Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Anvendelse af immobilisering af Drosophila Tissues med Fibrin Blodpropper til Live Imaging

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61954
Automatic Translation
1, 1
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

Summary

Denne protokol beskriver anvendelser af prøve immobilisering ved hjælp af Fibrin blodpropper, begrænse drivende, og tillader tilsætning og udvaskning af reagenser under levende billeddannelse. Prøver overføres til en dråbe Fibrinogen, der indeholder dyrkningsmedium på overfladen af en coverlip, hvorefter polymerisering induceres ved at tilsætte thrombin.

Abstract

Drosophila er et vigtigt modelsystem til at studere en lang række biologiske spørgsmål. Forskellige organer og væv fra forskellige udviklingsstadier af fluen, såsom imaginaale diske, larvehjernen eller ægkamrene hos voksne kvinder eller voksen tarmen kan udvindes og opbevares i kultur til billeddannelse med time-lapse mikroskopi, hvilket giver værdifuld indsigt i celle- og udviklingsbiologi. Her beskriver vi i detaljer vores nuværende protokol for dissektion af Drosophila larve hjerner, og derefter præsentere vores nuværende tilgang til immobilisering og orientering larve hjerner og andet væv på et glas coverlip ved hjælp af Fibrin blodpropper. Denne immobiliseringsmetode kræver kun tilsætning af Fibrinogen og Thrombin til kulturmediet. Det er velegnet til høj opløsning tid bortfalder billeddannelse på omvendte mikroskoper af flere prøver i samme kultur parabol, minimerer lateral drifting ofte forårsaget af bevægelser af mikroskop fase i multi-punkts besøger mikroskopi og giver mulighed for tilsætning og fjernelse af reagenser i løbet af billeddannelse. Vi præsenterer også specialfremstillede makroer, som vi rutinemæssigt bruger til at korrigere for drifting og til at udtrække og behandle specifikke kvantitative oplysninger fra time-lapse-analyse.

Introduction

Drosophila er fortsat et vigtigt modelsystem til at studere en lang række biologiske spørgsmål og har udmærket sig i at fremme viden inden for mange discipliner i årtier. En funktion, der får det til at skille sig særligt ud, er, at det er særligt velegnet til live billedbehandling. Evnen til at overvåge subcellulære processer eller adfærd af celler og væv i realtid fortsætter med at bidrage til at generere nøglebegreber, der er relevante for celle- og udviklingsbiologi. Mange succesfulde protokoller er blevet udviklet af forskellige grupper til at opretholde sådanne Drosophila prøver i live og sunde til at studere adfærd prøven og fluorescerende molekyler lever. Organer og væv fra fluen, såsom imaginaale diske1,2, larvehjernen3,4,5,6eller ægkamre af voksne kvinder7,8,9eller den voksne tarm10 for eksempel kan udvindes og holdes i kultur til billeddannelse med time-lapse mikroskopi. En vigtig udfordring for live billedbehandling er at sikre, at prøven holdes tæt på billedfladen for optimal opløsning og immobil uden at gå på kompromis med prøveintegriteten, der kan være følsom over for mekaniske påvirkninger. At studere neurale stamceller, kaldet neuroblaster eller neuroner i Drosophila larve hjernen, for eksempel, at holde prøver tæt på billeddannelse overfladen kan opnås ved at dække dem med kultur medier i forseglede billeddannelsekamre 11,12,13. Denne tilgang tillader dog ikke let medieudveksling og begrænser dermed eksperimentelle manøvrerum. Alternativt kan prøver fremstilles og placeres på coverslips behandlet for at øge vedhæftning af celler og tillade multi-point besøgende mikroskopi og udvidet levende celle billeddannelse i åben kultur retter, der potentielt tillader medieudveksling, men giver ikke nemme midler til at forhindre prøve drift eller tab under medieudveksling14,15.

Fibrin-koagulationsmetoden, der oprindeligt blev udviklet til at studere meiose hos levende kranflue spermatocytter16, er specielt egnet til at overvinde disse problemer. Fibrinogen opløses i det relevante dyrkningsmedium, prøverne placeres og orienteres i en dråbe af denne opløsning på et passende glasoverfladebilledkammer, før Thrombin tilsættes, hvilket resulterer i hurtig dannelse af en uopløselig Fibrin-blodprop, et klæbrigt fibernet, der klæber til glasoverfladen og prøverne, samtidig med at prøvens adgang til kulturmediet sikres. Mediet kan derefter udskiftes uden at forstyrre blodproppen eller prøvepositionen. Kulturmediumudveksling under billeddannelse er f.eks. ønskelig, når der skal tilføjes hæmmere som i den oprindelige metode eller til udvasknings- eller pulsjagtforsøg, eller når der skal tilsættes fluorescerende farvestoffer under levende cellebilleddannelse, samtidig med at celler og væv holdes på plads. Fibrin blodpropper er velegnede til billeddannelse af Drosophila væv samt individuelle celler13,17. Fibrin blodpropper kan yderligere bruges til at hjælpe orientere prøver, at på grund af deres form eller andre egenskaber normalt ikke ville være orienteret på den ønskede måde ved at modulere prøvepositionen inden for Fibrin-koagulationen og selve blodproppens form.

Her leverer vi en opdatering på vores nuværende Fibrin-koagulationsbaserede billeddannelsesmetoder og leverer værktøjer til segmenteringsbaseret billedanalyse og fokuserer på brugen af denne metode til at studere neuroblastdivisioner i den udviklende fluehjerne. Vi bruger rutinemæssigt Fibrin-blodpropmetoden til at følge flere prøver i forskellige blodpropper i den samme kulturret. Dette gør det muligt i) billeddannelse af subcellulære hændelser såsom centrafæringsadfærd eller mRNA-lokalisering live18,19, ii) overvågning af prøvernes opførsel ved farmakologisk behandling af forskellige genotyper under de samme billedindstillinger ved hjælp af multipunktbesøg mikroskopi20, iii) undersøgelse af virkningerne af akut hæmning af enzymer21 og iv) minimering af drifting for at undersøge ændringer i retningen af celledeling af celler i deres fysiologiske miljø ved målrettet laserabsorption22. Mens uønskede virkninger af Thrombin og Fibrinogen og Fibrin-blodproppen skal testes empirisk for hver prøve, denne metode er i princippet egnet til at immobilisere enhver type prøve, der skal analyseres ved levende cellebilleddannelse, og i Drosophila er med succes blevet brugt til at studere flere aspekter af neuroblasterbiologi5,19,20, men også dynamikken i cytosensorprojektioner af kvindelige kimlinjestamceller23 og ændringer i polaritet ved akut aPKC-hæmning af follikelceller i Drosophila kvindelige ægkamre21.

Time-lapse fluorescerende billeddannelse resulterer i generering af komplekse tidsløste 3D-datasæt, der kræver metoder til at udtrække disse kvantitative oplysninger. Her beskriver vi vores videre udvikling af ImageJ-baserede24 makroer, der kan bruges til at korrigere for drifting i hyperstacks og specialfremstillede ImageJ makroer, der tillader semi-automatiseret kvantificering af multi-kanal fluorescens på cell cortex udviklet til at kvantificere kortikale proteiner i neuroblaster af Drosophila larve hjerner eller af individuelle neuroblasts i primær celle kultur.

Protocol

1. Tilberedning af reagenser

BEMÆRK: Alle trin i denne protokol, medmindre andet er forklaret, udføres ved stuetemperatur.

  1. For at forberede en opløsning på 1x PBS-BSA (0,1% w/v) opløses 1 mg kvægserumalbumin (BSA) i 1 ml PBS. For at forberede en stamopløsning på Thrombin 1.000enheder·mL -1opløses 1.000 thrombinenheder i 1 ml PBS-BSA (0,1% w/v). Der fremstilles aliquots på 10 μL og opbevares ved -20 °C i op til 4 måneder.
  2. For at forberede kulturmediet til Drosophila hjerner opløses 1 g glukose i 1 L af Schneiders medium under sterile forhold. Filtreres og opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
  3. For at forberede Fibrinogenopløsningen opløses 10 mg Fibrinogen i 1 ml dyrkningsmedium i 20 minutter ved stuetemperatur eller 5 min ved 37 °C.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes et andet kulturmedium end det, der blev udarbejdet på trin 1.2, og Fibrin-blodpropper allerede dannes på dette trin, indeholder kulturmediet sandsynligvis aktiv Thrombin, som skal inaktiveres på forhånd. En sandsynlig kilde til Thrombin er føtalt kvægserum, som kan inaktiveres ved opvarmning af serumet til 56 °C i 30 min.
  4. For at forberede en overfladebehandlingsopløsning af PBS-BSA (5% w/v) opløses 50 mg Kvægserumalbumin (BSA) i 1 ml 1x PBS.
  5. For det eksempel reagens, der anvendes i trin 4, skal der fremstilles en stamopløsning på 10 mM NAPP1 ved at opløse 1 mg NAPP1 i 315 μL Dimethylsulfoxid.

2. Dissektion af Drosophila larve hjerner

BEMÆRK: Udfør dette trin under en dissektionsbeholder.

  1. Brug en børste til at overføre L3 larver til en 9-brønd borosilikat glas skål, der indeholder PBS. Rør for at løsne det meste af fluemaden fra larverne og overføre til et andet godt indeholdende kulturmedium.
  2. Brug tang (f.eks. Dumont #55) til at gribe en larve over hele dens diameter midt i kroppens længde (se figur 1A,B). Mens larven tilbageholdes, overføres den til en anden brønd af borosilikatpladen, der indeholder 200 μL friskkulturmedium.
  3. Larven må ikke slippes. For at skære larven i halvdelen over hele diameteren (Figur 1B), skal du enten slibe det greb område med sideværts bevægelse af tangspidserne (Figur 1A, øverste panel) eller skubbe en spids af et andet par pincet mellem de to tangspidser, der holder larven (Figur 1A, bundpanel). Skær ikke larven midt over ved at trække i en af dens ekstremiteter, da det kan skade hjernen ved at trække på den via nerverne, der krydser kropslængden (røde linjer i figur 1B).
  4. Brug pincet til at holde larven ved sin kutikula og et andet par pincet til at skrælle fra hinanden neglebåndet uden at trække på hjernen (Figur 1C). Gentag indtil nerverne stammer fra hjernen er synlige, og de organer, der forbinder hjernen til munden dele kan tilgås som vist i figur 1D.
  5. Brug pincet til at holde nerverne stammer fra hjernen. Med det andet par pincet skal du bruge en af de teknikker, der er vist i figur 1A, til at skære forbindelsen mellem hjernen til munddelene og adskille hjernen fra resten af neglebåndet (Figur 1D).
  6. Brug pincet til at holde hjernen ved axoner, der kommer ud af ventral nerve ledningen. Pluk organerne afbildet i gråt i figur 1E ved forsigtigt at trække dem væk fra hjernen.
    BEMÆRK: Træk ikke på øjen-/antenne-imaginalskiverne (mørkegul) for at fjerne dem fra hjernen. Forbindelsen mellem disse væv er for robust til at blive brudt ved at trække uden at beskadige hjernen.
  7. Mens du stadig greb nerverne til at holde og orientere hjernen, forstå forbindelsen mellem øjet / antenne imaginal diske (mørkegul) og hjernen med de andre par pincet (Figur 1F). Brug en af de teknikker, der er vist i figur 1A, til at afbryde denne forbindelse uden at trække i hjernen. Kontroller, om hjernen er korrekt renset for andet væv (Figur 1G) og ikke beskadiget (Figur 1H). Kassér hjernen, hvis den viser tegn på skade.
  8. Pipetter belægningsopløsningen med en P20 ind og ud for at belægge pipettespidsen. Pipette hjernen med den belagte spids sammen med 3 μL medium (Figur 2A, venstre) og pipette det ud i en anden brønd, der indeholder 200 μL af ren kultur medium.
  9. Gentag trin 2.2-2.8, indtil der er dissekeret nok hjerner, og udspil lejlighedsvis kulturmediet for den brønd, hvor dissektionerne udføres.

Figure 1
Figur 1: Dissektion af D. melanogaster larvehjerner. (A)Teknik til skæring uden at trække ved hjælp af pincet. Prøven (lysegrøn) kan skæres ved at blive malet mellem tangspidserne (øverste panel) eller ved at køre en spids af et par tangspidser langs spidsen af et par pincet, der holder prøven (nederste panel). (B–F) Trin til isolering af larvehjernen uden at beskadige den (se tekst). Rød: hjerne. Mørkegul: øjen-/antennedisketter. Blå tekst: handlinger, der skal udføres med de tilsvarende pincet. (G) Udseende af en isoleret hjerne uden synlige skader. D er den dorsale side, og V er den ventrale side på sidevisningen. (H) Almindelige skader forårsaget af overdrevent at trække i hjernen under dissektionen. Øverste panel: løsrivelse af ventral nerve ledningen. Nederste panel: deformation af en lap. Posterior er venstre og forreste er lige i alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Immobilisering på coverslip med Fibrin blodpropper

BEMÆRK: Udfør dette trin under en dissektionsbeholder.

  1. Brug en P20-pipette med en belagt spids som i trin 2.8 til at overføre de dissekerede hjerner til en anden brønd af borosilikatpladen, der indeholder 200 μL dyrkningsmedium + Fibrinogen (Figur 2A).
  2. Pipette i en hjerne sammen med 9 μL kultur medium + Fibrinogen. Med enden af spidsen næsten rører dækslet glas bunden af en 35 mm celle kultur parabol, pipette ud indholdet (kultur medium og hjernen), hvilket gør kulturen medium røre coverlip umiddelbart efter spændende pipette spidsen, så hjernen og mediet ikke glider til siderne af spidsen, potentielt skader hjernen (Figur 2A).
  3. Brug en spids af et par pincet eller et lukket par pincet til forsigtigt at skubbe og placere hjernen i kulturmediet + Fibrinogen drop.
    BEMÆRK: Berøring af dråben med et åbent par pincet kan resultere i, at kulturmediet trækkes af kapillaritet mellem tangspidserne (Figur 2B).
  4. Hvis den ventrale del af hjernen skal afbildes, fremkalde Fibrinogen koagulation som følger for korrekt orientering af hjernen i blodprop (Figur 2C).
    1. Skub hjernen til den ene side af dråben. Med en P1 pipette udstyret med en P1 spids, pipette 1 μL Thrombin løsning, røre ved kanten af dråben på den modsatte side af hjernen med pipette spids, og pipette ud Thrombin (Figur 2C, første tegning).
    2. Vent i 1-2 minutter på, at Fibrinogen begynder at polymerisere, hvilket resulterer i dannelsen af et overskyet bundfald på den ene side af dråben (Figur 2C, anden tegning). Skub forsigtigt og "tuck" hjernen ind i Fibrin-blodproppen, og sørg for, at delen til billedet (f.eks. ventralsiden) er så tæt som muligt på coverlipet uden at deformere hjernen(Figur 2C, tredje tegning).
    3. Pipetter 1 μL Thrombin-opløsning ud tæt på den side af hjernen, der ikke er gemt i Fibrin-blodproppen. (Figur 2C, fjerde tegning).
    4. Vent i 2-3 min. på, at den anden Fibrin-blodprop indstilles (Figur 2C, femte tegning). Tryk på kanterne af blodprop for at gøre det klæber stærkere til coverslip, passe på ikke at deformere hjernen(Figur 2C, sjette og syvende tegninger). Hvis hjernen ser ud til at være for langt fra coverlip, bringe det tættere ved at trykke på Fibrin blodprop tæt på hjernen.
  5. Hvis den dorsale del af hjernen skal afbildes, fremkalde Fibrin koagulation som følger (Figur 2D).
    1. Placer hjernen i midten af dråben, dorsal del står over for coverslip. Med en P10 pipette udstyret med en tynd spids, pipette 1 μL Thrombin løsning, røre ved kanten af dråben på den modsatte side af hjernen med pipette spids, og pipette ud Thrombin (Figur 2D, første tegning).
    2. Vent i 2-3 minutter på, at Fibrinogen begynder at polymerisere, hvilket resulterer i dannelsen af et overskyet, fibrøst bundfald (Figur 2D, anden tegning). Tryk på kanterne af blodproppen for at få den til at klæbe stærkere til coverlipet, og pas på ikke at deformere hjernen (Figur 2D, tredje og fjerde tegning).
  6. Gentag trin 3.1-3.5, hvis flere blodpropprøver skal immobiliseres på coverlipet.
  7. Med enden af spidsen placeret ca. 0,5 cm over blodproppen(erne) pipetteres forsigtigt 390 μL kulturmedium uden Fibrinogen dropwise oven på blodproppen(erne) (Figur 2B, højre petriskål). Tilsæt ikke dyrkningsmediet på siderne af koagulationen, da det kan løsne det fra coverlipet.
  8. For at vaske den resterende Thrombin ud skal du bruge en pipette til at fjerne 300 μl af kulturmediet og tilføje 300 μl rent kulturmedium, så det sikres, at blodpropperne forbliver helt nedsænket. Gentag to gange for at vaske overskydende Thrombin ud.

Figure 2
Figur 2: Immobilisering af en Drosophila larve hjerne ved hjælp af Fibrin blodpropper. (A) Ved hjælp af en BSA-belagt Pipettespids overføres hjerner fra kulturmediet (gul) til et dyrkningsmedium + Fibrinogen-opløsning (orange), hvorefter de pipetteres på coverlipet (lyseblå) af en kulturskål sammen med 3,5 μL kulturmedium + Fibrinogen. Fibrinogenpropper fremkaldes ved tilsætning af Thrombin for at immobilisere hjerner i dorsal eller ventral position (se D og E). De sikrede hjerner i blodpropperne er efterfølgende dækket af kulturmedie uden Fibrinogen, og overskydende thrombin fjernes ved at tilføje og fjerne kulturmedie tre gange. (B) Hjernens position i dråben af dyrkningsmediet + Fibrinogen (orange) på coverlipet bør kun justeres ved forsigtigt at skubbe den med spidsen af et lukket par pincet eller kun en tangspids. Berøring af dråben med på åbent par pincet kan resultere i, at kulturmediet bliver trukket af kapillaritet mellem tangspidserne. (C) Trin til placering af larvehjernen til billeddannelse af ventralsiden (se tekst). (D) Trin til placering af larvehjernen til billeddannelse af dorsalsiden (se tekst). I (D) og (E), grøn: Thrombin. Mørk orange: fibrin blodprop. Lyseblå: coverlip. Blå pile: kanterne af blodprop, der skal skubbes mod coverlip at stabilisere blodprop. Klik her for at se en større version af dette tal.

4. Tilsætning af reagenser under levende billeddannelse

  1. For at undgå temperaturændringer, der forårsager fokusændringer, skal opløsningen med reagenserne tilsættes til kulturretten ved samme temperatur som selve kulturretten for at bringe den til samme temperatur, før du tilføjer den. Hvis der anvendes et miljøkammer, skal opløsningen efterlades i kammeret.
  2. Fjern låget på kulturretten uden at fortrænge selve kulturretten. For lettere fjernelse skal låget på 35 mm skålen vende på hovedet oven på skålen før billedbehandling.
  3. Med en P1000-pipette skal du placere pipettespidsen tæt på overfladen af kulturmediet inde i kulturretten og forsigtigt frigive den tilstrækkelige mængde reagensopløsning på den for at nå den ønskede reagenskoncentration (f.eks. 400 μL af en opløsning på 20 μM NAPP1 på 400 μL kulturmedium for en endelig koncentration på 10 μM NAPP1) , uden at generere stærke fluxes, der kan løsne blodpropper.
  4. For at homogenisere opløsningen i kulturretten skal du bruge en P200-pipette til langsomt at pipette en lille mængde af opløsningen ind og ud fem gange (f.eks. 150 μL for et volumen på 800 μL i skålen).
  5. Udskift låget oven på kulturretten uden at fortrænge selve kulturretten og genoptage billeddannelsen.

5. Udvaskning af reagenser under levende billeddannelse

  1. Før udvaskningen skal vaskeopløsningen holdes ved samme temperatur som kulturskålen.
  2. Fjern låget på kulturretten uden at fortrænge selve kulturretten.
  3. Med en P200- eller P1000-pipette skal du langsomt fjerne noget kulturmedium fra kulturretten uden at udsætte toppen af blodproppen (f.eks. fjerne 600 μL fra 800 μL kulturmedium i skålen).
  4. For at fortynde reagenset med en P1000-pipette skal du placere pipettespidsen tæt på overfladen af kulturmediet inde i dyrkningsskålen og langsomt slippe vaskeopløsningen (f.eks. tilsættes 1 ml vaskeopløsning til 200 μL kulturmediet tilbage i skålen for en fortyndingsfaktor på 6).
  5. Gentag trin 5.3 og 5.4, indtil reagenset fortyndes efter behov (f.eks. vil yderligere tre lignende runder resultere i en fortyndingsfaktor på 1296, hvilket reducerer den oprindelige koncentration på 10 μM NAPP1 til 7,7 nM).
  6. Udskift låget oven på kulturretten uden at fortrænge selve kulturretten og genoptage billeddannelsen.

6. Korrektion af xyz drivende på tridimensionale og / eller multikanal tidsforskydninger

  1. præparation
    1. Hent og installer ImageJ24. Download TurboReg25 og MultiStackReg26 plugins og placere dem inde i plugins mappe ImageJ.
    2. Hent makroerne MultiHyperStackReg (Supplerende kodningsfil 1) og AutoHyperStackReg ImageJ (Supplerende kodningsfil 2). Hvis du vil installere en makro, skal du enten placere .ijm-filen i mappen ImageJ eller føje indholdet af .ijm-filen til filen ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
    3. På ImageJ skal du åbne en time-lapse-film med flere skiver og/eller flere kanaler (fremover benævnt "hyperstack", Figur 3A,4A). Hvis tidsforskydningen kun omfatter ét udsnit og én kanal, kan justeringen udføres direkte ved hjælp af MultiStackReg.
  2. Rettelse af sideafdrift ved hjælp af MultiHyperStackReg
    1. Beslut, hvilken kanal og/eller skive af hyperstacken der skal bruges som reference til justering. Hvis du vil generere en referencestak med én kanal, et udsnit (fremover kaldet "referencestak"), skal du klikke på Billede | Dublet..., markér afkrydsningsfeltet Dupliker hyperstack, skriv det relevante kanalnummer i Kanaler (c): (f.eks. erstat 1-2 med 1) og/eller det relevante kanalnummer i Udsnit (z): (f.eks. erstat 1-15 med 8), og sørg for, at Rammer: (t) indeholder alle rammer (f.eks. 1-50), før du klikker på OK (Figur 3B).
    2. Alternativt til trin 6.2.1, hvis en projektion af flere udsnit foretrækkes for referencestakken med én kanal med ét udsnit, skal du klikke på Billede | Stakke | Z-projekt..., skal du markere de første og sidste udsnit og projektionstypen, sikre, at Alle tidsrammer er markeret, og klikke på OK. Hvis tidsforskydningen har flere kanaler, skal du enten slette de irrelevante kanaler (Image | Stakke | Slet udsnit) fra den resulterende projektion, eller dupliker den valgte referencekanal (Image | Dublet) (Figur 3B).
    3. Du kan også beskære referencestakken, så den kun bruger én del som billede som reference, ved at vælge rektangelværktøjet på værktøjslinjen, spore et rektangel over interesseområdet og klikke på Billede | Beskær.
    4. For at starte MultiStackReg skal du klikke på Plugins | Registrering | MultiStackReg. I pop op-menuen Stack 1:skal du vælge navnet på den enkanals stak med ét udsnit, der blev genereret i de forrige trin. Vælg Oversættelse i pop op-menuen Transformation:, vælg Oversættelse; Markér afkrydsningsfeltet Gem transformationsfil, og ignorer alle de andre felter.
      BEMÆRK: Andre former for transformation (se25).
    5. Klik på OK. Vælg en placering og et navn, hvor justeringsfilen skal gemmes, og klik på Gem. Vent på, at rammerne holder op med at bevæge sig automatisk i referencestakvinduet, hvilket angiver, at registreringen er (Figur 3B).
    6. Kontroller referencestakken for at se, om justeringen er tilfredsstillende. Hvis ikke, skal du gentage trin 6.2.1-6.2.5 med et andet referenceudsnit, kanal og/eller beskæring. Luk referencestakken.
    7. Marker hyperstack-vinduet, og kør makroen MultiHyperStackReg. Vælg den transformationsfil, der blev oprettet i trin 6.2.5, og klik på Åbn. Vent på, at justeringen anvendes på hver kanal og/eller skive af hyperstacken, hvorefter et nyt vindue med suffikset "_aligned" åbnes (Figur 3C).
  3. Korrektion af fokusdrift ved hjælp af MultiHyperStackReg
    1. Klik på Billede | Egenskaber..., kopier den værdi, der vises i Pixelbredde. Hvis du vil ortogonalt reslice den ene kanals hyperstack med en afstand på en pixel, skal du klikke på Billede | Stakke | Reslice [/]..., skal du indsætte pixelbreddeværdien i outputafstanden: numerisk felt; Vælg Øverst i pop op-menuen Start ved: Pop op, sæt kryds Undgå interpolation, og klik på OK.
      BEMÆRK: Hvis hukommelsen skal frigøres på ImageJ, kan hyperstacken lukkes efter reslikviet.
    2. Vælg det nye vindue, der genereres af reslice (fremover benævnt "resliced hyperstack", Figur 4B). Hvis den resliced hyperstack har flere kanaler, skal du vælge en referencekanal for at udføre justeringen og slette de andre kanaler ved at markere dem i kanalrullepanelet. klik på Billede | Stakke | Slet udsnit, vælg Kanal i pop op-menuen Slet aktuel , og klik på OK.
    3. Generer en resliced hyperstack med en enkelt skive (fremover kaldet "resliced reference stack"), enten ved at duplikere en enkelt skive af den resliced hyperstack (se trin 6.2.1) eller ved at projicere flere skiver af den resliced hyperstack (se trin 6.2.2) (Figur 4C).
    4. Du kan også beskære den resliced referencestak for kun at bruge én del som reference som reference (se trin 6.2.3).
    5. Udfør billedregistreringen på den reslikerede referencestak med MutiStackReg (se trin 6.2.4-6.2.6) (Figur 4C).
    6. Marker det resliced hyperstack-vindue, og kør makroen MultiHyperStackReg. Vælg den transformationsfil, der blev oprettet i trin 6.3.5, klik på Åbn, og vent på, at justeringen anvendes på alle kanaler og/eller udsnit af hyperstacken, hvorefter et nyt vindue med suffikset "_aligned" åbnes (fremover benævnt "resliced reference stack", Figur 4D). Luk den oprindelige resliced hyperstack.
    7. Hvis du vil konvertere den resliced justerede hyperstack til xy-visningen af den oprindelige hyperstack, skal du klikke på Stakke | Reslice [/]..., vælg Top i pop op-menuen Start ved: pop op, sæt kryds Undgå interpolation, og klik på OK. Når et nyt vindue med den endelige fokusjusterede hyperstack åbnes (Figur 4E), skal du lukke den resliced justerede hyperstack.
  4. Hvis du automatisk vil rette den laterale drift og fokusdrift, skal du køre makroen AutoHyperStackReg. Vælg referencekanalen, hvis det er relevant, og om den laterale og/eller fokuseringsdrift skal rettes. Klik på OK.

Figure 3
Figur 3: Pipeline til korrektion af sideværts drift med MultiHyperstackReg. (A) Lateral og fokus driver kan observeres på en hyperstack, der indeholder flere skiver og tidspunkter. (B) En enkelt skive, enkelt kanal reference stak genereres fra hyperstack, enten ved duplikering eller Z projektion. Referencestakken justeres af MultiStackReg-plug-in'en og genererer en justeringsfil. (C) Makroen MultiHyperstackReg bruges til at anvende justeringsfilen på hyperstacken, hvilket resulterer i en justeret hyperstack, som sideværts afdriften korrigeres for. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Pipeline til korrektion af fokusdrift med MultiHyperstackReg. (A) Fokus driver kan observeres på en hyperstack, der indeholder flere skiver og tidspunkter. (B) Hyperstack er ortogonalt resliced fra toppen, langs hver linje af pixels langs Y-aksen, uden interpolation. Dette resulterer i en resliced hyperstack indeholder de samme oplysninger som hyperstack, med sin y og z koordinater skiftet. Fokus drift (i z) af den oprindelige hyperstack opstår som en afdrift i y på den resliced hyperstack. (C) Der genereres en enkelt skive, en enkelt kanals resliced referencestak fra den resliced hyperstack, enten ved duplikering eller Z-projektion. Den resliced reference stak er justeret af MultiStackReg plugin, generere en justering fil. (D) Makroen MultiHyperstackReg bruges til at anvende justeringsfilen på den resliced hyperstack, hvilket resulterer i en justeret resliced hyperstack, for hvilken fokus afdriften (i y) korrigeres. (E) En anden ortogonal reslikvie genopretter de oprindelige koordinater af hyperstack, som nu ikke længere præsenterer et fokus drift (i z). Klik her for at se en større version af dette tal.

7. Kortikal signalmåling med roterende linecans

  1. Hent makroen Roterende Linescans ImageJ (Supplerende kodningsfil 3).
  2. Åbn en tidsforskydning i ImageJ. Placer rammerullepanelet til den første ramme, og placer i tilfælde af, at tidsforskydningen indeholder flere udsnit, rullepanelet for udsnit til det udsnit, som signalet måles på.
  3. Sporingstilstand
    1. Vælg det lineære værktøj på værktøjslinjen. Spor en linje hen over den kortikale zone, der skal måles (Figur 5A), og sørg for, at linjen er nogenlunde vinkelret på cortex, og at linjen er lang nok til at krydse cortex på hvert næste tidspunkt(Figur 5B, første og andet panel).
    2. Dobbeltklik på linjeværktøjsikonet på værktøjslinjen for at åbne vinduet Stregbredde. Forøg bredden af linjen så meget som nødvendigt, mens skæringspunktet mellem linjen og cortex en lige linje(Figur 5B, tredje panel).
    3. Start makroen Roterende linescans. Angiv rotationsområdet (Figur 5E) til en lav værdi (ca. 10°), hvis retningen af den kortikale zone, der skal måles, ikke ændrer meget fra det ene tidspunkt til det næste. Indstil værdien målpunkt omkring til 0 pixel for kun at måle signalet på den linje, hvor den maksimale signalintensitet registreres, eller til højere værdier for også at måle signalet omkring denne linje.
      BEMÆRK: Måleværdien Omkring påvirker kun signalmålingen efter påvisning af cortex og påvirker ikke selve detektionen.
    4. På pop op-menuen Find Cortex på kanal: Vælg den kanal, hvor registreringen skal udføres. Hvis du vil visualisere, hvor cortex er blevet opdaget ved hvert tidspunkt, skal du holde afkrydsningsfeltet Skærmplacering... afkrydset (anbefales). Hold afkrydsningsfeltet Nyere og nyorientering markeret. Klik på OK.
    5. Når status for Udført, Kopieret til Udklipsholder vises i imagej-vinduets status, skal du rulle gennem tidsforskydningen for at kontrollere, om de fundne cortexpositioner (gul overlejring) og det målte område (cyan overlay) er tilfredsstillende. Hvis ikke, skal du gentage trin 7.3.1-7.3.4 med en anden linjeplacering, længde eller bredde og forskellige indstillinger i vinduet Roterende linescans- indstillinger.
    6. Indsæt målingerne i en regnearkssoftware.
      BEMÆRK: Kolonner svarer til kanaler i rækkefølge efter deres udseende i tidsforskydningen, og linjerne svarer til rammer.
  4. Ikke-sporingstilstand
    1. Vælg det lineære værktøj på værktøjslinjen. Spor en linje (angivet i cyan, Figur 5A) over den kortikale zone, der skal måles, og sørg for, at linjen er nogenlunde vinkelret på cortex, og at linjen er lang nok til at krydse cortex på hvert tidspunkt (Figur 5C, første og andet panel).
    2. Dobbeltklik på linjeværktøjsikonet på værktøjslinjen for at åbne vinduet Stregbredde. Forøg bredden af linjen så meget som nødvendigt, mens skæringspunktet mellem linjen og cortex en lige linje(Figur 5C, tredje panel).
    3. Start makroen Roterende linescans. Angiv rotationsområdet (Figur 5E) i overensstemmelse hermed med de retningsændringer i kortikale zoner, der skal måles i hele tidsforskydningen. Indstil værdien målpunkt omkring til 0 pixel for kun at måle signalet på den linje, hvor den maksimale signalintensitet registreres, eller til højere værdier for også at måle signalet omkring denne linje.
      BEMÆRK: Måleværdien Omkring påvirker kun signalmålingen efter påvisning af cortex og påvirker ikke selve detektionen.
    4. På pop op-menuen Find Cortex på kanal: Vælg den kanal, hvor registreringen skal udføres. Hvis du vil visualisere, hvor cortex er blevet opdaget ved hvert tidspunkt, skal du holde afkrydsningsfeltet Vis positioner... markeret (anbefales). Fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet Nyere og Nyorientering. Klik på OK.
  5. Når det er gjort, vises resultater, der er kopieret til Udklipsholder, i ImageJ-vinduesstatus, og rul gennem tidsforskydningen for at kontrollere, om de fundne cortexpositioner (gul overlejring) og det målte område (cyan overlay) er tilfredsstillende. Hvis ikke, skal du gentage de forrige trin med en anden linjeplacering, -længde eller -bredde og forskellige indstillinger i vinduet Roterende linescans-indstillinger.
  6. Indsæt målingerne i en regnearkssoftware.
    BEMÆRK: Kolonner svarer til kanaler i rækkefølge efter deres udseende i tidsforskydningen, og linjerne svarer til rammer.

Figure 5
Figur 5: Måling af kortikalt signal med roterende linecan. (A) En linje (cyan) spores vinkelret på cortex (sort), hvor signalet måles. Forskellige gråtoner viser cellepositionen ændre sig over tre tidspunkter (t1, t2, t3). (B) Venstre: korrekt placering af linjen i sporingstilstand. Midt: forkert placering af linjen i sporingstilstand, da der ikke er nogen overlapning med cortex ved næste tidspunkt. Højre: alt for bred linje resulterer i krydset (orange linje) mellem cortex og linjen ikke er lige. (C) Venstre: korrekt placering af linjen i ikke-sporingstilstand. Midt: forkert placering af linjen i ikke-sporingstilstand, da der ikke er nogen overlapning med cortex på hvert tidspunkt. Højre: alt for bred linje resulterer i krydset (orange linje) mellem cortex og linjen ikke er lige. (D) Længde og bredde på scanningslinjen. (E) Linecans udføres inden for en række retninger omkring den oprindelige retning, der er vist i (D) defineret af parameteren "rotationsområde", med et interval, der er defineret af parameteren "rotationstrin". (F) Ikke-optimal retning af scanningslinjen i forhold til cortex, hvilket resulterer i et lavt signal målt langs linjen. (G) Den optimale retning af linjen defineres som den, der resulterer i den højeste top af signalintensitet målt langs linjen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

Immobilisering af Drosophila væv med Fibrin blodpropper og kultur medium udveksling under levende billeddannelse.
Efter at være blevet dissekeret efter proceduren i trin 2 (Figur 1) og immobiliseret i Fibrin-blodpropper på samme coverlip efter proceduren i trin 3 (Figur 2), blev larvehjerner, der udtrykker GFP-mærket Bazooka (Baz::GFP), flue orthologen af polaritetsproteinet Par-3, afbildet i 30 minutter i time-lapse multi-position confocal imaging. Baz::GFP kombineres med apkcas4, en allel, der tillader akut hæmning af atypisk protein kinase C (aPKC) gennem tilsætning af den lille ATP analog 1-NAPP120. 1-NAPP1 blev derfor føjet til kulturmediet efter proceduren i trin 4, og live imaging blev genoptaget i 2,5 timer. Kontrol hjerner transporterer en vild-type version af kinase aPKC reagerede ikke på ATP analog, mens hjerner transporterer desuden en analog-følsom mutation af aPKC (apkcas4) viste en sammentrækning af neuroepithelium og lyse klynger af Baz i neuroblaster og deres afkom ( Figur6, Video 1). Neuroblaster holder på dividere hele time-lapse, hvilket tyder på, at vævet forbliver sundt, og hjerner viser lidt drift på trods af kultur medium forandring, hvilket tyder på, at de er godt immobiliseret. På samme måde blev ovarioler, der udtrykker Baz::GFP, efter at være blevet dissekeret efter den procedure, der blev fremlagt i27, immobiliseret i fibrin-blodpropper på samme coverlip og afbildet i 8 minutter, hvorefter anvendelsen af 1-NAPP1 fremkaldte sammentrækningen af apkcas4 mutant follikulære celler, men ikke af kontroller (Figur 7, Video 2).

Rettelse af sideværts og fokus afdrift ved hjælp af MultiHyperstackReg.
En hyperstack, der viser både lateral og fokus drift (Video 3, venstre panel) blev først korrigeret for lateral drift (trin 6.2, Figur 3, Video 3, midterste panel), derefter fokusere drift (trin 6.3, Figur 4, Video 3, højre panel) ved hjælp af MultiStackReg plugin og MultiHyperstackReg makro, hvilket resulterer i en betydelig reduktion af bevægelser observeret i den oprindelige hyperstack.

Kortikal signalmåling ved hjælp af roterende linecans
En neuroblast udtrykke Baz::GFP (grøn) og transmembrane protein CD4 mærket med en infrarød fluorescerende protein (CD4::mIFP, rød) blev afbildet under en mitose. CD4::mIFP-signalet blev brugt som reference til at detektere cortex i forskellige dele af neuroblasten med linecans (trin 7, Figur 5, Figur 8A-C) og Baz::GFP-signalet blev målt ved de fundne positioner Figur 8D). Under deres division polariserede neuroblaster forbigående ved at etablere forskellige og modsatte kortikale domæner: den apikale pol og den basale pol. Baz definerer den apikale pol, og konsekvent steg Baz::GFP-signalet ved neuroblasterens apikale pol og faldt ved basalstangen under divisionen (Figur 8C, D). Placeringen af cortex blev tilfredsstillende sporet i hele time-lapse(Figur 8C, Video 4). Der henvises til Drosophila-linjerne og genotyperne i supplerende tabel 1-2.

Figure 6
Figur 6: Anvendelse af en ATP-analog på immobiliserede larvehjerner under levende billeddannelse. (A) Levende billeddannelse af to larvehjerner, der udtrykker Baz::GFP immobiliseret på samme coverlip. Dyrkningsmediet ændres til en koncentration på 10 μM af ATP analog 1-NAPP1 ved 0 min. Kontrolhjerner reagerer ikke synligt på ATP-analogen, mens hjerner, der bærer en analog følsom mutation af aPKC (aPKCAS4), viser en sammentrækning af neuroepithelium (pilespidser) og lyse klynger af Baz i neuroblaster og deres afkom. Maksimal intensitetsprojektion på 33 skiver for en dybde på 23 μM. Skalastang: 20 μM. (B) Forstørrelse af neuroepithelium. Skalalinje: 10 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Anvendelse af en ATP-analog på immobiliserede ægkamre under levende billeddannelse. Live billeddannelse af to ovarioler udtrykke Baz:: GFP immobiliseret på samme coverslip. Dyrkningsmediet ændres til en koncentration på 10 μM af ATP analog 1-NAPP1 ved 0 min. Kontrolægkamre reagerer ikke synligt på ATP-analogen, mens ægkamre med en analog følsom mutation af aPKC (aPKCAS4) viser en sammentrækning af epitelet (pilespidserne), hvilket i sidste ende fører til den tilsyneladende nedbrydning af klæbekryds. Maksimal intensitetsfremskrivning på 33 skiver for en dybde på 27 μM. Skalabjælke: 20 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Måling af det kortikale signal ved hjælp af roterende linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast udtrykke Baz::GFP (grøn) og CD4::mIFP (rød). Cyan linjer: indledende scanning linjer spores vinkelret på forskellige kortikale zoner til at måle. Skalalinje: 5 μM. (B) Identifikation af cortex (mørkeblå linje) ved hjælp af kortikale linecans og CD4::mIFP (rød) som referencekanal. Cyan linje: område defineret af "Mål omkring" parameter (her, 2 pixels), hvor signalet måles efter cortex detektion. Skalalinje: 2 μm. (C) Cyan: kortikale områder identificeret under en neuroblastdivision ved hjælp af den roterende linecans-metode fra de indledende scanningslinjer, der vises i (A), ved hjælp af CD4::mIFP (rød) som referencekanal. Skalabjælke: 5 μM. Pil: apikale stang. Pilespids: basal stang. (D) Måling af Baz::GFP-signalintensiteten over tid i de to tilsvarende zoner, der identificeres ved roterende linecans, der vises i (C). Under mitose bliver Baz::GFP forbigående beriget ved neuroblasterens apikale pol og er udtømt fra den modsatte basalstang. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Anvendelse af medieudveksling på immobiliserede larvehjerner under live billeddannelse for at tilføje en hæmmer, præsenteret i figur 6, skalabjælke: 20 μm. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Anvendelse af medieudveksling på immobiliserede ægkamre under live billeddannelse for at tilføje en hæmmer, præsenteret i figur 7, skalabjælke: 20 μm. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Korrektion af sideværts og fokus drift ved hjælp af MultiHyperStackReg. Levende billeddannelse af en neuroblast, der udtrykker membransonden PH::GFP. Xy: enkelt brændplan. Xz: ortogonal reslice. Til venstre: før korrektion af afdriften. Midt: efter korrektion af sideafdriften. Til højre: Efter korrektion af sideværts og fokus drift, skala bar: 10 μm. Klik her for at downloade denne video.

Video 4: Påvisning af cortex ved hjælp af roterende linecans, præsenteret i figur 8, skala bar: 5 μm. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende tabel 1: Genotyper af afbildede Drosophila væv. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Oprindelsen af de anvendte transgener. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende kodningsfil 1: Oprindelsen af de anvendte transgener. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: Oprindelsen af de anvendte transgener. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende kodningsfil 3: Oprindelsen af de anvendte transgener. Klik her for at hente denne fil.

Discussion

Live billeddannelse af hele mount D. melanogaster larve hjerner giver mulighed for at observere asymmetriske neurale stamceller divisioner i forhold tæt på en fysiologisk sammenhæng. Den første del af vores protokol introducerer vores tilgang til dissektion af larvehjerner. Som allerede nævnt13, et kritisk aspekt af præparatet er at undgå at beskadige hjernen. Det mest udfordrende aspekt af dette er at adskille hjernen fra de nærliggende tænkelige diske uden at trække overdrevent på hjernen. Vores tilgang til "skæring uden at trække" er at udføre enten en slibning bevægelse med spidsen af et par pincet, eller at skubbe en pincet tips langs to andre pincet tips holde forbindelsen mellem væv (Figur 1A), mens Lerit et al. beskrive sav-lignende bevægelser med en dissekering pin. Vi råder eksperimentatoren til at prøve alle tilgange og til at vedtage den bedst egnede til sig selv. Vi foreslår også at bruge BSA- eller FCS-belagte pipettespidser i stedet for dissektionsværktøjer til at overføre isolerede hjerner. Belægningen forhindrer væv i at klæbe til plasten og tillader sikker overførsel af væv, mens de altid holder dem helt nedsænket uden at udsætte dem for en mulig forbigående deformation, når de klæber til dissektionsværktøjet under overførslen. Coatede tips har andre fordele ved at tillade overførsel af flere hjerner på én gang, hvilket er særligt nyttigt, når det er afgørende at kontrollere prøvernes opholdstid inden for et bestemt medium; de er egnede til overførsel af andet væv, selv skrøbelige, som for eksempel fedtlegemer; de kan rumme en lang række forskellige stikprøvestørrelser ved hjælp af større spidser eller skære spidsens ekstremitet.

Dernæst beskriver denne protokol brugen af Fibrinogen-koagulation til at immobilisere larvehjerner på coverlip af en kulturret. En hjerne er orienteret inden for en dråbe kultur medium + Fibrinogen, hvorefter koagulation er induceret ved tilsætning af Thrombin. Fibrindannelsen sker gradvist, hvilket giver et tidsvindue, hvor prøvens retning om nødvendigt kan finjusteres (Figur 2C). Hvis der er behov for en let kompression af prøven - hvilket vi fraråder i tilfælde af larvehjerner - kan den også justeres fint ved at trykke på blodproppen mere eller mindre tæt på prøven under trin 3.4.4 og 3.5.2. Den største fordel ved denne Fibrinogen-koagulation i forhold til den protokol, der er beskrevet i Lerit et al., hvor hjerner er monteret mellem en gasgennemtrængelig membran og en coverlip, er evnen til at erstatte kulturmediet under levende billeddannelse. En mulig fordel ved at bruge en gas gennemtrængelig membran over vores protokol kunne være, at det giver en optimal iltning af prøverne, som kunne være mere begrænset med vores tilgang som hjerner er adskilt fra luften af blodprop og nogle medium. Af denne grund, selvom vi ikke vurderede effekten af mængden af kulturmedie inden for kulturretten, foreslår vi at begrænse mængden af kulturmedie oven på blodproppene, mens vi holder blodproppene helt nedsænket.

Da manipulation af blodpropper kan være eksperimentelt vanskelige og tidskrævende, anbefaler vi, at eksperimentatoren først praksis manipulere blodpropper uden prøver. Graduering af volumenet af dråben af dyrkningsmedie + Fibrinogen på coverslip, koncentrationen af Fibrinogen eller mængden og koncentrationen af Thrombin kan bidrage til at gøre præparatet lettere og kan være vigtigt, når protokollen tilpasses andre typer væv. Med tilstrækkelig erfaring med at manipulere blodpropperne kan flere hjerner immobiliseres i en blodprop, hvis det er nødvendigt, selvom det komplicerer finjusteringen af orienteringen. Der kan dannes flere blodpropper på coverlipet, hvilket f.eks. gør det muligt at afbilde prøver af forskellige genotyper. Det er også muligt at udsætte forskellige blodpropper på samme coverlip til forskellige kultur medier, selv om man skal passe på aldrig at blande dråber af kultur medium, der dækker de forskellige blodpropper. Når larvehjerner er immobiliseret og klar til live billeddannelse, anbefaler vi at følge anbefalingerne fra Lerit et al.13 for at undgå overdreven fotodamage. Vi tilføjer kun disse anbefalinger for ikke kun at opretholde hjernen ved 25 °C under levende billeddannelse med en sceneinkubator, men også for at forvarme dette stadium i mindst 30 minutter før billeddannelsens start. I vores hænder, ikke at gøre det systematisk resulterer i en stærk fokus drift.

Det kan være en fordel i nogle sammenhænge at være i stand til at udføre korreleret mikroskopi og fastsætte og immunplet en prøve efter levende billeddannelse. Men en begrænsning af at bruge Fibrin blodpropper er, at det er næsten umuligt at mekanisk isolere en hjerne fra en blodprop uden at beskadige den. En mulig måde at overvinde denne begrænsning kunne være at udvikle metoder til at nedbryde Fibrin blodpropper med Plasmin eller at fremkalde blodprop demontering ved tilsætning af en peptid efterligne knapperne tillader Fibrin polymerisering28. Vi bruger typisk Fibrin-blodpropper på prøver fra enkeltceller til 200 μM lange væv, men vi kunne også med succes immobilisere i blodpropper og billedhjerner fra voksne humlebier over 3 mm brede. Den øvre grænse for prøvestørrelsen, der kan immobiliseres i blodpropper, er endnu ikke fastlagt. Tilsvarende, selvom vi normalt billede immobiliserede prøver i 4 til 5 timer, har vi med succes afbildet neuroblaster i primærkulturen i op til 3 dage, hvilket indikerer, at blodproppen i det mindste ikke forstyrrer levedygtigheden på længere sigt. Tværtimod kan blodpropper lette den regelmæssige udskiftning af mediet, et krav om længerevarende billeddannelse, uden behov for enheder som peristaltiske pumper til dette formål. Selv om vi ikke har målt permeabilitet parametre fibrin blodpropper, den fiber gel-lignende karakter af blodpropper synes at være gennemtrængelig af celle gennemtrængelige molekyler. Vi fandt, at Latrunculin A, Colcemid eller 1-NAPP1, HALO-tag ligands og andre standard farvestoffer, der anvendes i cellebiologi nå cellerne i fibrin blodprop uden problemer og har hidtil ikke stødt på molekyler, der ville blive bevaret af blodprop, som dog er en mulighed, der skal empirisk testet.

Afslutningsvis, ved hjælp af Fibrin blodpropper giver en pålidelig og relativt let at gennemføre en måde at immobilisere levende væv til levende billeddannelse. Ud over dets anvendelighed til at begrænse lateral drifting har evnen til at ændre kulturmediet under live billeddannelse vist sig uvurderlig for vores kemiske genetik tilgang til at studere den asymmetriske celledeling af D. melanogaster neuroblaster21. Vi forventer, at denne teknik vil være gavnlig for undersøgelser i en lang række forskellige væv, især hvis de involverer kemisk genetik eller for eksempel protein selvmærkning29.

Vores MultiHyperStackReg makro er afhængig af TurboReg ImageJ plugin, som justerer successive rammer eller skiver af en stak, og MultiStackReg ImageJ plugin, som gør det muligt at anvende transformationer til andre stakke. MultiHyperStackReg gør det ganske enkelt muligt at anvende disse transformationer på hyperstacks (stakke med mindst fire dimensioner). Da brugen af MultiHyperStackReg, som vi beskriver det, kræver mange handlinger og kan blive ret tidskrævende, skrev vi også Makroen AutoHyperStackReg, som automatisk udfører alle de trin, der er beskrevet i trin 6.2 og 6.3. I modsætning til MultiHyperStackReg mangler AutoHyperStackReg i øjeblikket muligheden for at beregne justeringen af en stak baseret på et underområde af denne stak, en mulighed, som vi fandt, er undertiden afgørende for en tilfredsstillende justering. En anden begrænsning af AutoHyperStackReg er, at dens anvendelse er begrænset til oversættelser og ikke de andre transformationer foreslået af TurboReg og MultiStackReg, mens MultiHyperStackReg kan gælde for en hyperstack enhver transformationstype, hvis brugeren har brug for det. Fremtidige udgivelser implementerer disse funktioner og vil være tilgængelige på GitHub30. Endelig giver vores roterende linescan makro en nem måde til hurtigt at måle kortikale signaler i tidsforskydninger, selvom cortex ændrer sin position eller orientering over tid. Om dens sporingstilstand eller dens ikke-sporingstilstand er bedst egnet til analyse afhænger af kvaliteten og konsistensen af det kortikale signal. Sporingstilstanden er lettere at bruge, da brugeren ikke behøver at overveje, hvor cortex vil være for hvert tidspunkt og kan rumme store ændringer af position og orientering over tid. Det er dog kun egnet, hvis det kortikale signal forbliver stærkt nok til detektion under hele filmen: en manglende detektering af andet end cortex (f.eks. et lyst cytoplasmisk rum tæt på cortex) kan kompromittere detektionen for hvert efterfølgende tidspunkt (f.eks. bevæger det cytoplasmiske rum sig væk fra cortex, og de kortikale linjer kan følge det resten af tiden bortfalder). Ikke-sporingstilstanden har ikke denne faldgrube, da detektionen er begrænset til den linje, der oprindeligt blev trukket af brugeren (f.eks. kan et lyst cytoplasmisk rum forårsage, at detektionen mislykkes i et par tidspunkter, men da det cytoplasmiske rum bevæger sig væk fra detektionszonen, genoptages korrekt detektion af cortex), men opfører sig ikke godt, hvis cortexpositionen eller orienteringen ændres meget over tid. Den næste funktion (som vil være tilgængelig på GitHub30), der skal udvikles til sporingstilstanden, vil være muligheden for kun at analysere angivne tidspunkter og definere et referencetidspunktspunkt (i stedet for det første tidspunkt), før hvilket og efter hvilket registreringen udføres, hvilket giver brugeren mulighed for i det mindste at undgå problematiske tidspunkter.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Arbejdet i Januschke laboratoriet er støttet af Wellcome trust tilskud 100031/Z/12/A og 1000032/Z/12/A. Vævsscanningsfaciliteten understøttes af bevillingen WT101468 fra Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin bovine serum, BSA Merck 5470
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture Sigma F7524
Fibrinogen from human plasma Sigma F3879
FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well World Precision Instruments FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1) Merck Millipore 529579
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium Sigma S0146
Thrombin from bovine plasma Merck T4648

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
  2. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
  4. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
  5. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  6. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
  7. Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
  8. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
  9. Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
  10. Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
  11. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  12. Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  13. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  14. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  15. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
  16. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
  17. Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
  18. Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
  19. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  20. Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
  21. Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
  22. Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
  23. Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
  24. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
  27. Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
  28. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
  29. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  30. Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).

Tags

Udviklingsmæssige Biologi levende billeddannelse fibrin blodprop Drosophila kultur medium udveksling ImageJ makro
Anvendelse af immobilisering af <em>Drosophila</em> Tissues med Fibrin Blodpropper til Live Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Januschke, J., Loyer, N.… More

Januschke, J., Loyer, N. Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61954, doi:10.3791/61954 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter