Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Anvendelser av Immobilisering av Drosophila Tissues med Fibrin Clots for Live Imaging

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61954
Automatic Translation
1, 1
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

Summary

Denne protokollen beskriver anvendelser av prøve immobilisering ved hjelp av Fibrin-blodpropper, begrense drifting, og tillate tilsetning og utvasking av reagenser under levende avbildning. Prøver overføres til en dråpe Fibrinogen som inneholder kulturmedium på overflaten av en deksler, hvorpå polymerisasjon induserer ved å legge til trombin.

Abstract

Drosophila er et viktig modellsystem for å studere et stort utvalg av biologiske spørsmål. Ulike organer og vev fra ulike utviklingsstadier av flyet som imaginale plater, larvalhjernen eller eggkamrene til voksne kvinner eller voksentarmen kan ekstraheres og holdes i kultur for avbildning med tidsforløpmikroskopi, noe som gir verdifull innsikt i celle- og utviklingsbiologi. Her beskriver vi i detalj vår nåværende protokoll for disseksjon av Drosophila larvalhjerner, og presenterer deretter vår nåværende tilnærming for immobilisering og orientering av larvalhjerner og andre vev på en glassdekslelip ved hjelp av Fibrin-blodpropper. Denne immobiliseringsmetoden krever bare tilsetning av Fibrinogen og Trombin til kulturmediet. Den er egnet for høyoppløselig tidsforløpavbildning på inverterte mikroskoper av flere prøver i samme kulturfat, minimerer lateraldriften ofte forårsaket av bevegelser av mikroskopstadiet i multipunktsbesøkende mikroskopi og tillater tilsetning og fjerning av reagenser i løpet av avbildning. Vi presenterer også skreddersydde makroer som vi rutinemessig bruker til å korrigere for drifting og for å trekke ut og behandle spesifikk kvantitativ informasjon fra tidsforløpanalyse.

Introduction

Drosophila er fortsatt et viktig modellsystem for å studere et stort spekter av biologiske spørsmål og har utmerket seg i å fremme kunnskap innen mange disipliner i flere tiår. En funksjon som gjør at den spesielt skiller seg ut, er at den er spesielt godt egnet for levende bildebehandling. Evnen til å overvåke subcellulære prosesser eller oppførselen til celler og vev i sanntid fortsetter å bidra til å generere nøkkelbegreper som er relevante for celle- og utviklingsbiologi. Mange vellykkede protokoller har blitt utviklet av forskjellige grupper for å opprettholde slike Drosophila-prøver levende og sunne for å studere oppførselen til prøven og fluorescerende molekyler lever. Organer og vev fra fluen som imaginale plater1,2, larvalhjernen3,4,5,6eller eggkamre av voksne kvinner7,8,9eller voksentarmen10 kan for eksempel ekstraheres og holdes i kultur for avbildning med tidsforløpmikrokopi. En viktig utfordring for levende bildebehandling er å sikre at prøven holdes nær bildeflaten for optimal oppløsning og immobil uten at det går på bekostning av prøveintegritet som kan være følsom for mekaniske påvirkninger. For å studere nevrale stamceller, kalt nevroblaster eller nevroner i Drosophila larvalhjernen, for eksempel, kan du holde prøver nær bildeflaten ved å dekke dem med kulturmedier i forseglede bildekamre11,12,13. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke lett medieutveksling og begrenser dermed eksperimentelt handlingsrom. Alternativt kan prøver tilberedes og plasseres på coverlips som behandles for å øke vedheft av celler og tillate multi-point besøkende mikroskopi og utvidet live-celle avbildning i åpne kulturretter, som potensielt tillater medieutveksling, men gir ikke enkle midler for å forhindre prøvedrift eller tap under medieutveksling14,15.

Fibrin-blodproppmetoden som opprinnelig ble utviklet for å studere meiosis i levende kranflue spermatocytter16, er spesielt egnet til å overvinne disse problemene. Fibrinogen er oppløst i relevant kulturmedium, prøvene plassert og orientert i en dråpe av denne løsningen på et tilstrekkelig glassoverflate bildekammer før Trombin tilsetts, noe som resulterer i rask dannelse av en uoppløselig Fibrin-blodpropp, et klebrig fibrøst nett som fester seg til glassoverflaten og prøvene samtidig som de sikrer tilgang til prøven til kulturmediet. Mediet kan deretter byttes uten å fortrenge blodpropp eller prøveposisjon. Kulturmediumutveksling under avbildning er for eksempel ønskelig når inhibitorer skal tilsettes som i den opprinnelige metoden eller for utvasking eller pulsjakteksperimenter eller når fluorescerende fargestoffer skal tilsettes under levende celleavbildning mens celler og vev holdes på plass. Fibrin blodpropper er egnet for avbildning av Drosophila vev samt individuelle celler13,17. Fibrin-blodpropper kan videre brukes til å orientere prøver, som på grunn av deres form eller andre egenskaper normalt ikke ville være orientert på ønsket måte ved å modulere prøveposisjon i Fibrin-blodpropp og formen på blodpropp selv.

Her gir vi en oppdatering om våre nåværende Fibrin-blodproppbaserte avbildningsmetoder og gir verktøy for segmenteringsbasert bildeanalyse og fokus på bruk av denne metoden for å studere nevroblastomdivisjoner i den utviklende fluehjernen. Vi bruker rutinemessig Fibrin-blodproppmetoden til å følge flere prøver i forskjellige blodpropper i samme kulturrett. Dette tillater i) avbildning av subcellulære hendelser som sentrosom atferd eller mRNA lokalisering live18,19, ii) overvåking av oppførselen til prøver ved farmakologisk behandling av forskjellige genotyper under samme bildebehandlingsinnstillinger ved hjelp av flerpunktsbesøk mikroskopi20, iii) studere effekten av akutt inhibering av enzymer21 og iv) minimere drifting for å studere endringer i orienteringen av celledeling av celler i deres fysiologiske miljø ved målrettet laser-ablasjon22. Mens uønskede effekter av Trombin og Fibrinogen og Fibrin-blodpropp må testes empirisk for hver prøve, denne metoden er i prinsippet egnet til å immobilisere enhver type prøve som skal analyseres av levende celleavbildning og i Drosophila har blitt brukt til å studere flere aspekter av nevroblasterbiologi5,19,20, men også dynamikken i cytosensorprojeksjoner av kvinnelige bakterielinje stamceller23 og endringer i polaritet ved akutt aPKC-hemming av follikkelceller av Drosophila kvinnelige eggkamre21.

Tidsforløp fluorescerende avbildning resulterer i generering av komplekse tidsavklarte 3D-datasett som krever metoder for å trekke ut denne kvantitative informasjonen. Her beskriver vi vår videre utvikling av ImageJ-baserte24 makroer som kan brukes til å korrigere for drifting i hyperstakker og skreddersydde ImageJ-makroer som tillater halvautomatisk kvantifisering av flerkanals fluorescens ved cellebarken utviklet for å kvantifisere kortikale proteiner i nevroblaster av Drosophila larvalhjerner eller av individuelle nevroblaster i primærcellekultur.

Protocol

1. Utarbeidelse av reagenser

MERK: Alle trinnene i denne protokollen, med mindre annet er forklart, utføres ved romtemperatur.

  1. For å lage en løsning på 1x PBS-BSA (0,1% m/v), oppløs 1 mg Bovine Serum Albumin (BSA) i 1 ml PBS. For å forberede en lagerløsning av Trombin 1000 enheter·ml-1, oppløs 1000 enheter trombin i 1 ml PBS-BSA (0,1% m/v). Lag aliquots på 10 μL og oppbevar ved -20 °C i opptil 4 måneder.
  2. For å forberede kulturmediet for Drosophila-hjerner, oppløs 1 g glukose i 1 L schneiders medium under sterile forhold. Filtrer og oppbevar ved 4 °C i opptil 3 måneder.
  3. For å forberede Fibrinogen-løsningen, oppløs 10 mg Fibrinogen i 1 ml kulturmedium i 20 min ved romtemperatur eller 5 min ved 37 °C.
    MERK: Hvis et annet kulturmedium enn det som er utarbeidet i trinn 1.2 brukes og Fibrin-blodpropper allerede dannes på dette trinnet, inneholder kulturmediet sannsynligvis aktiv trombin, som må deaktiveres på forhånd. En sannsynlig kilde til trombin er Fetal Bovine Serum, som kan inaktiveres ved å varme opp serumet til 56 °C i 30 minutter.
  4. For å forberede en beleggløsning av PBS-BSA (5% m / v), oppløs 50 mg Bovine Serum Albumin (BSA) i 1 ml 1x PBS.
  5. For eksempel reagens som brukes i trinn 4, lag en lagerløsning på 10 mM NAPP1 ved å oppløse 1 mg NAPP1 i 315 μL Dimetylsulfoksid.

2. Disseksjon av Drosophila larval hjerner

MERK: Utfør dette trinnet under en disseksjons kikkert.

  1. Bruk en børste til å overføre L3 larver til en 9-brønns borosilikat glassfat som inneholder PBS. Rør for å løsne det meste av flymaten fra larver og overfør til et annet godt inneholdende kulturmedium.
  2. Bruk tang (f.eks. Dumont #55) for å gripe en larve over hele diameteren, midt i kroppslengden (se figur 1A,B). Mens du holder larven, overfør den til en annen brønn av borosilikatplaten som inneholder 200 μL ferskt kulturmedium.
  3. Ikke slipp larven. For å kutte larven i to over hele diameteren (Figur 1B), slip enten det grepte området med lateral bevegelse av tangspissene (Figur 1A, topppanel) eller skyv en spiss av et annet par tang mellom de to tangspissene som holder larven (Figur 1A, bunnpanelet). Ikke kutt larven i halvparten ved å trekke på en av ekstremitetene, da det kan skade hjernen ved å trekke på den via nervene som krysser kroppslengden (røde linjer i figur 1B).
  4. Bruk tang til å holde larven ved neglebåndet og et annet par tang for å skrelle fra hverandre kutiklet uten å trekke på hjernen (Figur 1C). Gjenta til nervene som stammer fra hjernen er synlige og organene som forbinder hjernen med munndelene, kan nås som vist i figur 1D.
  5. Bruk tang til å holde nervene som stammer fra hjernen. Med de andre tangparene bruker du en av teknikkene som er vist i figur 1A for å kutte forbindelsen mellom hjernen og munndelene, og skille hjernen fra resten av kutiklet (figur 1D).
  6. Bruk tang til å holde hjernen ved aksonene som kommer ut av ventral nerve ledning. Plukk organene avbildet i grått i figur 1E ved å trekke dem forsiktig bort fra hjernen.
    MERK: Ikke dra i imaginale disker for øye/antenne (mørk gul) for å løsne dem fra hjernen. Forbindelsen mellom disse vevene er for robust til å bli brutt ved å trekke uten å skade hjernen.
  7. Mens du fortsatt griper nervene for å holde og orientere hjernen, ta tak i forbindelsen mellom øye / antenne imaginale disker (mørk gul) og hjernen med det andre par tang (Figur 1F). Bruk en av teknikkene som vises i figur 1A for å kutte denne tilkoblingen uten å trekke i hjernen. Kontroller om hjernen er tilstrekkelig renvasket for andre vev (Figur 1G) og ikke skadet (Figur 1H). Kast hjernen hvis den viser tegn på skade.
  8. Pipette beleggløsningen med en P20 inn og ut for å belegge pipettespissen. Pipette hjernen med den belagte spissen sammen med 3 μL medium (Figur 2A, venstre) og pipette den ut i en annen brønn som inneholder 200 μL rent kulturmedium.
  9. Gjenta trinn 2.2-2.8 til nok hjerner dissekeres, og av og til erstatte kulturmediet til brønnen der disseksjonene utføres.

Figure 1
Figur 1: Disseksjon av D. melanogaster larvalhjerner. (A) Teknikk for kutting uten å trekke i tang. Prøven (lysegrønn) kan kuttes ved å bli malt mellom spissene på tangene (topppanelet) eller ved å kjøre en spiss av et par tangspisser langs spissene på et par tang som holder prøven (bunnpanelet). (B–F) Fremgangsmåte for å isolere larvalhjernen uten å skade den (se tekst). Rød: hjerne. Mørk gul: øye-/antenneskiver. Blå tekst: handlinger som skal utføres med de tilsvarende tangene. (G) Utseende på en isolert hjerne uten synlige skader. D er dorsalsiden og V er ventralsiden på sidevisningen. (H) Vanlige skader forårsaket av overdreven trekking av hjernen under disseksjonen. Topppanel: Løsrivelse av lufte nerveledningen. Bunnpanel: deformasjon av en lobe. Posterior er igjen og fremre er rett i alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Immobilisering på coverlip med Fibrin blodpropper

MERK: Utfør dette trinnet under en disseksjons kikkert.

  1. Bruk en P20 pipette med belagt spiss som i trinn 2.8 for å overføre de dissekerte hjernene til en annen brønn av borosilikatplaten som inneholder 200 μL kulturmedium + Fibrinogen (Figur 2A).
  2. Pipette i en hjerne sammen med 9 μL kulturmedium + Fibrinogen. Med enden av spissen nesten berører dekselglassbunnen på en 35 mm cellekulturfat, pipetter ut innholdet (kulturmediet og hjernen) noe som gjør at kulturmediet berører dekslene umiddelbart etter at du har gått ut av pipettespissen slik at hjernen og mediet ikke glir til sidene av spissen, og potensielt skader hjernen (Figur 2A).
  3. Bruk en spiss av et par tang eller et lukket par tang for å forsiktig skyve og plassere hjernen innenfor kulturmediet + Fibrinogen-dråpen.
    MERK: Hvis du berører dråpen med et åpent par tang, kan det føre til at kulturmediet trekkes av kapillæritet mellom tangspissene (Figur 2B).
  4. Hvis den ventrale delen av hjernen må avbildes, induser Fibrinogen koagulering som følger for å orientere hjernen riktig i blodpropp (Figur 2C).
    1. Skyv hjernen til den ene siden av dråpen. Med en P1 pipette utstyrt med en P1-spiss, pipette 1 μL trombinoppløsning, berør kanten av dråpen på motsatt side av hjernen med pipettespissen, og pipette ut trombin (Figur 2C, første tegning).
    2. Vent i 1-2 min for at Fibrinogen skal begynne å polymerisere, noe som resulterer i dannelsen av et overskyet bunnfall på den ene siden av dråpen (Figur 2C, andre tegning). Skyv og "tuck" hjernen forsiktig inn i Fibrin-blodpropp, og sørg for at delen til bildet (f.eks. ventralsiden) er så nær dekslene uten å deformere hjernen (Figur 2C, tredje tegning).
    3. Pipette ut 1 μL trombinoppløsning nær siden av hjernen som ikke er gjemt i Fibrin-blodpropp. (Figur 2C, fjerde tegning).
    4. Vent i 2–3 minutter til den andre Fibrin-blodproppen er satt (Figur 2C, femte tegning). Trykk på kantene på blodpropp for å gjøre det holder seg sterkere til dekslenelip, pass på ikke å deformere hjernen (Figur 2C, sjette og syvende tegninger). Hvis hjernen ser ut til å være for langt fra dekslene, ta den nærmere ved å trykke fibrin-blodpropp nær hjernen.
  5. Hvis den dorsale delen av hjernen må avbildes, induser Fibrin koagulering som følger (Figur 2D).
    1. Plasser hjernen i midten av dråpen, dorsal del vendt mot dekslenelip. Med en P10 pipette utstyrt med en tynn spiss, pipette 1 μL trombinoppløsning, berør kanten av dråpen på motsatt side av hjernen med pipettespissen, og pipette ut Trombin (Figur 2D, første tegning).
    2. Vent i 2-3 min på at Fibrinogen skal begynne å polymerisere, noe som resulterer i dannelsen av et overskyet, fibrøst bunnfall (Figur 2D, andre tegning). Trykk på kantene på blodpropp for å få den til å holde seg sterkere til dekslene, pass på at du ikke deformerer hjernen (Figur 2D, tredje og fjerde tegninger).
  6. Gjenta trinn 3.1-3.5 hvis flere blodproppprøver må immobiliseres på dekslene.
  7. Med enden av spissen plassert ca 0,5 cm over blodpropp(er), forsiktig pipette 390 μL kulturmedium uten Fibrinogen dropwise på toppen av blodpropp(Figur 2B, høyre Petri tallerken). Ikke legg til kulturmediet på sidene av blodpropp, da det kan løsne det fra dekslene.
  8. For å vaske ut den gjenværende trombin, bruk en pipette for å fjerne 300 μl av kulturmediet og tilsett 300 μl rent kulturmedium, og sørg for at blodproppene forblir helt nedsenket. Gjenta to ganger for å vaske ut overflødig trombin.

Figure 2
Figur 2: Immobilisering av en Drosophila larvalhjerne ved hjelp av Fibrin-blodpropper. (A) Ved hjelp av en BSA-belagt pipettespiss overføres hjernene fra kulturmediet (gult) til et kulturmedium + Fibrinogen-løsning (oransje), og pipetteres deretter på dekslene (lyseblå) av en kulturrett sammen med 3,5 μL kulturmedium + Fibrinogen. Fibrinogen koagulering er indusert ved tilsetning av Trombin for å immobilisere hjerner i dorsal eller ventral posisjon (se D og E). De sikrede hjernene i blodproppene er senere dekket av kulturmedium uten Fibrinogen og overflødig trombin fjernes ved å legge til og fjerne kulturmedium tre ganger. (B) Hjernens posisjon innenfor dråpen av kulturmedium + Fibrinogen (oransje) på dekslene skal bare justeres ved å skyve den forsiktig med spissen av et lukket par tang, eller bare en tangspiss. Berøring av dråpen med på åpne par tang kan føre til at kulturmediet blir trukket av kapillæritet mellom spissene på tangene. (C) Trinn for plassering av larvalhjernen for avbildning av ventralsiden (se tekst). (D) Trinn for plassering av larvalhjernen for avbildning av dorsalsiden (se tekst). I (D) og (E), grønn: Trombin. Mørk oransje: Fibrin clot. Lyseblå: dekslerlip. Blå piler: kantene på blodpropp som skal skyves mot dekslene for å stabilisere blodpropp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Tilsetning av reagenser under levende avbildning

  1. For å unngå temperaturendringer som forårsaker endringer i fokus, hold løsningen med reagensene som skal legges til kulturretten ved samme temperatur som selve kulturretten for å bringe den til samme temperatur før du legger den til. Hvis et miljøkammer brukes, la løsningen være i kammeret.
  2. Fjern lokket på kulturretten uten å fortrenge selve kulturretten. For enklere fjerning, plasser lokket på den 35 mm parabolen opp-ned på toppen av parabolen før bildebehandling.
  3. Med en P1000 pipette plasserer du pipettespissen nær overflaten av kulturmediet inne i kulturfatet og slipper forsiktig det tilstrekkelige volumet av reagensløsning på den for å nå ønsket reagenskonsentrasjon (f.eks. 400 μL av en løsning på 20 μM NAPP1 på 400 μL kulturmedium for en sluttkonsentrasjon på 10 μM NAPP1) , uten å generere sterke fluxer som kan løsne blodproppene.
  4. For å homogenisere løsningen i kulturretten, bruk en P200 pipette for sakte å pipette en liten mengde av løsningen inn og ut fem ganger (f.eks. 150 μL for et volum på 800 μL i parabolen).
  5. Bytt lokket på toppen av kulturretten uten å fortrenge selve kulturretten og gjenoppta avbildningen.

5. Utvasking av reagenser under levende avbildning

  1. Før utvaskingen, hold vaskeløsningen på samme temperatur som kulturretten.
  2. Fjern lokket på kulturretten uten å fortrenge selve kulturretten.
  3. Med en P200- eller P1000-pipette fjerner du sakte noe kulturmedium fra kulturretten uten å eksponere toppen av blodproppen (fjern for eksempel 600 μL fra 800 μL kulturmedium i parabolen).
  4. For å fortynne reagenset, med en P1000 pipette, plasser pipettespissen nær overflaten av kulturmediet inne i kulturfatet og slipp vaskeløsningen sakte (f.eks. tilsett 1 ml vaskeløsning til 200 μL kulturmedium igjen i parabolen for en fortynningsfaktor på 6).
  5. Gjenta trinn 5,3 og 5,4 til reagenset fortynnes etter behov (f.eks. vil ytterligere tre lignende runder resultere i en fortynningsfaktor på 1296, noe som reduserer den første konsentrasjonen på 10 μM NAPP1 til 7,7 nM).
  6. Bytt lokket på toppen av kulturretten uten å fortrenge selve kulturretten og gjenoppta avbildningen.

6. Korreksjon av xyz drivende på tridimensional og / eller multikanals tidsforløp

  1. forberedelse
    1. Last ned og installer ImageJ24. Last ned Plugin-modulene TurboReg25 og MultiStackReg26 og plasser dem i plugins-mappen til ImageJ.
    2. Last ned makroene MultiHyperStackReg (Tilleggskodingsfil 1) og AutoHyperStackReg ImageJ (Tilleggskodingsfil 2). Hvis du vil installere en makro, plasserer du IJM-filen i plugins-mappen i ImageJ eller legger til innholdet i IJM-filen i filen ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
    3. På ImageJ åpner du en intervallfilm med flere stykker og/eller flere kanaler (heretter kalt "hyperstakk", figur 3A,4A). Hvis tidsforløpet bare inneholder ett stykke og én kanal, kan justeringen utføres direkte ved hjelp av MultiStackReg.
  2. Korrigering av lateral drift ved hjelp av MultiHyperStackReg
    1. Bestem hvilken kanal og/eller del av hyperstakken som skal brukes som referanse for justering. Hvis du vil generere en referansestakk med én kanal og én del (heretter kalt "referansestakk"), klikker du på Bilde | Dupliser..., merk av for Dupliser hyperstakk , skriv inn det relevante kanalnummeret i Kanaler (c): (erstatt for eksempel 1–15 med 1) og/eller det relevante kanalnummeret i Stykker (z): (f.eks. erstatt 1–15 med 8), og kontroller at Frames: (t) inneholder alle rammer (f.eks. 1–50) før du klikker OK (Figur 3B).
    2. Alternativt til trinn 6.2.1, hvis en projeksjon av flere stykker foretrekkes for enkanals referansestakk med én sektorer, klikker du på Bilde | Stabler | Z Prosjekt..., merk av for første og siste sektor og projeksjonstype, kontroller at det er merket av for Alle tidsrammer , og klikk OK. Hvis tidsforløpet har flere kanaler, sletter du enten de irrelevante kanalene (Bilde | Stabler | Slett stykke) fra den resulterende projeksjonen eller dupliser den valgte referansekanalen (Bilde | Duplikat) (Figur 3B).
    3. Du kan også beskjære referansestakken slik at den bare bruker én del som bilde som referanse ved å velge rektangelverktøyet på verktøylinjen, spore et rektangel over interesseområdet og klikke Bilde | Beskjær.
    4. For å starte MultiStackReg, klikk på Plugins | Registrering | MultiStackReg. Velg navnet på enkanals ensektorstakken som ble generert i de forrige trinnene, på hurtigmenyen Stabel 1:. Velg Oversettelsepå hurtigmenyen Transformasjon:. Merk av for Lagre transformeringsfil og ignorer alle de andre feltene.
      MERK: Andre typer transformasjon (se25).
    5. Klikk OK. Velg en plassering og et navn for å lagre justeringsfilen, og klikk Lagre. I referansestakkvinduet venter du til rammene slutter å bevege seg automatisk, noe som angir at registreringen er over (Figur 3B).
    6. Kontroller referansestakken for å se om justeringen er tilfredsstillende. Hvis ikke, gjentar du trinn 6.2.1–6.2.5 med et annet referansestykke, en annen kanal og/eller beskjæring. Lukk referansestakken.
    7. Velg hyperstakkvinduet, og kjør makroen MultiHyperStackReg. Velg transformeringsfilen som ble opprettet i trinn 6.2.5, og klikk Åpne. Vent til justeringen skal brukes på alle kanaler og/eller deler av hyperstakken, og da åpnes et nytt vindu med suffikset "_aligned" (Figur 3C).
  3. Korrigering av fokusdrift ved hjelp av MultiHyperStackReg
    1. Klikk på Bilde | Egenskaper..., kopierer du verdien som vises i Pikselbredde. For å ortogonalt videreselsere enkanals hyperstakken med en avstand på én piksel, klikker du på Bilde | Stabler | Reslice [/]..., limer du inn verdien for pikselbredde i feltet Utdataavstand: numerisk. velg Topp i start på: popup-menyen, kryss av for Unngå interpolering og klikk på OK.
      MERK: I tilfelle minnet må frigjøres på ImageJ, kan hyperstakken lukkes etter reslice.
    2. Velg det nye vinduet som genereres av reslice (heretter kalt "resliced hyperstack", figur 4B). Hvis den resliced hyperstakken har flere kanaler, velger du en referansekanal for å utføre justeringen og slette de andre kanalene ved å velge dem i kanalrullefeltet. klikk på Bilde | Stabler | Slett stykke, velg Kanal på hurtigmenyen Slett gjeldende , og klikk OK.
    3. Generer en resliced hyperstakk med ett stykke (heretter kalt "resliced reference stack"), enten ved å duplisere en enkelt del av den resliced hyperstakken (se trinn 6.2.1) eller ved å projisere flere stykker av den resliced hyperstakken (se trinn 6.2.2) (Figur 4C).
    4. Du kan eventuelt beskjære den resliced referansestakken slik at den bare bruker én del som bilde som referanse (se trinn 6.2.3).
    5. Utfør bilderegistreringen på den resliced referansestakken med MutiStackReg (se trinn 6.2.4–6.2.6) (Figur 4C).
    6. Velg det resliced hyperstakkvinduet, og kjør makroen MultiHyperStackReg. Velg transformasjonsfilen som ble opprettet i trinn 6.3.5, klikk på Åpne og vent til justeringen skal brukes på hver kanal og /eller del av hyperstakken, og da åpnes et nytt vindu med suffikset "_aligned" (heretter kalt "resliced reference stack", Figur 4D). Lukk den opprinnelige resliced hyperstakken.
    7. For å konvertere den resliced justerte hyperstakken til xy-visningen av den opprinnelige hyperstakken, klikk på Stabler | Reslice [/]..., velg Øverst på start på: popup-menyen, merk av for Unngå interpolering og klikk ok . Når et nytt vindu med den endelige fokusjusterte hyperstakken åpnes (Figur 4E), lukker du den resliced justerte hyperstakken.
  4. Hvis du vil korrigere den laterale driften og fokusdriften automatisk, kjører du makroen AutoHyperStackReg. Velg referansekanalen, hvis det er aktuelt, og om du vil korrigere den laterale og/eller fokuseringsdriften. Klikk OK.

Figure 3
Figur 3: Rørledning for korrigering av lateral drift med MultiHyperstackReg. (A) Laterale og fokuseringsdrifter kan observeres på en hyperstakk som inneholder flere skiver og tidspunkter. (B) En enkeltsektor, enkanals referansestakk genereres fra hyperstakken, enten ved duplisering eller Z-projeksjon. Referansestakken justeres av plugin-modulen MultiStackReg, og genererer en justeringsfil. (C) Makroen MultiHyperstackReg brukes til å bruke justeringsfilen på hyperstakken, noe som resulterer i en justert hyperstakk som den laterale driften korrigeres for. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Rørledning for korreksjon av fokusdrift med MultiHyperstackReg. (A) Fokusdrift kan observeres på en hyperstakk som inneholder flere skiver og tidspunkter. (B) Hyperstakken er ortogonalt resliced fra toppen, langs hver linje av piksler langs Y-aksen, uten interpolering. Dette resulterer i en resliced hyperstakk som inneholder samme informasjon som hyperstakken, med y- og z-koordinatene byttet. Fokusdriften (i z) av den opprinnelige hyperstakken oppstår som en drift i y på den resliced hyperstakken. (C) En enkelt sektor, enkanals resliced referansestakk genereres fra den resliced hyperstakken, enten ved duplisering eller Z-projeksjon. Den resliced referansestakken er justert av MultiStackReg plugin, og genererer en justeringsfil. (D) MultiHyperstackReg-makroen brukes til å bruke justeringsfilen på den resliced hyperstakken, noe som resulterer i en justert resliced hyperstakk som fokusdriften (i y) korrigeres for. (E) En annen ortogonal reslice gjenoppretter de opprinnelige koordinatene til hyperstakken, som nå ikke lenger presenterer en fokusdrift (i z). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7. Kortikale signalmåling med roterende linjer

  1. Last ned makroen Roterende linjer ImageJ (Tilleggskodingsfil 3).
  2. Åpne en tidsforløp i ImageJ. Plasser rullefeltet for rammer til den første rammen, og hvis tidsforløpet inneholder flere stykker, plasserer du skiverullefeltet til stykket som signalet skal måles på.
  3. Sporingsmodus
    1. Velg det lineære verktøyet på verktøylinjen. Spor en linje over kortikale sonen som skal måles (Figur 5A), og pass på at linjen er omtrent vinkelrett på cortexen, og at linjen er lang nok til å krysse cortexen ved hvert neste tidspunkt (Figur 5B, første og andre panel).
    2. Dobbeltklikk linjeverktøyikonet på verktøylinjen for å åpne Linjebredde -vinduet. Øk bredden på linjen så mye som nødvendig, samtidig som skjæringspunktet mellom linjen og cortexen holdes en rett linje (Figur 5B, tredje panel).
    3. Start makroen Roterende linjer . Sett rotasjonsområdet (Figur 5E) til en lav verdi (ca. 10°) hvis retningen på kortikale sonen som skal måles, ikke endres mye fra ett tidspunkt til det neste. Sett verdien Mål rundt til 0 piksler for bare å måle signalet på linjen der den maksimale signalintensiteten oppdages, eller til høyere verdier for også å måle signalet rundt denne linjen.
      MERK: Mål rundt-verdien vil bare påvirke signalmålingen etter påvisning av cortexen og vil ikke påvirke selve deteksjonen.
    4. På hurtigmenymenyen Finn cortex på kanal: velger du kanalen som deteksjonen skal utføres på. Hvis du vil visualisere hvor cortexen har blitt oppdaget ved hvert tidspunkt, merker du av for Visningsposisjon ... merket (anbefales). Hold avmerkingsboksen Nyere og reorientert. Klikk OK.
    5. Når statusen Ferdig, Resultater kopiert til utklippstavle vises i ImageJ-vindusstatusen, blar du gjennom tidsforløpet for å kontrollere om de oppdagede cortex-posisjonene (gult overlegg) og det målte området (cyanoverlegg) er tilfredsstillende. Hvis ikke, gjentar du trinn 7.3.1-7.3.4 med en annen linjeposisjon, lengde eller bredde og forskjellige innstillinger i vinduet Roterende linjer.
    6. Lim inn målene i en regnearkprogramvare.
      MERK: Kolonner tilsvarer kanaler i rekkefølgen av utseendet i tidsforløpet, og linjene tilsvarer rammer.
  4. Ikke-sporingsmodus
    1. Velg det lineære verktøyet på verktøylinjen. Spor en linje (angitt i cyan, figur 5A) over kortikale sonen som skal måles, og kontroller at linjen er omtrent vinkelrett på cortexen, og at linjen er lang nok til å krysse cortexen ved hvert tidspunkt (Figur 5C, første og andre panel).
    2. Dobbeltklikk linjeverktøyikonet på verktøylinjen for å åpne Linjebredde -vinduet. Øk bredden på linjen så mye som nødvendig, samtidig som skjæringspunktet mellom linjen og cortexen holdes en rett linje (Figur 5C, tredje panel).
    3. Start makroen Roterende linjer . Angi rotasjonsområdet (Figur 5E) tilsvarende retningsendringene i kortikale sonen som skal måles gjennom hele tidsforløpet. Sett verdien Mål rundt til 0 piksler for bare å måle signalet på linjen der den maksimale signalintensiteten oppdages, eller til høyere verdier for også å måle signalet rundt denne linjen.
      MERK: Mål rundt-verdien vil bare påvirke signalmålingen etter påvisning av cortexen og vil ikke påvirke selve deteksjonen.
    4. På hurtigmenymenyen Finn cortex på kanal: velger du kanalen som deteksjonen skal utføres på. Hvis du vil visualisere hvor cortexen har blitt oppdaget ved hvert tidspunkt, merker du av for Vis posisjoner ... (anbefales). Løsne avmerkingsboksen Nyere og Reorienter. Klikk OK.
  5. Når du er ferdig, vises resultater kopiert til utklippstavlen i ImageJ-vindusstatusen, bla gjennom tidsforløpet for å sjekke om de oppdagede cortex-posisjonene (gult overlegg) og det målte området (cyan overlegg) er tilfredsstillende. Hvis ikke, gjentar du de forrige trinnene med en annen linjeplassering, -lengde eller -bredde og forskjellige innstillinger i vinduet Roterende linjekannere .
  6. Lim inn målene i en regnearkprogramvare.
    MERK: Kolonner tilsvarer kanaler i rekkefølgen av utseendet i tidsforløpet, og linjene tilsvarer rammer.

Figure 5
Figur 5: Måling av kortikale signaler med roterende linjer kan. (A) En linje (cyan) spores vinkelrett på cortex (svart) der signalet måles. Ulike gråtoner viser celleplasseringen som endres over tre tidspunkter (t1, t2, t3). (B) Venstre: riktig plassering av linjen i sporingsmodus. Midten: Feil plassering av linjen i sporingsmodus, da det ikke er noen overlapping med cortex ved neste tidspunkt. Høyre: altfor bred linje som resulterer i skjæringspunktet (oransje linje) mellom cortex og linjen ikke er rett. (C) Venstre: riktig plassering av linjen i ikke-sporingsmodus. Midten: Feil plassering av linjen i ikke-sporingsmodus, da det ikke er noen overlapping med cortexen ved hvert tidspunkt. Høyre: altfor bred linje som resulterer i skjæringspunktet (oransje linje) mellom cortex og linjen ikke er rett. (D) Lengden og bredden på skannelinjen. (E) Linescans utføres innenfor et retningsområde rundt den opprinnelige retningen som vises i (D) definert av parameteren "rotasjonsområde", med et intervall definert av parameteren "rotasjonstrinn". (F) Ikke-optimal orientering av skannelinjen i forhold til cortex, noe som resulterer i et lavt signal målt langs linjen. (G) Den optimale retningen på linjen er definert som den som resulterer i den høyeste toppen av signalintensiteten målt langs linjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Immobilisering av Drosophila vev med Fibrin blodpropper og kultur medium utveksling under levende bildebehandling.
Etter å ha blitt dissekert etter prosedyren presentert i trinn 2 (Figur 1) og immobilisert i Fibrin-blodpropper på samme deksle etter prosedyren presentert i trinn 3 (Figur 2), ble larvalhjerner som uttrykker GFP-merket Bazooka (Baz::GFP), flyorthologen til polaritetsproteinet Par-3, avbildet i 30 minutter i tidsforløp multiposisjonocal imaging. Baz::GFP er kombinert med apkcas4, et smug som tillater akutt hemming av atypisk protein kinase C (aPKC) gjennom tilsetning av den lille ATP analog 1-NAPP120. 1-NAPP1 ble derfor lagt til kulturmediet etter prosedyren som ble presentert i trinn 4 og levende bildebehandling ble gjenopptatt i 2,5 timer. Kontrollhjerner som bærer en villtypeversjon av kinase aPKC reagerte ikke på ATP-analogen, mens hjerner som i tillegg bærer en analog-sensitiv mutasjon av aPKC (apkcas4) viste en sammentrekning av nevroepithelium og lyse klynger av Baz i nevroblaster og deres avkom ( Figur6, Video 1). Nevroblaster fortsetter å dele seg gjennom hele tidsforløpet, noe som indikerer at vevet forblir sunt, og hjernene viser liten drift til tross for kulturmedieendringen, noe som indikerer at de er godt immobilisert. På samme måte, etter å ha blitt dissekert etter prosedyren presentert i27, ble ovarioles som uttrykker Baz::GFP immobilisert i Fibrin-blodpropper på samme dekslelip og avbildet i 8 min, hvoretter anvendelsen av 1-NAPP1 induserte sammentrekningen av apkcas4 mutant follikulære celler, men ikke av kontroller (Figur 7, Video 2).

Korreksjon av lateral og fokus drift ved hjelp av MultiHyperstackReg.
En hyperstakk som viser både lateral og fokusdrift (Video 3, venstre panel) ble først korrigert for lateral drift (trinn 6.2, Figur 3, Video 3, midtpanel), deretter fokusdrift (trinn 6.3, Figur 4, Video 3, høyre panel) ved hjelp av MultiStackReg-pluginen og MultiHyperstackReg-makroen, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av bevegelsene som observeres i den opprinnelige hyperstacken.

Kortikale signalmålinger ved hjelp av roterende linecans
En nevroblast som uttrykker Baz::GFP (grønn) og transmembranproteinet CD4 merket med et infrarødt fluorescerende protein (CD4::mIFP, rød) ble avbildet under en mitose. CD4::mIFP-signalet ble brukt som referanse for å oppdage cortex på ulike deler av nevroblastomet med linecans (trinn 7, figur 5, figur 8A–C) og Baz::GFP-signalet ble målt ved de oppdagede posisjonene Figur 8D). Under deres divisjon polariserte nevroblaster forbigående ved å etablere distinkte og motsatte kortikale domener: den apikale polen og basalpolen. Baz definerer den apikale polen, og konsekvent økte Baz::GFP-signalet ved nevroblasterets apikale pol og reduserte ved basalpolen under divisjonen (Figur 8C,D). Cortexens posisjon ble tilfredsstillende sporet gjennom hele tidsforløpet (Figur 8C, Video 4). Det refereres til Drosophila-linjene og genotypene i Supplerende tabell 1–2.

Figure 6
Figur 6: Påføring av en ATP-analog på immobiliserte larvalhjerner under levende avbildning. (A) Live bildebehandling av to larvalhjerner som uttrykker Baz::GFP immobilisert på samme coverlip. Kulturmediet endres til en konsentrasjon på 10 μM av ATP-analogen 1-NAPP1 ved 0 min. Kontrollhjerner reagerer ikke synlig på ATP-analogen, mens hjerner som bærer en analog sensitiv mutasjon av aPKC (aPKCAS4) viser en sammentrekning av nevroepithelium (pilspisser) og lyse klynger av Baz i nevroblaster og deres avkom. Maksimal intensitetsprojeksjon på 33 skiver for en dybde på 23 μM. Skalastang: 20 μM. (B) Forstørrelse av nevroepitheliet. Skalalinje: 10 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Påføring av en ATP-analog på immobiliserte eggkamre under levende bildebehandling. Levende bilde av to ovarioles som uttrykker Baz::GFP immobilisert på samme coverlip. Kulturmediet endres til en konsentrasjon på 10 μM av ATP-analogen 1-NAPP1 ved 0 min. Kontroll eggkamre reagerer ikke synlig på ATP-analogen, mens eggkamre som bærer en analog sensitiv mutasjon av aPKC (aPKCAS4) viser en sammentrekning av epitelet (pilspisser) som til slutt fører til tilsynelatende sammenbrudd av festekryss. Maksimal intensitetsprojeksjon på 33 skiver for en dybde på 27 μM. Skalalinje: 20 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Måling av kortikale signaler ved hjelp av roterende linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast uttrykker Baz::GFP (grønn) og CD4::mIFP (rød). Cyan linjer: innledende skannelinjer sporet vinkelrett til ulike kortikale soner for å måle. Skalalinje: 5 μM. (B) Identifikasjon av cortex (mørk blå linje) ved hjelp av kortikale linjer og CD4::mIFP (rød) som referansekanal. Cyan linje: område definert av parameteren "Measure around" (her, 2 piksler), hvor signalet måles etter cortex deteksjon. Skalalinje: 2 μm. (C) Cyan: kortikale områder identifisert under en nevroblastdeling ved den roterende linescans-metoden fra de første skannelinjene som vises i (A), ved hjelp av CD4: : mIFP (rød) som referansekanal. Skalastang: 5 μM. Pil: apical pole. Pilspiss: basal stang. (D) Måling av Baz::GFP-signalintensiteten over tid i de to tilsvarende sonene identifisert av roterende linjekannere som vises i (C). Under mitose blir Baz::GFP forbigående beriket på nevroblåsens apikale pol og er utarmet fra motsatt basalstang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Anvendelse av medieutveksling på immobiliserte larvalhjerner under live bildebehandling for å legge til en inhibitor, presentert i figur 6, skalalinje: 20 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Påføring av medieutveksling på immobiliserte eggkamre under live bildebehandling for å legge til en inhibitor, presentert i figur 7, skalalinje: 20 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: Korrigering av lateral og fokusdrift ved hjelp av MultiHyperStackReg. Levende avbildning av en nevroblaster som uttrykker membransonden PH::GFP. Xy: enkelt fokusplan. Xz: ortogonal reslice. Venstre: før korreksjon av driften. Midten: etter korreksjon av lateral drift. Høyre: etter korreksjon side- og fokusdriften, skalalinje: 10 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 4: Deteksjon av cortex ved hjelp av roterende linecans, presentert i Figur 8, skalalinje: 5 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende tabell 1: Genotyper av avbildet Drosophila vev. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Opprinnelsen til transgenes som brukes. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Ekstra kodefil 1: Opprinnelsen til transgenes som brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra kodefil 2: Opprinnelsen til transgenes som brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra kodefil 3: Opprinnelsen til transgenes som brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Levende avbildning av hele fjellet D. melanogaster larvalhjerner gir mulighet til å observere asymmetriske nevrale stamcelledelinger under forhold nær en fysiologisk kontekst. Den første delen av vår protokoll introduserer vår tilnærming til disseksjon av larvalhjerner. Som allerede nevnt13, er et kritisk aspekt av preparatet å unngå å skade hjernen. Det mest utfordrende aspektet ved dette er å skille hjernen fra de nærliggende imaginale diskene uten å trekke for mye på hjernen. Vår tilnærming til å "kutte uten å trekke" er å utføre enten en slipebevegelse med spissene på ett par tang, eller å skyve en tangspiss langs to andre tangspisser som holder forbindelsen mellom vev (Figur 1A), mens Lerit et al. beskriver saglignende bevegelser med en dissekeringspinne. Vi anbefaler eksperimentet å prøve alle tilnærminger og å vedta den best egnede for seg selv. Vi foreslår også at du bruker BSA- eller FCS-belagte pipettespisser i stedet for disseksjonsverktøy for å overføre isolerte hjerner. Belegget forhindrer vev i å holde seg til plasten og tillater sikker overføring av vev mens de alltid holder dem helt nedsenket, uten å utsette dem for en mulig forbigående deformasjon når de holder seg til disseksjonsverktøyet under overføringen. Belagte tips har andre fordeler for å tillate overføring av flere hjerner samtidig, noe som er spesielt nyttig når det er viktig å kontrollere oppholdstiden til prøvene innenfor et bestemt medium; de er egnet for overføring av andre vev, selv skjøre som for eksempel fettlegemer; De kan romme et bredt spekter av forskjellige prøvestørrelser ved å bruke større spisser eller kutte ekstremiteten til spissen.

Deretter beskriver denne protokollen bruken av Fibrinogen koagulering for å immobilisere larvalhjerner på forsiden av en kulturrett. En hjerne er orientert innenfor en dråpe kulturmedium + Fibrinogen, hvorpå koagulering induseres ved tilsetning av Trombin. Fibrinformasjonen er gradvis, noe som gir et tidsvindu der retningen på prøven kan finjusteres, om nødvendig (Figur 2C). Hvis det er nødvendig med en liten kompresjon av prøven - som vi fraråder når det gjelder larvalhjerner - kan den også finjusteres ved å trykke på blodpropp mer eller mindre nær prøven i trinn 3.4.4 og 3.5.2. Den største fordelen med denne Fibrinogen koagulering over protokollen beskrevet i Lerit et al., der hjerner er montert mellom en gassgjennomtrengelig membran og en coverlip, er evnen til å erstatte kulturmediet under levende avbildning. En mulig fordel ved å bruke en gassgjennomtrengelig membran over vår protokoll kan være at den gir en optimal oksygenering av prøvene, noe som kan være mer begrenset med vår tilnærming ettersom hjernen er skilt fra luften av blodpropp og noe medium. Av denne grunn, selv om vi ikke vurderte effekten av mengden kulturmedium i kulturretten, foreslår vi å begrense mengden kulturmedium på toppen av blodproppene mens du holder blodproppene helt nedsenket.

Siden manipuleringen av blodproppene kan være eksperimentelt vanskelig og tidkrevende, anbefaler vi at eksperimentatoren først praktiserer å manipulere blodpropper uten prøver. Modulering av volumet av dråpen av kultur medium + Fibrinogen på dekslenelip, konsentrasjonen av Fibrinogen eller volumet og konsentrasjonen av Trombin kan bidra til å gjøre preparatet enklere og kan være viktig når du tilpasser protokollen til andre typer vev. Med nok erfaring til å manipulere blodproppene, kan flere hjerner immobiliseres i en blodpropp om nødvendig, selv om det kompliserer finjusteringen av orienteringen. Flere blodpropper kan dannes på dekslene, slik at for eksempel bildeprøver av forskjellige genotyper. Det er også mulig å eksponere forskjellige blodpropper på samme coverlip til forskjellige kulturmedier, selv om det må tas hensyn til aldri å blande dråper kulturmedium som dekker de forskjellige blodproppene. Når larvalhjerner er immobilisert og klare for levende avbildning, anbefaler vi å følge anbefalingene fra Lerit et al.13 for å unngå overdreven fotodamage. Vi legger bare til disse anbefalingene for ikke bare å opprettholde hjernen ved 25 °C under levende avbildning med en sceneinkubator, men også for å forvarme dette stadiet i minst 30 minutter før starten av avbildningen. I våre hender resulterer det systematisk i en sterk fokusdrift å unnlate å gjøre det.

Det kan være en fordel i noen sammenhenger å kunne utføre korrelert mikroskopi og fikse og immunostain en prøve etter levende avbildning. En begrensning ved bruk av Fibrin-blodpropper er imidlertid at det er nesten umulig å mekanisk isolere en hjerne fra en blodpropp uten å skade den. En mulig måte å overvinne denne begrensningen kan være å utvikle metoder for å forringe Fibrin-blodpropper med Plasmin eller å indusere blodpropp demontering ved å legge til et peptid som etterligner knottene som tillater Fibrin-polymerisering28. Vi bruker vanligvis Fibrin-blodpropper på prøver som spenner fra enkeltceller til 200 μM lange vev, men vi kan også lykkes med å immobilisere i blodpropper og bildehjerner fra voksne humle over 3 mm brede. Den øvre grensen for prøvestørrelsen som kan immobiliseres i blodpropper gjenstår å bestemme. På samme måte, selv om vi vanligvis ser for oss immobiliserte prøver i 4 til 5 timer, har vi med hell avbildet nevroblaster i primærkulturen i opptil 3 dager, noe som indikerer at blodpropp i det minste ikke forstyrrer langsiktig levedyktighet. Tvert imot kan blodpropper lette den vanlige utskiftingen av mediet, et krav om langsiktig avbildning, uten behov for enheter som peristaltiske pumper til dette formålet. Selv om vi ikke har målt permeabilitetsparametrene til fibrin-blodpropper, ser blodproppenes fibrøse gellignende natur ut til å være gjennomførbare av cellegjennomtrengelige molekyler. Vi fant ut at Latrunculin A, Colcemid eller 1-NAPP1, HALO-tag ligander og andre standardfarger som brukes i cellebiologi, når cellene i fibrin-blodpropp uten problemer og har så langt ikke møtt molekyler som vil bli beholdt av blodpropp, som imidlertid er en mulighet som må testes empirisk.

Til slutt gir bruk av Fibrin-blodpropper en pålitelig og relativt enkel å implementere en måte å immobilisere levende vev for levende avbildning. Utover sin nytte i å begrense lateral drifting, evnen til å endre kulturmediet under levende avbildning har vist seg uvurderlig for vår kjemiske genetikk tilnærming til å studere asymmetrisk celledeling av D. melanogaster neuroblaster21. Vi forventer at denne teknikken vil være gunstig for studier i et bredt spekter av forskjellige vev, spesielt hvis de involverer kjemisk genetikk eller for eksempel protein selvmerking29.

Vår MultiHyperStackReg makro er avhengig av TurboReg ImageJ plugin, som justerer etterfølgende rammer eller skiver av en stabel, og MultiStackReg ImageJ plugin, som gjør det mulig å bruke transformasjoner til andre stabler. MultiHyperStackReg gjør det ganske enkelt mulig å bruke disse transformasjonene på hyperstakker (stabler med minst fire dimensjoner). Ettersom bruken av MultiHyperStackReg, som vi beskriver det, krever mange handlinger og kan bli ganske tidkrevende, skrev vi også Makroen AutoHyperStackReg, som automatisk utfører alle trinnene som er beskrevet i trinn 6.2 og 6.3. Men i motsetning til MultiHyperStackReg mangler AutoHyperStackReg for øyeblikket muligheten til å beregne justeringen av en stabel basert på en underregion av denne stakken, et alternativ som vi fant noen ganger er avgjørende for en tilfredsstillende justering. En annen begrensning ved AutoHyperStackReg er at bruken er begrenset til oversettelser og ikke de andre transformasjonene foreslått av TurboReg og MultiStackReg, mens MultiHyperStackReg kan gjelde for en hyperstakk enhver transformasjonstype hvis brukeren trenger det. Fremtidige utgivelser vil implementere disse funksjonene og vil være tilgjengelige på GitHub30. Til slutt gir vår roterende linjer en enkel måte å raskt måle kortikale signaler i tidsforløp, selv om cortexen endrer sin posisjon eller orientering over tid. Hvorvidt sporingsmodusen eller ikke-sporingsmodusen er best egnet for analyse, avhenger av kvaliteten og konsistensen til det kortikale signalet. Sporingsmodusen er enklere å bruke, da brukeren ikke trenger å vurdere hvor cortex vil være for hvert tidspunkt og kan imøtekomme store endringer i posisjon og orientering over tid. Det er imidlertid bare egnet hvis det kortikale signalet forblir sterkt nok til deteksjon under hele filmen: manglende registrering av noe annet enn cortex (f.eks. et lyst cytoplasmisk rom nær cortex) kan kompromittere deteksjonen for hvert følgende tidspunkt (f.eks. det cytoplasmiske rommet beveger seg bort fra cortex og de kortikale linjene kan følge det resten av tiden bortfall). Ikke-sporingsmodusen har ikke denne fallgruven, da deteksjonen er begrenset til linjen som opprinnelig ble tegnet av brukeren (f.eks. et lyst cytoplasmisk rom kan føre til at deteksjonen mislykkes i noen få tidspunkter, men ettersom det cytoplasmiske rommet beveger seg bort fra deteksjonsområdet, fortsetter riktig deteksjon av cortex), men oppfører seg ikke bra hvis cortex-posisjonen eller orienteringen endres mye over tid. Den neste funksjonen (som vil være tilgjengelig på GitHub30) som skal utvikles for sporingsmodus, vil være alternativet for å bare analysere angitte tidspunkter og definere et referansetidspunkt (i stedet for det første tidspunktet) før og etter hvilken deteksjonen vil bli utført, noe som gjør at brukeren i det minste kan unngå problematiske tidspunkter.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet i Januschke-laboratoriet støttes av Wellcome trust grants 100031/Z/12/A og 1000032/Z/12/A. Vevsavbildningsanlegget støttes av tilskuddet WT101468 fra Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin bovine serum, BSA Merck 5470
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture Sigma F7524
Fibrinogen from human plasma Sigma F3879
FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well World Precision Instruments FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1) Merck Millipore 529579
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium Sigma S0146
Thrombin from bovine plasma Merck T4648

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
  2. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
  4. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
  5. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  6. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
  7. Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
  8. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
  9. Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
  10. Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
  11. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  12. Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  13. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  14. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  15. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
  16. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
  17. Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
  18. Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
  19. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  20. Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
  21. Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
  22. Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
  23. Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
  24. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
  27. Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
  28. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
  29. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  30. Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 166 levende bildebehandling fibrin clot Drosophila kultur medium utveksling ImageJ makro
Anvendelser av Immobilisering av <em>Drosophila</em> Tissues med Fibrin Clots for Live Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Januschke, J., Loyer, N.… More

Januschke, J., Loyer, N. Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61954, doi:10.3791/61954 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter