمسة coverslip مباشرة بعد الخروج من طرف ماصة بحيث الدماغ والمتوسطة لا تنزلق إلى جانبي الطرف، مما قد يضر الدماغ(الشكل 2A).
- استخدام طرف واحد من زوج من ملقط أو زوج مغلق من ملقط لدفع بلطف ووضع الدماغ داخل الثقافة المتوسطة + إسقاط فيبرينوجين.
ملاحظة: لمس قطرة مع زوج مفتوح من ملقط يمكن أن يؤدي إلى ثقافة متوسطة الحصول على سحبها من قبل الشعيرات الدموية بين نصائح ملقط(الشكل 2B). - إذا كان الجزء البطني من الدماغ يجب أن تكون مصورة, حث تخثر الفيبرينوجين على النحو التالي لتوجيه الدماغ بشكل صحيح داخل الجلطة (الشكل 2C).
- دفع الدماغ إلى جانب واحد من قطرة. مع ماصة P1 مجهزة طرف P1، ماصة 1 ميكرولتر من حل Thrombin، لمس حافة قطرة على الجانب الآخر من الدماغ مع طرف ماصة، وماصة من Thrombin (الشكل 2C، الرسم الأول).
- انتظر 1-2 دقيقة لFibrinogen لبدء البلمرة، مما أدى إلى تشكيل عجل غائم في جانب واحد من قطرة (الشكل 2C،الرسم الثاني). دفع بلطف و "الثنية" الدماغ في جلطة فيبرين، والتأكد من أن الجزء إلى صورة (على سبيل المثال، الجانب البطني) هو أقرب ما يمكن إلى coverlip دون تشوه الدماغ(الشكل 2C،الرسم الثالث).
- ماصة من أصل 1 ميكرولتر من محلول الثرومبين على مقربة من جانب الدماغ لا مدسوس في جلطة فيبرين. (الشكل2C، الرسم الرابع).
- انتظر لمدة 2-3 دقائق لتجلط فيبرين الثاني لتعيين (الشكل 2C، الرسم الخامس). اضغط على حواف الجلطة لجعلها تلتصق بقوة أكبر بالأغطية ، مع الحرص على عدم تشوه الدماغ(الشكل 2C، الرسومات السادسة والسابعة). إذا كان الدماغ يبدو بعيدا جدا عن غطاء، جعله أقرب عن طريق الضغط على جلطة فيبرين قريبة من الدماغ.
- إذا كان الجزء الظهري من الدماغ يجب أن تكون مصورة, حث تخثر فيبرين على النحو التالي (الشكل 2D).
- وضع الدماغ في وسط قطرة، الجزء الظهري التي تواجه غطاء. مع ماصة P10 مجهزة طرف رقيقة، ماصة 1 ميكرولتر من حل Thrombin، لمس حافة قطرة على الجانب الآخر من الدماغ مع طرف ماصة، وماصة من Thrombin (الشكل 2D، الرسم الأول).
- انتظر لمدة 2-3 دقائق لFibrinogen لبدء البلمرة، مما أدى إلى تشكيل غائم، عجل ليفي(الشكل 2D،الرسم الثاني). اضغط على حواف الجلطة لجعلها تلتزم بقوة أكبر بالأغطية ، مع الحرص على عدم تشوه الدماغ(الشكل 2D، الرسومات الثالثة والرابعة).
- كرر الخطوات 3.1-3.5 إذا كان يجب تجميد عدة عينات من الجلطة على غطاء الغطاء.
- مع نهاية الطرف وضعه حوالي 0.5 سم فوق جلطة (ق)، ماصة بلطف 390 ميكرولتر من المتوسطة الثقافة دون دروبوايز فيبرينوجين على رأس الجلطة (ق) (الشكل 2B،طبق بيتري الحق). لا تقم بإضافة وسيط الثقافة على جانبي الجلطة لأنها قد تفصلها عن الغطاء.
- لغسل Thrombin المتبقية، استخدم ماصة لإزالة 300 ميكرولتر من وسط الثقافة وإضافة 300 ميكرولتر من وسط الثقافة النظيفة، مع التأكد من أن الجلطات تبقى مغمورة بالكامل. كرر مرتين لغسل Thrombin الزائدة.
الشكل 2: تعطيل دماغ يرقات الدروزوفيلا باستخدام جلطات فيبرين. (أ) باستخدام طرف ماصة مغلفة ب BSA ، يتم نقل العقول من وسيط الثقافة (الأصفر) إلى وسط ثقافي + محلول فيبرينوجين (برتقالي) ، ثم يتم غليه على غطاء (أزرق فاتح) لطبق ثقافة جنبا إلى جنب مع 3.5 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة + فيبرينوجين. يتم تحريض تخثر الفيبرينوجين بإضافة Thrombin إلى شل حركة الأدمغة في وضع الظهر أو البطين (انظر D و E). وتغطي العقول المضمونة في الجلطات في وقت لاحق في وسط الثقافة دون فيبرينوجين ويتم إزالة الثرومبين الزائد عن طريق إضافة وإزالة الثقافة المتوسطة ثلاث مرات. (ب)يجب تعديل وضع الدماغ داخل قطرة من الثقافة المتوسطة + فيبرينوجين (البرتقالي) على غطاء فقط عن طريق دفع بلطف مع غيض من زوج مغلق من ملقط، أو تلميح ملقط واحد فقط. لمس قطرة مع على زوج مفتوح من ملقط يمكن أن يؤدي إلى الحصول على المتوسطة الثقافة التي سحبتها الشعيرات الدموية بين نصائح من ملقط. (ج)خطوات لتحديد موضع دماغ اليرقات لتصوير الجانب البطني (انظر النص). (D) خطوات لتحديد موقع دماغ اليرقات لتصوير الجانب الظهري (انظر النص). في (D) و (E), أخضر: ثروبين. البرتقالي الداكن: جلطة فيبرين. أزرق شاحب: غطاء. الأسهم الزرقاء: حواف الجلطة التي سيتم دفعها ضد غطاء لتثبيت الجلطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. إضافة الكواشف أثناء التصوير الحي
- لتجنب التغيرات في درجة الحرارة التي تسبب تغييرات في التركيز، والحفاظ على الحل مع الكواشف لإضافتها إلى طبق الثقافة في نفس درجة حرارة طبق الثقافة نفسها لتحقيق ذلك إلى نفس درجة الحرارة قبل إضافته. إذا تم استخدام غرفة بيئية، اترك الحل داخل الغرفة.
- إزالة غطاء طبق الثقافة دون تشريد طبق الثقافة نفسها. لإزالة أسهل، ضع غطاء الطبق 35 مم رأسا على عقب على أعلى الطبق قبل التصوير.
- مع ماصة P1000، ضع طرف ماصة بالقرب من سطح وسط الثقافة داخل طبق الثقافة وحرر بلطف الحجم الكافي من محلول الكاشف عليه للوصول إلى تركيز الكاشف المطلوب (على سبيل المثال، 400 ميكرولتر من محلول 20 μM NAPP1 على 400 ميكرولتر من متوسط الثقافة لتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر NAPP1) ، دون توليد تدفقات قوية يمكن فصل الجلطات.
- لتجانس الحل داخل طبق الثقافة، استخدم ماصة P200 لأنابيب ببطء كمية صغيرة من الحل داخل وخارج خمس مرات (على سبيل المثال، 150 ميكرولتر لحجم 800 ميكرولتر داخل الطبق).
- استبدل الغطاء فوق طبق الثقافة دون إزاحة طبق الثقافة نفسه واستأنف التصوير.
5. غسل الكواشف أثناء التصوير الحي
- قبل الاغتسال، حافظ على محلول الغسيل في نفس درجة حرارة طبق الثقافة.
- إزالة غطاء طبق الثقافة دون تشريد طبق الثقافة نفسها.
- مع ماصة P200 أو P1000 ، قم بإزالة بعض الوسائط الثقافية ببطء من طبق الثقافة دون تعريض الجزء العلوي من الجلطة (على سبيل المثال ، إزالة 600 ميكرولتر من 800 ميكرولتر من وسط الثقافة داخل الطبق).
- لتمييع الكاشف ، مع ماصة P1000 ، ضع طرف المصة بالقرب من سطح وسيط الثقافة داخل طبق الثقافة وحرر محلول الغسيل ببطء (على سبيل المثال ، أضف 1 مل من محلول الغسيل إلى 200 ميكرولتر من متوسط الثقافة المتبقي داخل الطبق لعامل تخفيف 6).
- كرر الخطوتين 5.3 و 5.4 حتى يتم تخفيف الكاشف كما هو مطلوب (على سبيل المثال، ثلاث جولات أخرى مماثلة ستؤدي إلى عامل تخفيف 1296، مما يقلل من التركيز الأولي من 10 ميكرومتر NAPP1 إلى 7.7 مليون متر).
- استبدل الغطاء فوق طبق الثقافة دون إزاحة طبق الثقافة نفسه واستأنف التصوير.
6. تصحيح xyz الانجراف على ثلاثي الأبعاد و / أو متعدد القنوات الزمنية الهفوات
- اعداد
- تحميل وتثبيت ImageJ24. تحميل TurboReg25 و MultiStackReg26 الإضافات ووضعها داخل مجلد الإضافات من ImageJ.
- تحميل MultiHyperStackReg (ملف الترميز التكميلي 1) ووحدات الماكرو AutoHyperStackReg ImageJ (ملف الترميز التكميلي 2). لتثبيت ماكرو، إما وضع الملف .ijm داخل مجلد الإضافات من ImageJ أو إضافة محتويات ملف .ijm إلى ملف ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
- على ImageJ، فتح فيلم الفاصل الزمني بما في ذلك عدة شرائح و / أو عدة قنوات (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم "hyperstack"، الشكل 3A،4A). إذا كان الفاصل الزمني يتضمن شريحة واحدة وقناة واحدة فقط، يمكن تنفيذ المحاذاة مباشرة باستخدام MultiStackReg.
- تصحيح الانجراف الجانبي باستخدام MultiHyperStackReg
- حدد القناة و/أو الشريحة التي يجب استخدامها كمرجع للمحاذاة. لإنشاء مكدس مرجعي من قناة واحدة وشريحة واحدة (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم "المكدس المرجعي")، انقر على Image | مكررة...، وضع علامة على مربع الاختيار تكرار hyperstack ، اكتب رقم القناة ذات الصلة في القنوات (ج) : (على سبيل المثال ، استبدال 1-2 مع 1)و / أو رقم القناة ذات الصلة في شرائح (ض) : (على سبيل المثال ، استبدال 1-15 مع 8)، وضمان أن الإطارات : (ر) يشمل جميع الإطارات (على سبيل المثال ، 1-50)قبل النقر على موافق (الشكل 3B).
- بدلا من الخطوة 6.2.1، إذا تم تفضيل إسقاط شرائح متعددة للكدسة المرجعية ذات القناة الواحدة والشريحة الواحدة، فانقر على Image | مكدسات | Z Project...، حدد الشرائح الأولى والأخيرة ونوع الإسقاط ، وتأكد من وضع علامة على جميع الأطر الزمنية والنقر فوق موافق. إذا كان الفاصل الزمني يحتوي على قنوات متعددة إما حذف القنوات غير ذات الصلة (صورة | مكدسات | حذف شريحة) من الإسقاط الناتج أو تكرار القناة المرجعية المختارة (صورة | مكررة) (الشكل 3B).
- اختياريا، قم باقتصاص مكدس المرجع لاستخدام جزء واحد فقط كصورة كمرجع عن طريق تحديد أداة المستطيل في شريط الأدوات، وتتبع مستطيل فوق منطقة الاهتمام، والنقر على صورة | المحاصيل.
- لبدء MultiStackReg، انقر على الإضافات | | التسجيل متعددةستاكريج. في القائمة المنبثقة Stack 1:، حدد اسم المكدس ذو القناة الواحدة والشريحة الواحدة الذي تم إنشاؤه في الخطوات السابقة. في القائمة المنبثقة تحويل:، حدد الترجمة؛ حدد خانة الاختيار حفظ ملف التحويل وتجاهل كافة الحقول الأخرى.
ملاحظة: أنواع أخرى من التحويل (انظر25). - انقر على موافق. حدد موقعا واسما لحفظ ملف المحاذاة وانقر على حفظ. في إطار المكدس المرجعي، انتظر حتى تتوقف الإطارات عن الحركة تلقائيا، مع الإشارة إلى أن التسجيل قد انتهى (الشكل 3B).
- تحقق من المكدس المرجعي لمعرفة ما إذا كانت المحاذاة مرضية أم لا. إذا لم يكن الأمر كذلك، كرر الخطوات 6.2.1-6.2.5 مع شريحة مرجعية مختلفة وقناة و/أو اقتصاص. أغلق مكدس المرجع.
- حدد الإطار hyperstack وتشغيل الماكرو MultiHyperStackReg. حدد ملف التحويل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.2.5 وانقر على فتح. انتظر حتى يتم تطبيق المحاذاة على كل قناة و / أو شريحة من hyperstack ، وعند هذه النقطة سيتم فتح نافذة جديدة مع لاحقة "_aligned" (الشكل 3C).
- تصحيح انجراف التركيز باستخدام MultiHyperStackReg
- انقر على | الصور خصائص...، نسخ القيمة المعروضة في عرض بكسل. لإعادة تشريح الهايبرستاك ذو القناة الواحدة بشكل متعامد مع تباعد بكسل واحد، انقر على صورة | مكدسات | إعادة نسخ [/]...، لصق قيمة عرض البكسل في "تباعد الإخراج": حقل رقمي; حدد أعلى في القائمة ابدأ في: المنبثقة، القراد تجنب الاستيفاء وانقر على موافق.
ملاحظة: في حالة وجود ذاكرة يجب تحريرها على ImageJ، يمكن إغلاق hyperstack بعد reslice. - حدد النافذة الجديدة التي تم إنشاؤها بواسطة reslice (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم "hyperstack resliced" ، الشكل 4B). إذا كان لدى hyperstack resliced قنوات متعددة، حدد قناة مرجعية لتنفيذ المحاذاة وحذف القنوات الأخرى عن طريق تحديدها في شريط تمرير القناة. انقر على | الصور مكدسات | حذف شريحة، حدد القناة في القائمة المنبثقة حذف الحالي وانقر على موافق.
- إنشاء hyperstack شريحة واحدة resliced (من الآن فصاعدا يشار إليها باسم "مكدس مرجع resliced") ، إما عن طريق تكرار شريحة واحدة من hyperstack resliced (انظر الخطوة 6.2.1) أو عن طريق إسقاط عدة شرائح من hyperstack resliced (انظر الخطوة 6.2.2) (الشكل 4C).
- بشكل اختياري، اقتصاص مكدس مرجع resliced لاستخدام جزء واحد فقط كصورة كمرجع (راجع الخطوة 6.2.3).
- تنفيذ تسجيل الصورة على المكدس مرجع resliced مع MutiStackReg (انظر الخطوات 6.2.4-6.2.6) (الشكل 4C).
- حدد الإطار hyperstack resliced وتشغيل الماكرو MultiHyperStackReg. حدد ملف التحويل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.3.5، انقر فوق فتح وانتظر حتى يتم تطبيق المحاذاة على كل قناة و/أو شريحة من الهايبرستاك، وعند هذه النقطة سيتم فتح نافذة جديدة مع لاحقة "_aligned" (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم "مكدس مرجع إعادة تقطيعها"، الشكل 4D). إغلاق hyperstack الأصلي resliced.
- لتحويل hyperstack محاذاة resliced إلى طريقة العرض xy من hyperstack الأصلي انقر فوق مكدسات | Reslice [/]...، حدد الأعلى في القائمة ابدأ في: المنبثقة، وضع علامة تجنب الاستيفاء وانقر على موافق. مرة واحدة في نافذة جديدة مع التركيز النهائي محاذاة hyperstack يفتح (الشكل 4E) ، وإغلاق hyperstack محاذاة resliced.
- انقر على | الصور خصائص...، نسخ القيمة المعروضة في عرض بكسل. لإعادة تشريح الهايبرستاك ذو القناة الواحدة بشكل متعامد مع تباعد بكسل واحد، انقر على صورة | مكدسات | إعادة نسخ [/]...، لصق قيمة عرض البكسل في "تباعد الإخراج": حقل رقمي; حدد أعلى في القائمة ابدأ في: المنبثقة، القراد تجنب الاستيفاء وانقر على موافق.
- لتصحيح الانجراف الجانبي والتركيز الانجراف تلقائيا، قم بتشغيل الماكرو AutoHyperStackReg. حدد القناة المرجعية، إذا كان ذلك ممكنا، وما إذا كان يجب تصحيح الانحراف الجانبي و/أو التركيز البؤري. انقر على موافق.
الشكل 3: خط أنابيب لتصحيح الانجراف الجانبي مع MultiHyperstackReg. (أ)يمكن ملاحظة الانجرافات الجانبية والتركيز على الهايبرستاك التي تحتوي على عدة شرائح ونقاط زمنية. (ب)يتم إنشاء شريحة واحدة، مكدس مرجع قناة واحدة من hyperstack، إما عن طريق الازدواجية أو الإسقاط Z. يتم محاذاة المكدس مرجع بواسطة البرنامج المساعد MultiStackReg، إنشاء ملف محاذاة. (C) يتم استخدام الماكرو MultiHyperstackReg لتطبيق ملف المحاذاة إلى hyperstack، مما يؤدي إلى hyperstack محاذاة التي يتم تصحيح الانجراف الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: خط أنابيب لتصحيح الانجراف التركيز مع MultiHyperstackReg. (أ)يمكن ملاحظة التركيز الانجرافات على hyperstack تحتوي على عدة شرائح ونقاط زمنية. (ب)يتم إعادة تشريح الهايبرستاك بشكل متعامد من الأعلى، على طول كل سطر من وحدات البكسل على طول محور Y، دون الاستيفاء. يؤدي هذا إلى hyperstack resliced يحتوي على نفس المعلومات مثل hyperstack مع إحداثيات y و z الخاصة به تبديل. التركيز الانجراف (في ض) من hyperstack الأصلي يحدث كما الانجراف في y على hyperstack resliced. (C) يتم إنشاء شريحة واحدة، مكدس مرجع مقطعة قناة واحدة من hyperstack resliced، إما عن طريق الازدواجية أو الإسقاط Z. تتم محاذاة مكدس المرجع الذي تم إعادة تقطيعه بواسطة المكون الإضافي MultiStackReg، مما ينشئ ملف محاذاة. (D) يتم استخدام الماكرو MultiHyperstackReg لتطبيق ملف المحاذاة إلى hyperstack resliced، مما يؤدي إلى hyperstack محاذاة resliced التي يتم تصحيح الانجراف التركيز (في y). (ه)يعيد إعادة تشريح متعامد ثان الإحداثيات الأصلية للهاي hyperstack ، والتي لم تعد تقدم الآن انجراف التركيز (في z). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
7. قياس إشارة القشرية مع linescans الدورية
- تحميل الماكرو التناوب Linescans ImageJ (ملف الترميز التكميلي 3).
- افتح الفاصل الزمني في ImageJ. ضع شريط تمرير الإطارات إلى الإطار الأول، وفي حالة احتواء الفاصل الزمني على عدة شرائح، ضع شريط تمرير الشرائح إلى الشريحة التي سيتم قياس الإشارة عليها.
- وضع التتبع
- حدد أداة الخط المستقيم في شريط الأدوات. تتبع خط عبر المنطقة القشرية ليتم قياسها (الشكل 5A)، مع التأكد من أن الخط عمودي تقريبا على القشرة وأن الخط طويل بما يكفي لعبور القشرة في كل نقطة في المرة القادمة (الشكل 5B، اللوحة الأولى والثانية).
- انقر نقرا مزدوجا فوق رمز أداة سطر في شريط الأدوات لفتح إطار "عرض الخط". زيادة عرض الخط بقدر ما يلزم مع الحفاظ على التقاطع بين الخط والقشرة خط مستقيم (الشكل 5B، اللوحة الثالثة).
- بدء تشغيل الماكرو Linescans الدورية. تعيين نطاق الدوران(الشكل 5E)إلى قيمة منخفضة (حوالي 10°) إذا كان اتجاه المنطقة القشرية التي سيتم قياسها لا يتغير كثيرا من نقطة زمنية واحدة إلى أخرى. قم بتعيين قيمة القياس حول إلى 0 بكسل لقياس الإشارة على الخط فقط حيث يتم الكشف عن كثافة الإشارة القصوى، أو إلى قيم أعلى لقياس الإشارة حول هذا الخط أيضا.
ملاحظة: تؤثر قيمة القياس حول قياس الإشارة فقط بعد الكشف عن القشرة ولن تؤثر على الكشف نفسه. - في قائمة البحث عن القشرة على القناة: القائمة المنبثقة، حدد القناة التي سيتم إجراء الكشف عليها. لتصور مكان اكتشاف القشرة في كل نقطة زمنية، حافظ على وضع علامة على موضع العرض... إبقاء أحدث وإعادة توجيه... مربع الاختيار تكتك. انقر على موافق.
- بمجرد أن يتم عرض النتائج المنسوخة إلى الحافظة في حالة إطار ImageJ ، مرر خلال الفاصل الزمني للتحقق مما إذا كانت موضع القشرة المكتشفة (التراكب الأصفر) والمنطقة المقاسة (تراكب سماوي) مرضية. إذا لم يكن الأمر كذلك، كرر الخطوات 7.3.1-7.3.4 مع موضع خط مختلف أو طول أو عرض وإعدادات مختلفة في إطار خيارات اركان الخطوط الدوارة.
- لصق القياسات في برنامج جدول بيانات.
ملاحظة: تتوافق الأعمدة مع القنوات بترتيب مظهرها في الفاصل الزمني وتتوافق الخطوط مع الإطارات.
- وضع عدم التتبع
- حدد أداة الخط المستقيم في شريط الأدوات. تتبع خط (المشار إليها في سماوي، الشكل 5A) عبر المنطقة القشرية ليتم قياسها، والتأكد من أن الخط عمودي تقريبا على القشرة وأن الخط طويل بما يكفي لعبور القشرة في كل نقطة زمنية (الشكل 5C، اللوحة الأولى والثانية).
- انقر نقرا مزدوجا فوق رمز أداة الخط في شريط الأدوات لفتح إطار عرض الخط. زيادة عرض الخط بقدر ما يلزم مع الحفاظ على تقاطع بين الخط والقشرة خط مستقيم (الشكل 5C، اللوحة الثالثة).
- بدء تشغيل الماكرو Linescans الدورية. تعيين نطاق الدوران(الشكل 5E)وفقا للتغيرات في اتجاه المنطقة القشرية ليتم قياسها في جميع أنحاء الفاصل الزمني بأكمله. قم بتعيين قيمة القياس حول إلى 0 بكسل لقياس الإشارة على الخط فقط حيث يتم الكشف عن كثافة الإشارة القصوى، أو إلى قيم أعلى لقياس الإشارة حول هذا الخط أيضا.
ملاحظة: تؤثر قيمة القياس حول قياس الإشارة فقط بعد الكشف عن القشرة ولن تؤثر على الكشف نفسه. - في قائمة البحث عن القشرة على القناة: القائمة المنبثقة، حدد القناة التي سيتم إجراء الكشف عليها. لتصور مكان اكتشاف القشرة في كل نقطة زمنية، حافظ على وضع علامة على موضع العرض... إلغاء تحديد خانة الاختيار أحدث وإعادة توجيه... انقر على موافق.
- بمجرد الانتهاء، يتم عرض النتائج المنسوخة إلى الحافظة في حالة نافذة ImageJ، قم بالتمرير خلال الفاصل الزمني للتحقق مما إذا كانت مواقع القشرة المكتشفة (التراكب الأصفر) والمنطقة المقاسة (تراكب سماوي) مرضية. إذا لم يكن الأمر كذلك، كرر الخطوات السابقة باستخدام موضع خط مختلف أو طول أو عرض وإعدادات مختلفة في إطار خيارات "تدوير خطوط".
- لصق القياسات في برنامج جدول بيانات.
ملاحظة: تتوافق الأعمدة مع القنوات بترتيب مظهرها في الفاصل الزمني وتتوافق الخطوط مع الإطارات.
الشكل 5: قياس الإشارة القشرية مع خطوط دوارةكان. (أ)يتم تتبع خط (سماوي) عموديا إلى القشرة (أسود) حيث سيتم قياس الإشارة. تظهر ظلال رمادية مختلفة تغيير موضع الخلية على ثلاث نقاط زمنية (t1, t2, t3). (ب) اليسار: تحديد المواقع الصحيح للخط في وضع التتبع. الوسط: تحديد المواقع غير الصحيح للخط في وضع التتبع حيث لا يوجد تداخل مع القشرة في النقطة الزمنية التالية. اليمين: خط واسع بشكل مفرط مما يؤدي إلى تقاطع (خط برتقالي) بين القشرة والخط لا يجري على التوالي. (C) اليسار: تحديد المواقع الصحيح للخط في وضع عدم التعقب. الوسط: تحديد المواقع غير الصحيح للخط في وضع عدم التتبع حيث لا يوجد تداخل مع القشرة في كل نقطة زمنية. اليمين: خط واسع بشكل مفرط مما يؤدي إلى تقاطع (خط برتقالي) بين القشرة والخط لا يجري على التوالي. (D) طول وعرض خط المسح الضوئي. (ه)يتم تنفيذ Linescans ضمن نطاق من الاتجاهات حول الاتجاه الأصلي هو مبين في (D) المعرفة من قبل المعلمة "نطاق الاستدارة" ، في فترة زمنية محددة من قبل المعلمة "خطوة الاستدارة". (F)التوجه غير الأمثل لخط المسح الضوئي بالنسبة إلى القشرة ، مما أدى إلى إشارة منخفضة تقاس على طول الخط. (G)يتم تعريف الاتجاه الأمثل للخط بأنه واحد مما أدى إلى أعلى ذروة كثافة إشارة تقاس على طول الخط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
تعطيل أنسجة دروسوفيلا مع جلطات فيبرين وتبادل متوسط الثقافة أثناء التصوير الحي.
بعد تشريحها بعد الإجراء المقدم في الخطوة 2(الشكل 1)وشل حركتها في جلطات فيبرين على نفس الغطاء بعد الإجراء المقدم في الخطوة 3 (الشكل 2) ، تم تصوير أدمغة اليرقات التي تعبر عن بازوكا الموسومة ب GFP (Baz::GFP) ، وتقويم ذبابة بروتين القطبية Par-3 ، لمدة 30 دقيقة في التصوير confocaling متعدد المواضع. Baz::GFP هو جنبا إلى جنب مع APKCas4, أليل التي تسمح تثبيط الحادة من بروتين غير نمطي كيناز C (APKC) من خلال إضافة ATP التناظرية الصغيرة 1-NAPP120. 1-NAPP1 ولذلك أضيف إلى ثقافة المتوسطة بعد الإجراء المقدم في الخطوة 4 واستؤنف التصوير الحي لمدة 2.5 ساعة. السيطرة على العقول التي تحمل نسخة من نوع البرية من aPKC كيناز لم تتفاعل مع التناظرية ATP، في حين أن العقول تحمل بالإضافة إلى طفرة التناظرية الحساسة من aPKC (APKCas4) عرض انكماش الظهارة العصبية ومجموعات مشرقة من الباز في الخلايا العصبية وذرية بهم ( الشكل6، فيديو 1). تستمر الخلايا العصبية في الانقسام طوال الفاصل الزمني ، مما يشير إلى أن الأنسجة لا تزال صحية ، وتظهر الأدمغة القليل من الانجراف على الرغم من التغير المتوسط للثقافة ، مما يشير إلى أنها مشلولة بشكل جيد. وبالمثل، بعد تشريحها بعد الإجراء المقدم في27، ovarioles التعبير عن باز::تم شل حركة GFP في جلطات فيبرين على نفس coverslip وصورت لمدة 8 دقائق، وبعد ذلك تطبيق 1-NAPP1 تسبب تقلص الخلايا الجريبية APKCas4 متحولة ولكن ليس من الضوابط (الشكل 7، فيديو 2).
تصحيح الانجراف الجانبي والتركيز باستخدام MultiHyperstackReg.
A hyperstack عرض الانجراف الجانبي والتركيز على حد سواء(فيديو 3, لوحة اليسار) تم تصحيحها لأول مرة للانجراف الجانبي (الخطوة 6.2, الشكل 3, فيديو 3, لوحة الأوسط), ثم التركيز الانجراف (الخطوة 6.3, الشكل 4, فيديو 3, لوحة الحق) باستخدام البرنامج المساعد MultiStackReg والكلية MultiHyperstackReg, مما أدى إلى انخفاض كبير في الحركات التي لوحظت في hyperstack الأصلي.
قياس الإشارات القشرية باستخدام اركان الخطوط الدوارة
تم تصوير الأرومة العصبية التي تعبر عن باز::GFP (الأخضر) وبروتين ترانسميمبران CD4 الموسوم ببروتين فلوري بالأشعة تحت الحمراء (CD4::mIFP، أحمر) خلال ميتوسيس واحد. تم استخدام إشارة CD4::mIFP كمرجع للكشف عن القشرة في أجزاء مختلفة من الأرومة العصبية مع البقان (الخطوة 7، الشكل 5، الشكل 8A-C)وتم قياس إشارة Baz::GFP في المواقع المكتشفة الشكل 8D). خلال تقسيمها ، استقطبت الخلايا العصبية بشكل عابر من خلال إنشاء مجالات قشرية متميزة ومضاكسة: القطب apical والقطب القاعدي. الباز يحدد القطب apical و, باستمرار, الباز::GFP إشارة زيادة في القطب apical من neuroblast وانخفض في القطب القاعدي خلال الانقسام (الشكل 8C,D). تم تتبع موقف القشرة بشكل مرض طوال الفاصل الزمني (الشكل 8C، فيديو 4). خطوط Drosophila والأنماط الجينية المشار إليها في الجدول التكميلي 1-2.
الشكل 6: تطبيق تناظرية ATP على أدمغة اليرقات المشلولة أثناء التصوير الحي. (أ)التصوير الحي لأدمغة يرقات اثنين تعبر عن Baz::GFP معطلة على نفس الغطاء. يتم تغيير وسيط الثقافة إلى تركيز 10 ميكرومتر من ATP التناظرية 1-NAPP1 في 0 دقيقة. السيطرة على العقول لا تتفاعل بشكل واضح لATP التناظرية في حين أن العقول تحمل طفرة حساسة التناظرية من APKC(APKCAS4)عرض انكماش الظهارة العصبية (رؤوس الأسهم) ومجموعات مشرقة من الباز في الخلايا العصبية ذريتها. الحد الأقصى لشدة الإسقاط من 33 شرائح لعمق 23 ميكرومتر. شريط مقياس: 20 ميكرومتر (ب) تكبير الظهارة العصبية. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تطبيق التناظرية ATP على غرف البيض معطلة أثناء التصوير الحي. التصوير الحي لاثنين من ovarioles التعبير عن باز::GFP شلت على نفس coverslip. يتم تغيير وسيط الثقافة إلى تركيز 10 ميكرومتر من ATP التناظرية 1-NAPP1 في 0 دقيقة. غرف البيض التحكم لا تتفاعل بشكل واضح مع التناظرية ATP في حين أن غرف البيض تحمل طفرة حساسة التناظرية من aPKC (aPKCAS4) عرض انكماش الظهارة (رؤوس الأسهم) مما يؤدي في نهاية المطاف إلى انهيار واضح من تقاطعات adherens. أقصى كثافة الإسقاط من 33 شرائح لعمق 27 ميكرومتر شريط مقياس: 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: قياس الإشارة القشرية باستخدام الخطوط الدوارة. (أ)لايف D. melanogaster neuroblast التعبير عن باز::GFP (الأخضر) وCD4::mIFP (أحمر). خطوط سماوية: خطوط المسح الأولي تتبع عموديا إلى مناطق القشرية المختلفة لقياس. شريط المقياس: 5 ميكرومتر (ب) تحديد القشرة (الخط الأزرق الداكن) باستخدام الخطوط القشرية وCD4::mIFP (أحمر) كقناة مرجعية. خط سماوي: المنطقة المحددة بواسطة المعلمة "قياس حول" (هنا، 2 بكسل)، حيث يتم قياس الإشارة بعد الكشف عن القشرة. شريط المقياس: 2 ميكرومتر (C) سماوي: المناطق القشرية التي تم تحديدها أثناء تقسيم الأرومة العصبية بواسطة طريقة الخطوط الدوارة من خطوط المسح الأولية المعروضة في (A)، باستخدام CD4:mIFP (أحمر) كقناة مرجعية. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. السهم: القطب apical. رأس السهم: القطب القاعدي. (D) قياس Baz::GFP شدة الإشارة مع مرور الوقت في المنطقتين المقابلة التي حددتها linescans الدورية المعروضة في (C). خلال الانقسام، Baz::GFP يحصل على إثراء عابر في القطب apical من الأرومة العصبية واستنفدت من القطب القاعدي المعاكس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: تطبيق تبادل الوسائط على أدمغة اليرقات المشلول أثناء التصوير الحي لإضافة مثبط ، معروض في الشكل 6، شريط المقياس: 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: تطبيق تبادل الوسائط على غرف البيض المشلوم أثناء التصوير الحي لإضافة مثبط ، معروض في الشكل 7، شريط المقياس: 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 3: تصحيح الانجراف الجانبي والتركيز باستخدام MultiHyperStackReg. التصوير الحي لخلايا الأرومة العصبية التي تعبر عن مسبار الغشاء PH::GFP. Xy: مستوى بؤري واحد. Xz: إعادة تشريح متعامدة. إلى اليسار: قبل تصحيح الانجراف. الوسط: بعد تصحيح الانجراف الجانبي. الحق: بعد التصحيح الانجراف الجانبي والتركيز، شريط مقياس: 10 μm. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 4: الكشف عن القشرة باستخدام linescans الدورية، المقدمة في الشكل 8،شريط مقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
الجدول التكميلي 1: الأنماط الجينية لأنسجة دروسوفيلا المصورة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول التكميلي 2: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
ملف الترميز التكميلي 1: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 2: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 3: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
يوفر التصوير الحي لأدمغة يرقات جبل D. melanogaster الكامل الفرصة لمراقبة انقسامات الخلايا الجذعية العصبية غير المتماثلة في ظروف قريبة من السياق الفسيولوجي. يقدم الجزء الأول من بروتوكولنا نهجنا بشأن تشريح أدمغة اليرقات. كما ذكر بالفعل13, جانب حاسم من التحضير هو تجنب الإضرار الدماغ. الجانب الأكثر تحديا من هذا هو فصل الدماغ من الأقراص التصويرية المجاورة دون سحب مفرط على الدماغ. نهجنا ل "قطع دون سحب" هو أداء إما حركة طحن مع نصائح من زوج واحد من ملقط، أو الشريحة نصائح ملقط على طول اثنين من النصائح ملقط أخرى عقد العلاقة بين الأنسجة(الشكل 1A)في حين أن ليريت وآخرون وصف حركات تشبه المنشار مع دبوس تشريح. ننصح المجرب بتجربة جميع النهج واعتماد النهج الأنسب لأنفسهم. نقترح أيضا استخدام نصائح ماصة مغلفة ب BSA أو FCS بدلا من أدوات التشريح لنقل الأدمغة المعزولة. يمنع الطلاء الأنسجة من الالتصاق بالبلاستيك ويسمح بالانتقال الآمن للأنسجة مع إبقائها دائما مغمورة تماما ، دون تعريضها لتشوه عابر محتمل لأنها تلتزم أداة التشريح أثناء النقل. نصائح مغلفة لها مزايا أخرى للسماح بنقل العديد من العقول في وقت واحد، وهو أمر مفيد بشكل خاص عندما يكون من الأهمية بمكان للسيطرة على وقت الإقامة من العينات داخل وسيلة معينة؛ فهي مناسبة لنقل الأنسجة الأخرى، حتى تلك الهشة مثل، على سبيل المثال، الأجسام الدهنية. أنها يمكن أن تستوعب مجموعة واسعة من أحجام عينة مختلفة باستخدام نصائح أكبر أو قطع أقصى الطرف.
بعد ذلك ، يصف هذا البروتوكول استخدام تخثر الفيبرينوجين لشل حركة أدمغة اليرقات على غطاء طبق الثقافة. يتم توجيه الدماغ داخل قطرة من الثقافة المتوسطة + فيبرينوجين، وبعد ذلك يتم تحفيز التخثر عن طريق إضافة Thrombin. تشكيل الفيبرين تدريجيا ، مما يوفر نافذة زمنية يمكن خلالها ضبط اتجاه العينة ، إذا لزم الأمر(الشكل 2C). إذا كان هناك حاجة إلى ضغط طفيف للعينة - وهو ما ننصح بعدمه في حالة أدمغة اليرقات - يمكن أيضا تعديله بدقة عن طريق الضغط على الجلطة بشكل أو بآخر بالقرب من العينة خلال الخطوتين 3.4.4 و 3.5.2. الميزة الرئيسية لهذا تخثر الفيبرينوجين على البروتوكول الموصوف في Lerit وآخرون ، والتي يتم فيها تركيب الأدمغة بين غشاء نفاذية للغاز وأغطية ، هي القدرة على استبدال وسيط الثقافة أثناء التصوير الحي. يمكن أن تكون الميزة المحتملة لاستخدام غشاء نفاذية الغاز على بروتوكولنا أنه يوفر الأكسجين الأمثل للعينات، والتي يمكن أن تكون أكثر محدودية مع نهجنا كما يتم فصل العقول من الهواء عن طريق الجلطة وبعض المتوسطة. لهذا السبب ، على الرغم من أننا لم نقيم تأثير كمية الثقافة المتوسطة داخل طبق الثقافة ، نقترح الحد من كمية الثقافة المتوسطة فوق الجلطات مع الحفاظ على الجلطات مغمورة تماما.
وبما أن التلاعب بالجلطات يمكن أن يكون صعبا من الناحية التجريبية ويستغرق وقتا طويلا، فإننا نوصي بأن يمارس المجرب أولا التلاعب بالجلطات دون عينات. تعديل حجم انخفاض متوسطة الثقافة + فيبرينوجين على غطاء، وتركيز الفيبرينوجين أو حجم وتركيز Thrombin يمكن أن تساعد في جعل إعداد أسهل ويمكن أن تكون مهمة عند تكييف البروتوكول لأنواع أخرى من الأنسجة. مع ما يكفي من الخبرة في التلاعب بالجلطات ، يمكن شل حركة العديد من الأدمغة في جلطة واحدة إذا لزم الأمر ، على الرغم من أنها تعقد الضبط الدقيق للتوجه. يمكن تشكيل العديد من الجلطات على غطاء الغطاء ، مما يسمح ، على سبيل المثال ، بتصوير عينات من أنماط جينية مختلفة. ومن الممكن أيضا لفضح جلطات مختلفة على نفس coverslip إلى وسائل الإعلام الثقافية المختلفة، على الرغم من أن الرعاية يجب أن تؤخذ أبدا لخلط قطرات من الثقافة المتوسطة التي تغطي جلطات مختلفة. بمجرد أن يتم شل حركة أدمغة اليرقات وجاهزة للتصوير الحي ، ننصح باتباع توصيات Lerit et al.13 لتجنب الفوتوداماج المفرط. نضيف فقط إلى هذه التوصيات ليس فقط للحفاظ على العقول في 25 درجة مئوية أثناء التصوير الحي مع حاضنة المرحلة، ولكن أيضا لتسخين هذه المرحلة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء التصوير. وفي أيدينا، يؤدي الفشل في القيام بذلك بشكل منهجي إلى انجراف تركيز قوي.
يمكن أن يكون من المفيد في بعض السياقات أن تكون قادرة على إجراء المجهر المترابطة وإصلاح والمناعةالحصول على عينة بعد التصوير الحي. ومع ذلك ، فإن الحد من استخدام جلطات فيبرين هو أنه يكاد يكون من المستحيل عزل الدماغ ميكانيكيا من جلطة دون الإضرار بها. وهناك طريقة ممكنة للتغلب على هذا القيد يمكن أن يكون لتطوير أساليب لتحلل جلطات فيبرين مع بلازمين أو للحث على تفكيك جلطة بإضافة الببتيد تحاكي المقابض السماح فيبرين البلمرة28. نحن عادة ما نستخدم جلطات الفيبرين على عينات تتراوح بين خلايا واحدة إلى أنسجة طويلة 200 ميكرومتر ، ولكن يمكننا أيضا شل حركة الجلطات وأدمغة الصور من النحل البالغ الذي يزيد عرضه عن 3 مم. الحد الأعلى لحجم العينة التي يمكن شل حركتها في الجلطات لا يزال يتعين تحديده. وبالمثل ، على الرغم من أننا عادة ما نقوم بتصوير العينات المشلومة لمدة 4 إلى 5 ساعة ، إلا أننا نجحنا في تصوير الخلايا العصبية في الثقافة الأولية لمدة تصل إلى 3 أيام ، مما يشير إلى أن الجلطة على الأقل لا تتداخل مع الجدوى على المدى الطويل. على العكس من ذلك ، يمكن أن تسهل الجلطات الاستبدال المنتظم للوسط ، وهو شرط للتصوير على المدى الطويل ، دون الحاجة إلى أجهزة مثل المضخات العصاهر لهذا الغرض. في حين أننا لم نقيس المعلمات نفاذية جلطات الفيبرين ، فإن الطبيعة الليفية الشبيهة بالجل للجلطات تبدو قابلة للانشجار بواسطة جزيئات نفاذية الخلية. وجدنا أن لاتورونكولين A، Colcemid أو 1-NAPP1، هالو تاغ ليغاندس وغيرها من الأصباغ القياسية المستخدمة في بيولوجيا الخلية تصل إلى الخلايا في جلطة الفيبرين دون أي مشاكل وحتى الآن لم تواجه الجزيئات التي سيتم الاحتفاظ بها من قبل الجلطة، والتي، ومع ذلك، هو احتمال يحتاج إلى اختبار تجريبي.
في الختام ، باستخدام جلطات فيبرين توفير موثوق بها وسهلة نسبيا لتنفيذ وسيلة لشل الأنسجة الحية للتصوير الحي. وراء فائدتها في الحد من الانجراف الجانبي ، أثبتت القدرة على تغيير وسيط الثقافة أثناء التصوير الحي أنها لا تقدر بثمن لنهجنا في علم الوراثة الكيميائية لدراسة انقسام الخلايا غير المتماثلة في الخلايا العصبية D. melanogaster 21. نتوقع أن تكون هذه التقنية مفيدة للدراسات في مجموعة واسعة من الأنسجة المختلفة ، خاصة إذا كانت تنطوي على علم الوراثة الكيميائية أو ، على سبيل المثال ، وضع العلامات الذاتية للبروتين29.
يعتمد ماكرو MultiHyperStackReg لدينا على المكون الإضافي TurboReg ImageJ ، والذي يحاذي الإطارات المتتالية أو شرائح المكدس ، والمكون الإضافي MultiStackReg ImageJ ، والذي يسمح بتطبيق التحولات على أكوام أخرى. MultiHyperStackReg ببساطة يسمح لتطبيق هذه التحولات على hyperstacks (مكدسات مع أربعة أبعاد على الأقل). كما استخدام MultiHyperStackReg، كما وصفها، يتطلب الكثير من الإجراءات ويمكن الحصول على مضيعة للوقت تماما، كتبنا أيضا الماكرو AutoHyperStackReg، الذي ينفذ تلقائيا جميع الخطوات المذكورة في الخطوتين 6.2 و 6.3. ومع ذلك ، خلافا لMultiHyperStackReg ، AutoHyperStackReg تفتقر حاليا إلى إمكانية لحساب محاذاة كومة على أساس منطقة دون إقليمية من هذا المكدس ، وهو الخيار الذي وجدناه هو في بعض الأحيان حاسمة لمحاذاة مرضية. وهناك قيد آخر من AutoHyperStackReg هو أن يقتصر استخدامه على الترجمات وليس التحولات الأخرى المقترحة من قبل TurboReg وMultiStackReg، في حين MultiHyperStackReg يمكن أن تنطبق على hyperstack أي نوع التحول إذا كان المستخدم في حاجة إليها. ستنفذ الإصدارات المستقبلية هذه الوظائف وستكون متاحة على GitHub30. وأخيرا، يوفر الماكرو الدوار لدينا طريقة سهلة لقياس الإشارات القشرية بسرعة في الهفوات الزمنية، حتى لو غيرت القشرة موضعها أو اتجاهها بمرور الوقت. ما إذا كان وضع التتبع أو وضع عدم التتبع هو الأنسب للتحليل يعتمد على جودة واتساق الإشارة القشرية. وضع التتبع أسهل في الاستخدام حيث لا يحتاج المستخدم إلى النظر في مكان القشرة لكل نقطة زمنية ويمكن أن يستوعب تغييرات كبيرة في الموضع والتوجه بمرور الوقت. ومع ذلك ، فهي مناسبة فقط إذا كانت الإشارة القشرية لا تزال قوية بما يكفي للكشف خلال الفيلم بأكمله: الفشل في الكشف عن أي شيء آخر غير القشرة (على سبيل المثال ، مقصورة السيتوبلازمية الساطعة القريبة من القشرة) يمكن أن يعرض الكشف عن كل نقطة زمنية تالية للخطر (على سبيل المثال ، تتحرك المقصورة السيتوبلازمية بعيدا عن القشرة ويتبعها الخطوط القشرية لبقية الفاصل الزمني). لا يوجد في وضع عدم التتبع هذا المأزق حيث يقتصر الكشف على الخط الذي رسمه المستخدم في الأصل (على سبيل المثال ، قد تتسبب مقصورة السيتوبلازمية الساطعة في فشل الكشف لبضع نقاط زمنية ، ولكن مع تحرك المقصورة السيتوبلازمية بعيدا عن منطقة الكشف ، يستأنف الكشف المناسب عن القشرة) ، ولكنه لا يتصرف بشكل جيد إذا تغير موضع القشرة أو اتجاهها كثيرا بمرور الوقت. الميزة التالية (التي ستكون متاحة على GitHub30)التي سيتم تطويرها لوضع التتبع ستكون خيار تحليل النقاط الزمنية المحددة فقط وتحديد نقطة زمنية مرجعية (بدلا من النقطة الزمنية الأولى) قبل وبعد ذلك سيتم إجراء الكشف ، مما سيسمح للمستخدم بتجنب النقاط الزمنية الإشكالية على الأقل.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يتم دعم العمل في مختبر Januschke من قبل ويلكوم الاستئماني منح 100031/Z/12/A و 1000032/Z/12/A. ويدعم مرفق تصوير الأنسجة من قبل منحة WT101468 من ويلكوم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
| Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
| FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
| Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |
References
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
- Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
- Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).
