Summary
Detta protokoll beskriver tillämpningar av prov immobilisering med fibrin blodproppar, begränsa drifting och tillåta tillägg och washout av reagenser under levande imaging. Prover överförs till en droppe Fibrinogen som innehåller odlingsmedium på ytan av ett täckglas, varefter polymerisation induceras genom tillsats av trombin.
Abstract
Drosophila är ett viktigt modellsystem för att studera ett brett spektrum av biologiska frågor. Olika organ och vävnader från olika utvecklingsstadier i flugan såsom imaginala skivor, larvhjärnan eller äggkamrarna hos vuxna honor eller den vuxna tarmen kan extraheras och hållas i kultur för avbildning med timelapsemikroskopi, vilket ger värdefulla insikter i cell- och utvecklingsbiologi. Här beskriver vi i detalj vårt nuvarande protokoll för dissekering av Drosophila larv hjärnor, och sedan presentera vår nuvarande strategi för immobilisering och orientering larv hjärnor och andra vävnader på ett glaslock med Fibrin blodproppar. Denna immobiliseringsmetod kräver endast tillsats av Fibrinogen och trombin till odlingsmediet. Den är lämplig för högupplöst tidsfördröjningsavbildning på inverterade mikroskop av flera prover i samma odlingsskål, minimerar sidodriften som ofta orsakas av rörelser i mikroskopstadiet i flerpunktsbesökande mikroskopi och möjliggör tillsats och avlägsnande av reagenser under avbildningen. Vi presenterar också skräddarsydda makron som vi rutinmässigt använder för att korrigera för drifting och för att extrahera och bearbeta specifik kvantitativ information från timelapse-analys.
Introduction
Drosophila fortsätter att vara ett viktigt modellsystem för att studera ett brett spektrum av biologiska frågor och har utmärkt sig för att främja kunskap inom många discipliner i årtionden. En funktion som gör att den sticker ut är att den är särskilt väl lämpad för live-avbildning. Förmågan att övervaka subcellulära processer eller beteendet hos celler och vävnader i realtid fortsätter att bidra till att generera nyckelbegrepp som är relevanta för cell- och utvecklingsbiologi. Många framgångsrika protokoll har utvecklats av olika grupper för att upprätthålla sådana Drosophila-prover levande och friska för att studera beteendet hos provet och fluorescerande molekyler lever. Organ och vävnader från flugan som imaginala skivor1,2,larvhjärnan3,4,5,6eller äggkammare av vuxna kvinnor7,8,9, eller den vuxnatarmen 10 till exempel kan extraheras och hållas i kultur för avbildning med time-lapse mikroskopi. En viktig utmaning för levande avbildning är att säkerställa att provet hålls nära bildytan för optimal upplösning och orörlig utan att äventyra provintegriteten som kan vara känslig för mekaniska stötar. Att studera neurala stamceller, så kallade neuroblaster eller nervceller i Drosophila larvhjärnan, till exempel, att hålla prover nära avbildningsytan kan uppnås genom att täcka dem med odlingsmedia i förseglade bildkammare11,12,13. Detta tillvägagångssätt tillåter dock inte lätt medieutbyte, vilket begränsar experimentellt manöverutrymme. Alternativt kan prover beredas och placeras på täckglas som behandlas för att öka vidhäftningen av celler och tillåta flerpunktsbesökande mikroskopi och utökad livecellavbildning i öppna odlingsrätter, som potentiellt möjliggör medieutbyte, men inte ger enkla medel för att förhindra provdrift eller förlust under medieutbyte14,15.
Fibrin clot-metoden som ursprungligen utvecklades för att studera meios i levande kranfluga spermatocyter16 är speciellt lämpad för att övervinna dessa problem. Fibrinogen löses upp i relevant odlingsmedium, proverna placeras och orienteras i en droppe av denna lösning på en tillräcklig glasyta avbildningskammare innan trombin tillsätts, vilket resulterar i snabb bildning av en olöslig Fibrin blodpropp, ett klibbigt fibröst nät som klibbar på glasytan och proverna samtidigt som provets tillgång till odlingsmediet säkerställs. Mediet kan sedan bytas ut utan att proppen eller provpositionen störs. Kulturmediumutbyte vid avbildning är till exempel önskvärt när inhibitorer ska tillsättas som i den ursprungliga metoden eller för att tvätta ut eller pulsera jaktförsök eller när fluorescerande färgämnen ska tillsättas under levande cellavbildning samtidigt som celler och vävnader finns på plats. Fibrin blodproppar är lämpliga för avbildning av Drosophila vävnader samt enskilda celler13,17. Fibrinproppar kan vidare användas för att hjälpa orientera prover, att på grund av deras form eller andra egenskaper normalt inte skulle vara orienterade på önskat sätt genom att modulera provpositionen inom Fibrin-proppen och formen på själva proppen.
Här ger vi en uppdatering om våra nuvarande Fibrin proppbaserade bildmetoder och tillhandahåller verktyg för segmenteringsbaserad bildanalys och fokuserar på användningen av denna metod för att studera neuroblastavdelningar i den utvecklande flughjärnan. Vi använder rutinmässigt Fibrin clot-metoden för att följa flera prover i olika blodproppar i samma odlingsfat. Detta möjliggör i) avbildning av subcellulära händelser som centrrosombeteende eller mRNA-lokalisering live18,19, ii) övervakning av beteendet hos prover vid farmakologisk behandling av olika genotyper under samma avbildningsinställningar med hjälp av flerpunktsbesök mikroskopi20, iii) studera effekterna av akut hämning avenzymer 21 och iv) minimera drifting för att studera förändringar i orienteringen av celldelning av celler i deras fysiologiska miljö vid riktad laserablation22. Medan oönskade effekter av trombin och fibrinogen och fibrinproppen måste testas empiriskt för varje prov, Denna metod är i princip lämplig för att immobilisera alla typer av prov som ska analyseras genom levande cellavbildning och i Drosophila har framgångsrikt använts för att studera flera aspekter av neuroblastbiologi5,19,20, men också dynamiken i cytosensorprojektioner av kvinnliga könslinjestamceller23 och förändringar i polaritet vid akut aPKC-hämning av follikelceller i Drosophila kvinnliga äggkammare21.
Tidsfördröjning fluorescerande avbildning resulterar i generering av komplexa tids lösta 3D-data uppsättningar som kräver metoder för att extrahera denna kvantitativa information. Här beskriver vi vår vidareutveckling av ImageJ-baserade24 makron som kan användas för att korrigera för drifting i hyperstacks och skräddarsydda ImageJ-makron som möjliggör halvautomatisk kvantifiering av flerkanals fluorescens vid cellbarken utvecklad för att kvantifiera närproteiner i neuroblaster i Drosophila larvhjärnor eller av enskilda neuroblaster i primärcellskulturen.
Protocol
1. Beredning av reagenser
OBS: Alla steg i detta protokoll om inget annat förklaras utförs vid rumstemperatur.
- Lös upp 1 mg bovint serumalbumin (BSA) i 1 ml PBS för att bereda en lösning på 1x PBS-BSA (0,1 % w/v). För att förbereda en stamlösning av trombin 1 000 enheter·mL-1,lös upp 1 000 enheter trombin i 1 ml PBS-BSA (0,1% w/v). Gör alikvoter på 10 μL och förvara vid -20 °C i upp till 4 månader.
- För att förbereda odlingsmediet för Drosophila-hjärnor, lös upp 1 g glukos i 1 L av Schneiders medium under sterila förhållanden. Filtrera och förvara vid 4 °C i upp till 3 månader.
- För att förbereda Fibrinogen-lösningen, lös upp 10 mg Fibrinogen i 1 ml odlingsmedium i 20 min vid rumstemperatur eller 5 min vid 37 °C.
OBS: Om ett annat odlingsmedium än det som bereds i steg 1.2 används och Fibrin-blodproppar redan bildas i detta steg, innehåller odlingsmediet sannolikt aktiv trombin, som måste inaktiveras i förväg. En trolig källa till trombin är fetala nötkreatursserum, som kan inaktiveras genom uppvärmning av serumet till 56 °C i 30 min. - För att förbereda en beläggningslösning av PBS-BSA (5% w/v), lös upp 50 mg bovint serumalbumin (BSA) i 1 ml 1x PBS.
- Till exempel reagens som används i steg 4, förbered en stamlösning på 10 mM NAPP1 genom att lösa upp 1 mg NAPP1 i 315 μL Dimetylsulfoxid.
2. Dissekering av Drosophila larv hjärnor
OBS: Utför det här steget under en dissekeringskärlek.
- Använd en borborste för att överföra L3-larver till en 9-brunns borosilikatglasform som innehåller PBS. Rör om för att lossa det mesta av flugmaten från larverna och överför till en annan brunn som innehåller odlingsmedium.
- Använd tång (t.ex. Dumont #55) för att greppa en larva över hela diametern, mitt i kroppslängden (se figur 1A,B). Medan du håller larven, överför den till en annan brunn av borosilikatplattan som innehåller 200 μL färskt odlingsmedium.
- Släpp inte larven. För att skära larven i hälften över hela diametern(figur 1B),slipa antingen det räfflade området med sidorörelser av tångspetsarna(figur 1A,övre panelen) eller skjut en spets av ett annat par tångspetsar mellan de två tångspetsarna som håller larven(figur 1A, bottenpanelen). Skär inte larven i hälften genom att dra i en av dess extremiteter, eftersom det kan skada hjärnan genom att dra på den via nerverna som korsar kroppslängden (röda linjer i figur 1B).
- Använd tång för att hålla larven i nagelbandet och ytterligare ett par tångar för att skala isär nagelbandet utan att dra i hjärnan (Figur 1C). Upprepa tills nerverna som kommer från hjärnan är synliga och organen som förbinder hjärnan med mundelarna kan nås enligt figur 1D.
- Använd tång för att hålla nerverna som kommer från hjärnan. Med det andra tångparet, använd någon av teknikerna som visas i figur 1A för att klippa anslutningen mellan hjärnan till mundelarna och separera hjärnan från resten av nagelbandet ( Figur1D).
- Använd tång för att hålla hjärnan vid axonerna som kommer ut ur ventrala nervsladden. Plocka organen avbildade i grått i figur 1E genom att försiktigt dra bort dem från hjärnan.
OBS: Dra inte i ögon-/antennens imaginala skivor (mörkgula) för att lossa dem från hjärnan. Kopplingen mellan dessa vävnader är för robust för att brytas genom att dra utan att skada hjärnan. - Medan du fortfarande griper tag i nerverna för att hålla och orientera hjärnan, ta tag i kopplingen mellan ögon/ antenn imaginala skivor (mörkgul) och hjärnan med det andra paret tång (Figur 1F). Använd någon av de tekniker som visas i figur 1A för att klippa denna anslutning utan att dra i hjärnan. Kontrollera om hjärnan är korrekt rensad från andra vävnader (figur 1G) och inte skadad (figur 1H). Kassera hjärnan om den visar tecken på skada.
- Pipett beläggningslösningen med en P20 in och ut för att täcka pipettspetsen. Pipett hjärnan med den belagda spetsen tillsammans med 3 μL medium (Figur 2A, vänster) och pipett det ut i en annan brunn som innehåller 200 μL rent odlingsmedium.
- Upprepa steg 2.2–2.8 tills tillräckligt många hjärnor dissekeras, vilket ibland ersätter odlingsmediet i brunnen där dissekeringarna utförs.
Figur 1: Dissekering av D. melanogaster larvhjärnor. (A)Teknik för skärning utan att dra med tång. Provet (ljusgrönt) kan skäras genom att slipas mellan tångspetsarna (övre panelen) eller genom att köra en spets av ett par tångspetsar längs spetsarna på ett par tångar som håller provet (nedre panelen). (B–F) Steg för att isolera larvhjärnan utan att skada den (se text). Röd: hjärna. Mörkgul: ögon-/antennskivor. Blå text: åtgärder som ska utföras med motsvarande tång. (G)Utseende av en isolerad hjärna utan synliga skador. D är den dorsala sidan och V är den ventrala sidan på sidovyn. (H) Vanliga skador som orsakas av att man drar i hjärnan för mycket under dissekeringen. Övre panel: lossning av ventrala nerv sladden. Nedre panelen: deformation av en lob. Posterior är vänster och främre är rätt i alla paneler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
3. Immobilisering på täckslip med fibrinproppar
OBS: Utför det här steget under en dissekeringskärlek.
- Använd en P20-pipett med bestruken spets som i steg 2.8 för att överföra de dissekerade hjärnorna till en annan brunn på borosilikatplattan som innehåller 200 μL odlingsmedium + Fibrinogen (Figur 2A).
- Pipett i en hjärna tillsammans med 9 μL odlingsmedium + Fibrinogen. Med slutet av spetsen nästan röra täckglasets botten av en 35 mm cellkulturrätt, pipett ut innehållet (odlingsmediet och hjärnan) vilket gör kulturmediet vidrör täckglaset omedelbart efter att pipettspetsen har lämnats så att hjärnan och mediet inte glider till sidorna av spetsen, vilket potentiellt skadar hjärnan (Figur 2A).
- Använd en spets av ett par tångar eller ett slutet par tång för att försiktigt trycka och placera hjärnan inom odlingsmediet + Fibrinogen droppe.
OBS: Om du vidrör droppen med ett öppet par tångar kan det leda till att odlingsmediet dras av kapilläriteten mellan tångspetsarna (Figur 2B). - Om den ventrala delen av hjärnan måste avbildas, inducera Fibrinogen koagulering enligt följande för att korrekt orientera hjärnan i proppen (Figur 2C).
- Tryck hjärnan åt sidan av droppen. Med en P1-pipett utrustad med P1-spets, pipett 1 μL trombinlösning, rör vid kanten av droppen på motsatt sida av hjärnan med pipettspetsen och pipetten ut i trombinet (Figur 2C, första ritningen).
- Vänta i 1-2 min tills Fibrinogen börjar polymerisera, vilket resulterar i bildandet av en grumlig fällning på ena sidan av droppen (Figur 2C, andra ritning). Tryck försiktigt och "stoppa" in hjärnan i Fibrin-proppen och se till att delen till bilden (t.ex. ventralsidan) är så nära täckglaset som möjligt utan att deformera hjärnan (Figur 2C, tredje ritningen).
- Pipett ut 1 μL trombinlösning nära sidan av hjärnan inte instoppad i Fibrin-proppen. (Figur 2C,fjärde ritningen).
- Vänta i 2–3 min tills den andra Fibrin-proppen är inställd (Bild 2C, femte dragningen). Tryck på kanterna på proppen för att få den att klibba starkare på täckglaset, var försiktig så att du inte deformerar hjärnan (Figur 2C, sjätte och sjunde ritningarna). Om hjärnan verkar vara för långt från täcket, för den närmare genom att trycka fibrinproppen nära hjärnan.
- Om den dorsala delen av hjärnan måste avbildas, inducera Fibrin koagulering enligt följande (Figur 2D).
- Placera hjärnan i mitten av droppen, dorsal del vänd mot täcket. Med en P10-pipett utrustad med en tunn spets, pipett 1 μL trombinlösning, rör vid kanten av droppen på motsatt sida av hjärnan med pipettspetsen och pipetten ut trombinet (Figur 2D, första ritningen).
- Vänta i 2-3 min tills Fibrinogen börjar polymerisera, vilket resulterar i bildandet av en grumlig, fibrös fällning (Figur 2D, andra ritning). Tryck på kanterna på proppen för att få den att hålla sig starkare på täckglaset, var försiktig så att du inte deformerar hjärnan (Figur 2D, tredje och fjärde ritningarna).
- Upprepa steg 3.1–3.5 om flera proppprover måste immobiliseras på täcket.
- Med spetsens ände placerad ca 0,5 cm över proppen(erna), varsamt pipett 390 μL odlingsmedium utan Fibrinogen droppe på toppen av proppen(erna) (Bild 2B, höger Petri skål). Tillsätt inte odlingsmediet på sidorna av proppen eftersom det kan lossa det från täckglaset.
- För att tvätta bort den återstående trombin, använd en pipett för att ta bort 300 μl av odlingsmediet och tillsätt 300 μl rent odlingsmedium, se till att blodpropparna förblir helt nedsänkta. Upprepa två gånger för att tvätta bort överflödig trombin.
Figur 2: Immobilisering av en Drosophila larvhjärna med fibrinska blodproppar. (A) Med hjälp av en BSA-belagd pipettspets överförs hjärnor från odlingsmediet (gult) till ett odlingsmedium + Fibrinogenlösning (orange), sedan rört på täckglaset (ljusblått) i en odlingsfat tillsammans med 3,5 μL odlingsmedium + Fibrinogen. Fibrinogen koagulering induceras genom tillsats av trombin för att immobilisera hjärnor i dorsala eller ventrala läge (se D och E). De säkrade hjärnorna i blodpropparna är därefter täckta av odlingsmedium utan Fibrinogen och överskott av trombin avlägsnas genom att tillsätta och ta bort odlingsmedium tre gånger. (B) Hjärnans position inom droppen av odlingsmedium + Fibrinogen (orange) på täckglaset bör endast justeras genom att försiktigt trycka den med spetsen på ett slutet tångpar, eller endast en tångspets. Att röra droppen med på öppet par tångar kan resultera i att odlingsmediet dras av kapillritet mellan tångspetsarna. C)Steg för placering av larvhjärnan för avbildning av ventralsidan (se text). (D) Steg för placering av larvhjärnan för avbildning av den dorsala sidan (se text). I( D) och (E), grön: Trombin. Mörkorange: Fibrinpropp. Ljusblå: täckslip. Blå pilar: kanter på proppen som ska skjutas mot täckplattan för att stabilisera proppen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
4. Tillsats av reagenser under levande avbildning
- För att undvika temperaturförändringar som orsakar förändringar i fokus, håll lösningen med reagenserna som ska läggas till odlingsskålen vid samma temperatur som själva kulturskålen för att få den till samma temperatur innan du lägger till den. Om en miljökammare används, lämna lösningen i kammaren.
- Ta bort locket på kulturrätten utan att förskjuta själva kulturrätten. För enklare borttagning, placera locket på 35 mm skålen upp och ner ovanpå skålen före avbildning.
- Med en P1000-pipett placerar du pipettspetsen nära ytan på odlingsmediet inuti odlingsfatet och släpper försiktigt ut tillräcklig volym reagenslösning på den för att uppnå önskad reagenskoncentration (t.ex. 400 μL av en lösning på 20 μM NAPP1 på 400 μL odlingsmedium för en slutlig koncentration på 10 μM NAPP1) , utan att generera starka flödet som kan lossa blodpropparna.
- För att homogenisera lösningen i odlingsskålen, använd en P200-pipett för att långsamt pipettera en liten mängd av lösningen in och ut fem gånger (t.ex. 150 μL för en volym på 800 μL i skålen).
- Sätt tillbaka locket ovanpå kulturrätten utan att förskjuta själva kulturrätten och återuppta avbildningen.
5. Washout av reagenser under levande avbildning
- Före diskningen, håll tvättlösningen vid samma temperatur som odlingsfatet.
- Ta bort locket på kulturrätten utan att förskjuta själva kulturrätten.
- Med en P200- eller P1000-pipett tar du långsamt bort något odlingsmedium från odlingsfatet utan att exponera toppen av proppen (t.ex. ta bort 600 μL från 800 μL odlingsmedium i skålen).
- För att späda ut reagenset, med en P1000-pipett, placera pipettspetsen nära ytan av odlingsmediet inuti odlingsfatet och släpp långsamt tvättlösningen (t.ex. tillsätt 1 ml tvättlösning till de 200 μL odlingsmedium som finns kvar i skålen för en utspädningsfaktor på 6).
- Upprepa steg 5.3 och 5.4 tills reagenset späds ut efter behov (t.ex. kommer ytterligare tre liknande rundor att resultera i en utspädningsfaktor på 1296, vilket minskar den ursprungliga koncentrationen på 10 μM NAPP1 till 7,7 nM).
- Sätt tillbaka locket ovanpå kulturrätten utan att förskjuta själva kulturrätten och återuppta avbildningen.
6. Korrigering av xyzdriften på tredimensionella och/eller flerkanaliga tidsfördröjningar
- förberedelse
- Ladda ner och installera ImageJ24. Ladda ner TurboReg25 och MultiStackReg26 plugins och placera dem i plugins-mappen i ImageJ.
- Ladda ner MultiHyperStackReg (Kompletterande kodningsfil 1) och AutoHyperStackReg ImageJ makron (Kompletterande kodningsfil 2). Om du vill installera ett makro placerar du antingen .ijm-filen i plugins-mappen i ImageJ eller lägger till innehållet i ijm-filen i filen ImageJ/macros/StartupMacros.txt filen.
- På ImageJ öppnar du en timelapse-film med flera segment och/eller flera kanaler (hädanefter kallad "hyperstack", figur 3A,4A). Om tidsfördröjningen bara innehåller ett segment och en kanal kan justeringen utföras direkt med MultiStackReg.
- Korrigering av sidodrift med MultiHyperStackReg
- Bestäm vilken kanal och/eller segment av hyperstacken som ska användas som referens för justering. Om du vill generera en referensstack med en kanal och ett segment (hädanefter kallad referensstack) klickar du på Bild | Duplicera..., markera kryssrutan Duplicera hyperstack, skriv relevant kanalnummer i Kanaler (c): (t.ex. ersätt 1–2 med 1) och/eller det relevanta kanalnumret i Segment (z): (t.ex. ersätt 1–15 med 8) och se till att Bildrutor: (t) innehåller alla bildrutor (t.ex. 1–50)innan du klickar på OK (Figur 3B).
- Alternativt kan du steg 6.2.1, om en projektion av flera segment föredras för referensstacken med en kanal, ett segment, klicka på Bild | Staplar | Z Project..., markera de första och sista segmenten och typen av projektion, se till att alla tidsramar är markerade och klicka på OK. Om tidsfördröjningen har flera kanaler tar du antingen bort de irrelevanta kanalerna( Bild | Staplar | Ta bort segment) från den resulterande projektionen eller duplicera den valda referenskanalen( Bild | Duplikat) (figur 3B).
- Du kan också beskära referensstacken så att den bara använder en del som bild som referens genom att välja rektangelverktyget i verktygsfältet, spåra en rektangel över intresseområdet och klicka på Bild | Beskär.
- För att starta MultiStackReg, klicka på Plugins | Registreringsnummer | MultiStackReg. På popup-menyn Stack 1:väljer du namnet på den enkanaliga stacken med ett segment som genererats i föregående steg. På popup-menyn Transformation:väljer du Översättning; markera kryssrutan Spara omvandlingsfil och ignorera alla andra fält.
OBS: Andra typer av omvandling (se25). - Klicka på OK. Välj en plats och ett namn för att spara justeringsfilen och klicka på Spara. I referensstapelfönstret väntar du tills ramarna slutar röra sig automatiskt, vilket indikerar att registreringen är över (bild 3B).
- Kontrollera referensstacken för att se om justeringen är tillfredsställande. Om inte, upprepa steg 6.2.1–6.2.5 med ett annat referenssegment, kanal och/eller beskärning. Stäng referensstacken.
- Markera hyperstackfönstret och kör makrot MultiHyperStackReg. Markera omvandlingsfilen som skapats i steg 6.2.5 och klicka på Öppna. Vänta tills justeringen ska tillämpas på varje kanal och/eller segment av hyperstacken, varefter ett nytt fönster med suffixet "_aligned" öppnas (Bild 3C).
- Korrigering av fokusdrift med MultiHyperStackReg
- Klicka på Bild | Egenskaper...kopierar du värdet som visas i Pixelbredd. Om du orthogonally ska reslicera hyperstacken med en kanal med ett avstånd på en pixel klickar du på Bild | Staplar | Reslice [/]...klistra in pixelbreddsvärdet i utdataavståndet: numeriskt fält; välj Överst i popup-menyn Start At: markerar du Undvik interpolation och klickar på OK.
OBS: Om minnet måste frigöras på ImageJ kan hyperstacken stängas efter reslicen. - Välj det nya fönstret som genereras av reslicen (hädanefter kallad "resliced hyperstack", figur 4B). Om den reslicerade hyperstacken har flera kanaler väljer du en referenskanal för att utföra justeringen och tar bort de andra kanalerna genom att markera dem i kanalrullningsfältet. klicka på Bild | Staplar | Ta bortsegment , välj Kanal på popup-menyn Ta bort aktuellt och klicka på OK.
- Generera en resliced hyperstack med ett segment (hädanefter kallad "resliced reference stack"), antingen genom att duplicera en enda del av den reslicerade hyperstacken (se steg 6.2.1) eller genom att projicera flera segment av den reslicerade hyperstacken (se steg 6.2.2) (figur 4C).
- Du kan också beskära den reslicerade referensstacken så att endast en del används som referens (se steg 6.2.3).
- Utför bildregistreringen på den reslicerade referensstacken med MutiStackReg (se steg 6.2.4–6.2.6) (Bild 4C).
- Markera det resliced hyperstack-fönstret och kör MultiHyperStackReg-makrot. Välj den omvandlingsfil som skapats i steg 6.3.5, klicka på Öppna och vänta på att justeringen ska tillämpas på varje kanal och/eller segment av hyperstacken, då ett nytt fönster med suffixet "_aligned" öppnas (hädanefter kallas "resliced reference stack", figur 4D). Stäng den ursprungliga resliced hyperstack.
- Om du vill konvertera den reslicerade justerade hyperstacken till xy-vyn av den ursprungliga hyperstacken klickar du på Staplar | Reslice [/]..., välj Överst i popup-menyn Börja med: markera Undvik interpolation och klicka på OK. När ett nytt fönster med den slutliga fokusjusterade hyperstacken öppnas (bild 4E), stäng den reslicerade justerade hyperstacken.
- Klicka på Bild | Egenskaper...kopierar du värdet som visas i Pixelbredd. Om du orthogonally ska reslicera hyperstacken med en kanal med ett avstånd på en pixel klickar du på Bild | Staplar | Reslice [/]...klistra in pixelbreddsvärdet i utdataavståndet: numeriskt fält; välj Överst i popup-menyn Start At: markerar du Undvik interpolation och klickar på OK.
- Om du automatiskt vill korrigera sidodriften och fokusdriften kör du autohyperStackReg-makrot. Välj referenskanalen, om tillämpligt, och om du vill korrigera sido- och/eller fokusdriften. Klicka på OK.
Figur 3: Rörledning för korrigering av sidodrift med MultiHyperstackReg. (A) Sido- och fokusdrivare kan observeras på en hyperstack som innehåller flera segment och tidspunkter. B)En referensstack med en enda segment genereras från hyperstacken, antingen genom duplicering eller Z-projektion. Referensstacken justeras av MultiStackReg-plugin-programmet, vilket genererar en justeringsfil. (C) MultiHyperstackReg-makrot används för att tillämpa justeringsfilen på hyperstacken, vilket resulterar i en justerad hyperstack för vilken sidodriften korrigeras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Pipeline för korrigering av fokusdrift med MultiHyperstackReg. (A) Fokusdrifter kan observeras på en hyperstack som innehåller flera segment och tidspunkter. (B) Hyperstacken är orthogonally resliced uppifrån, längs varje pixellinje längs Y-axeln, utan interpolation. Detta resulterar i en resliced hyperstack som innehåller samma information som hyperstack, med dess y och z koordinater växlade. Fokusdriften (i z) av den ursprungliga hyperstacken uppstår som en drift i y på den resliced hyperstack. C)En enda segment, enkanalig resliced referensstapel genereras från den reslicerade hyperstacken, antingen genom duplicering eller Z-projektion. Den resliced referens stacken justeras av MultiStackReg plugin, vilket genererar en justeringsfil. (D) MultiHyperstackReg-makrot används för att tillämpa justeringsfilen på den reslicerade hyperstacken, vilket resulterar i en justerad reslicerad hyperstack för vilken fokusdriften (i y) korrigeras. (E) En andra orthogonal reslice återställer hyperstackens ursprungliga koordinater, som nu inte längre presenterar en fokusdrift (i z). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
7. Kortikal signalmätning med roterande linjekannmedel
- Ladda ned makrot Roterande linescans ImageJ (Kompletterande kodningsfil 3).
- Öppna en tidsfördröjning i ImageJ. Placera bildrutorna i rullningslisten till den första bildrutan och placera segmentens rullningslist till det segment som signalen ska mätas på om tidsfördröjningen innehåller flera segment.
- Spårningsläge
- Markera det raka verktyget i verktygsfältet. Spåra en linje över den kortikala zon som ska mätas (figur 5A), se till att linjen är ungefär vinkelrät mot cortex och att linjen är tillräckligt lång för att korsa cortex vid varje nästa tidpunkt (Bild 5B, första och andra panelen).
- Dubbelklicka på linjeverktygsikonen i verktygsfältet för att öppna fönstret Linjebredd. Öka linjens bredd så mycket som behövs samtidigt som skärningspunkten mellan linjen och cortex håller en rak linje (Figur 5B, tredje panelen).
- Starta makrot Roterande linjerkanner. Ställ in rotationsområdet (bild 5E) till ett lågt värde (ca 10°) om orienteringen för den kortikala zon som ska mätas inte ändras mycket från en gångpunkt till nästa. Ställ in värdet Mått runt på 0 pixlar för att endast mäta signalen på linjen där maximal signalintensitet detekteras, eller till högre värden för att även mäta signalen runt denna linje.
OBS: Mät runt-värdet påverkar endast signalmätningen efter detektion av cortex och påverkar inte själva detektionen. - På popup-menyn Hitta cortex på kanal: väljer du den kanal där identifieringen ska utföras. Om du vill visualisera var cortex har upptäckts vid varje tidpunkt håller du kryssrutan Visningsposition... markerad (rekommenderas). Håll kryssrutan Nyare och omorienterad... markerad. Klicka på OK.
- När statusen Klar, Resultat som kopierats till Urklipp visas i ImageJ-fönsterstatusen bläddrar du igenom tidsfördröjningen för att kontrollera om de identifierade cortexpositionerna (gult överlägg) och det uppmätta området (cyanöverlägget) är tillfredsställande. Om inte, upprepa steg 7.3.1–7.3.4 med en annan linjeposition, längd eller bredd och olika inställningar i alternativfönstret Roterande linjer.
- Klistra in måtten i ett kalkylbladsprogram.
OBS: Kolumner motsvarar kanaler i ordning efter deras utseende i tidsfördröjningen och rader motsvarar ramar.
- Icke-spårningsläge
- Markera det raka verktyget i verktygsfältet. Spåra en linje (indikerad i cyan, figur 5A) över den kortikala zon som ska mätas, se till att linjen är ungefär vinkelrät mot cortex och att linjen är tillräckligt lång för att korsa cortex vid varje tidpunkt (Figur 5C, första och andra panelen).
- Dubbelklicka på linjeverktygsikonen i verktygsfältet för att öppna fönstret Linjebredd. Öka linjens bredd så mycket som behövs samtidigt som skärningspunkten mellan linjen och cortex håller en rak linje (Figur 5C, tredje panelen).
- Starta makrot Roterande linjerkanner. Ställ in rotationsområdet (figur 5E) i enlighet därmed på de ändringar av orienteringen i den kortikala zonen som ska mätas under hela tidsfördröjningen. Ställ in värdet Mått runt på 0 pixlar för att endast mäta signalen på linjen där maximal signalintensitet detekteras, eller till högre värden för att även mäta signalen runt denna linje.
OBS: Mät runt-värdet påverkar endast signalmätningen efter detektion av cortex och påverkar inte själva detektionen. - På popup-menyn Hitta cortex på kanal: väljer du den kanal där identifieringen ska utföras. Om du vill visualisera var cortex har upptäckts vid varje tidpunkt håller du kryssrutan Visa positioner... markerad (rekommenderas). Lossa kryssrutan Nyare och Omorienterad. Klicka på OK.
- När resultaten är klara visas resultat som kopierats till Urklipp i ImageJ-fönsterstatusen, bläddra igenom tidsfördröjningen för att kontrollera om de identifierade cortexpositionerna (gult överlägg) och det uppmätta området (cyanöverlägget) är tillfredsställande. Om inte, upprepa föregående steg med en annan linjeposition, längd eller bredd och olika inställningar i alternativfönstret Roterande linjer.
- Klistra in måtten i ett kalkylbladsprogram.
OBS: Kolumner motsvarar kanaler i ordning efter deras utseende i tidsfördröjningen och rader motsvarar ramar.
Figur 5: Mätning av kortikal signal med roterande linjekanna. A)En linje (cyan) spåras vinkelrätt mot cortex (svart) där signalen kommer att mätas. Olika gråtoner visar cellpositionen som ändras över tre tidspunkter (t1, t2, t3). (B) Vänster: korrekt positionering av linjen i spårningsläge. Mitten: felaktig positionering av linjen i spårningsläge eftersom det inte finns någon överlappning med cortex vid nästa tidpunkt. Höger: alltför bred linje vilket resulterar i att korsningen (orange linje) mellan cortex och linjen inte är rak. C)Vänster: korrekt positionering av linjen i icke-spårningsläge. Mitten: felaktig positionering av linjen i icke-spårningsläge eftersom det inte finns någon överlappning med cortex vid varje tidpunkt. Höger: alltför bred linje vilket resulterar i att korsningen (orange linje) mellan cortex och linjen inte är rak. D)Skanningslinjens längd och bredd. (E) Linjekanner utförs inom ett intervall av orienteringar runt den ursprungliga orienteringen som definieras i (D) definierad av parametern "rotationsområde", med ett intervall som definieras av parametern "rotationssteg". (F) Icke-optimal orientering av skanningslinjen i förhållande till cortex, vilket resulterar i en låg signal mätt längs linjen. (G) Linjens optimala orientering definieras som den som resulterar i den högsta signalintensiteten som mäts längs linjen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Representative Results
Immobilisering av Drosophila vävnader med Fibrin blodproppar och kultur medium utbyte under live imaging.
Efter att ha dissekerats enligt förfarandet i steg 2 (figur 1) och immobiliserats i Fibrin-blodproppar på samma täckglas efter det förfarande som presenteras i steg 3 (figur 2), larvhjärnor som uttrycker GFP-märkt Bazooka (Baz::GFP), avbildades poläritetsproteinet Par-3: s flugorolog i 30 min i tidsfördröjnings multipositionskonfokal avbildning. Baz::GFP kombineras med apkcas4, en allel som möjliggör akut hämning av atypiska proteinkinas C (aPKC) genom tillsats av den lilla ATP analoga 1-NAPP120. 1-NAPP1 lades därför till kulturmediet efter det förfarande som presenteras i steg 4 och live imaging återupptogs i 2,5 h. Kontrollera hjärnor som bär en vild-typ version av kinas aPKC reagerade inte på ATP analog, medan hjärnor som dessutom bär en analog-känslig mutation av aPKC (apkcas4) visade en sammandragning av neuroepithelium och ljusa kluster av Baz i neuroblaster och deras avkomma ( Figur6, Video 1). Neuroblaster fortsätter att dela sig under hela tidsfördröjningen, vilket indikerar att vävnaden förblir frisk, och hjärnor visar liten drift trots kulturmediets förändring, vilket indikerar att de är väl immobiliserade. På samma sätt, efter att ha dissekerats efter det förfarande sompresenteras i 27, immobiliserades ovarioler som uttrycker Baz::GFP i fibrinska blodproppar på samma täckglas och avbildades i 8 minuter, varefter applicering av 1-NAPP1 inducerade sammandragningen av apkcas4 mutant follikulära celler men inte av kontroller (figur 7, Video 2).
Korrigering av sido- och fokusdrift med MultiHyperstackReg.
En hyperstack som visar både sido- och fokusdrift (Video 3, vänster panel) korrigerades först för sidodrift (steg 6.2, bild 3, Video 3, mittenpanelen), sedan fokusdrift (steg 6.3, figur 4, Video 3, höger panel) med MultiStackReg plugin och MultiHyperstackReg makro, vilket resulterar i en betydande minskning av rörelserna som observerats i den ursprungliga hyperstack.
Kortikal signalmätning med roterande linjekannmedel
En neuroblast som uttrycker Baz::GFP (grön) och transmembranproteinet CD4 märkt med ett infrarödt fluorescerande protein (CD4::mIFP, rött) avbildades under en mitos. CD4::mIFP-signalen användes som referens för att upptäcka cortex vid olika delar av neuroblasten med linjer (steg 7, figur 5, figur 8A-C) och Baz::GFP-signalen mättes vid de detekterade positionerna figur 8D). Under deras uppdelning polariseras neuroblaster tillfälligt genom att upprätta distinkta och motsatta när domäner: den apatiska polen och basalpolen. Baz definierar den apokala polen och konsekvent ökade Baz::GFP-signalen vid neuroblastens apokala pol och minskade vid basalstången under delningen (figur 8C,D). Cortexens position spårades tillfredsställande under hela tidsfördröjningen (Figur 8C, Video 4). Drosophila-linjerna och genotyperna refereras i kompletterande tabell 1–2.
Figur 6: Applicering av en ATP-analog på immobiliserade larvhjärnor under levande avbildning. (A) Live imaging av två larv hjärnor uttrycker Baz::GFP immobilized på samma täcklip. Odlingsmediet ändras till en koncentration av 10 μM av ATP analog 1-NAPP1 vid 0 min. Kontrollera hjärnor reagerar inte synligt på ATP analog medan hjärnor som bär en analog känslig mutation av aPKC (aPKCAS4) visar en sammandragning av neuroepithelium (pilspetsar) och ljusa kluster av Baz i neuroblaster och deras avkomma. Maximal intensitetsprojektion på 33 skivor för ett djup av 23 μM. Skalstång: 20 μM. (B) Förstoring av neuroepitheliumet. Skalbar: 10 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Applicering av en ATP-analog på immobiliserade äggkammare under levande avbildning. Live imaging av två ovarioler uttrycker Baz::GFP immobilized på samma coverlip. Odlingsmediet ändras till en koncentration av 10 μM av ATP analog 1-NAPP1 vid 0 min. Kontrolläggkammare reagerar inte synligt på ATP-analogen, medan äggkammare som bär på en analog känslig mutation av aPKC (aPKCAS4) uppvisar en sammandragning av epitel (pilspetsar) vilket så småningom leder till en uppenbar nedbrytning av vidhäftningskorsningar. Maximal intensitetsprojektion på 33 skivor för ett djup av 27 μM. Skalstång: 20 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Mätning av kortikalsignalen med roterande linjer. (A) Live D. melanogaster neuroblast uttrycker Baz::GFP (grön) och CD4::mIFP (röd). Cyanlinjer: inledande skanningslinjer som spåras vinkelrätt till olika närzoner för att mäta. Skalstång: 5 μM. (B) Identifiering av cortex (mörkblå linje) med hjälp av kortikala linecans och CD4::mIFP (röd) som referenskanal. Cyanlinje: område som definieras av parametern "Mät runt" (här, 2 pixlar), där signalen mäts efter cortexdetektering. Skalstreck: 2 μm. (C) Cyan: När områden som identifieras under en neuroblastdelning med hjälp av metoden för roterande linjercans från de första skanningslinjerna som visas i (A), med CD4::mIFP (röd) som referenskanal. Skalstång: 5 μM. Pil: apokal pol. Pilspets: basal pol. (D) Mätning av Baz::GFP-signalintensiteten över tid i de två motsvarande zoner som identifieras av roterande linjekanner som visas i (C). Under mitos blir Baz::GFP övergående berikad vid neuroblastens apiska pol och är uttömd från den motsatta basala polen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Tillämpning av medieutbyte på immobiliserade larvhjärnor under live-avbildning för att lägga till en hämmare, presenterad i figur 6, skalbar: 20 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Tillämpning av medieutbyte på immobiliserade äggkammare under live-avbildning för att lägga till en hämmare, presenterad i figur 7, skalbar: 20 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Korrigering av sido- och fokusdrift med MultiHyperStackReg. Levande avbildning av en neuroblast som uttrycker membran sonden PH::GFP. Xy: en brännviddsplan. Xz: orthogonal reslice. Vänster: före korrigering av avdriften. Mitten: efter korrigering av sidodriften. Höger: efter korrigering av sido- och fokusdriften, skalbar: 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: Detektering av cortex med roterande linjercans, presenteras i figur 8, skalbar: 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande tabell 1: Genotyper av avbildade Drosophila vävnader. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 2: Ursprung av transgener som används. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande kodningsfil 1: Ursprung av transgener som används. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: Ursprung av transgener som används. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: Ursprung av transgener som används. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Levande avbildning av hela berget D. melanogaster larval hjärnor ger möjlighet att observera asymmetriska neurala stamcellsdelningar under förhållanden nära ett fysiologiskt sammanhang. Den första delen av vårt protokoll introducerar vår strategi för dissekering av larvhjärnor. Som redan sagt13, en kritisk aspekt av preparatet är att undvika att skada hjärnan. Den mest utmanande aspekten av detta är att separera hjärnan från de närliggande imaginala skivorna utan att dra överdrivet på hjärnan. Vårt tillvägagångssätt för att "skära utan att dra" är att utföra antingen en sliprörelse med spetsarna på ett par tångar, eller att skjuta en tångspets längs två andra tångspetsar som håller anslutningen mellanvävnader ( Figur 1A) medan Lerit et al. beskriver sågliknande rörelser med en dissekeringsstift. Vi råder experimenteraren att prova alla tillvägagångssätt och att anta den bäst lämpade för sig själva. Vi föreslår också att du använder BSA- eller FCS-belagda pipettspetsar snarare än dissekeringsverktyg för att överföra isolerade hjärnor. Beläggningen förhindrar att vävnader fastnar på plasten och möjliggör säker överföring av vävnader samtidigt som de alltid håller dem helt nedsänkta, utan att utsätta dem för en eventuell övergående deformation när de håller sig till dissekeringsverktyget under överföringen. Belagda spetsar har andra fördelar för att möjliggöra överföring av flera hjärnor samtidigt, vilket är särskilt användbart när det är viktigt att kontrollera provernas vistelsetid inom ett visst medium; De är lämpliga för överföring av andra vävnader, även bräckliga sådana som till exempel feta kroppar; De kan rymma ett brett utbud av olika provstorlekar genom att använda större spetsar eller skära spetsens extremitet.
Därefter beskriver detta protokoll användningen av Fibrinogen koagulering för att immobilisera larv hjärnor på täcket av en kulturrätt. En hjärna är orienterad inom en droppe kulturmedium + Fibrinogen, varefter koagulering induceras av tillsats av trombin. Fibrinbildningen är gradvis, vilket ger ett tidsfönster under vilket provets orientering vid behov kan finjusteras (figur 2C). Om en liten komprimering av provet krävs - vilket vi avråder från när det gäller larvhjärnor - kan det också finjusteras genom att trycka proppen mer eller mindre nära provet under steg 3.4.4 och 3.5.2. Den största fördelen med denna Fibrinogen koagulering över protokollet som beskrivs i Lerit et al., där hjärnor är monterade mellan ett gasgenomsläppligt membran och ett täckglas, är förmågan att ersätta odlingsmediet under levande avbildning. En möjlig fördel med att använda ett gaspermeabelt membran över vårt protokoll kan vara att det ger en optimal syresättning av proverna, vilket kan vara mer begränsat med vårt tillvägagångssätt eftersom hjärnor separeras från luften av proppen och något medium. Av denna anledning, även om vi inte bedömde effekten av mängden kulturmedium i kulturrätten, föreslår vi att man begränsar mängden odlingsmedium ovanpå blodpropparna samtidigt som blodpropparna är helt nedsänkta.
Eftersom manipuleringen av blodpropparna kan vara experimentellt svår och tidskrävande rekommenderar vi att experimenteraren först övar på att manipulera blodproppar utan prover. Modulering av volymen av droppen av odlingsmedium + Fibrinogen på täckglaset, koncentrationen av Fibrinogen eller volymen och koncentrationen av trombin kan bidra till att göra preparatet enklare och kan vara viktigt när protokollet anpassas till andra typer av vävnader. Med tillräckligt med erfarenhet av att manipulera blodpropparna kan flera hjärnor immobiliseras i en blodpropp om det behövs, även om det komplicerar finjusteringen av orienteringen. Flera blodproppar kan bildas på täckglaset, vilket till exempel gör det möjligt att avbilda prover av olika genotyper. Det är också möjligt att exponera olika blodproppar på samma omslagslip till olika kulturmedier, även om man måste vara försiktig så att man aldrig blandar dropparna av odlingsmedium som täcker de olika blodpropparna. När larv hjärnor är immobiliserade och redo för levande bildbehandling, rekommenderar vi att följa rekommendationerna i Lerit et al.13 för att undvika överdriven fotodamage. Vi lägger bara till dessa rekommendationer för att inte bara upprätthålla hjärnan vid 25 °C under levande avbildning med en sceninkubator, men också för att förvärma detta steg i minst 30 minuter före avbildningens början. I våra händer resulterar underlåtenhet att göra det systematiskt i en stark fokusdrift.
Det kan vara fördelaktigt i vissa sammanhang att kunna utföra korrelerad mikroskopi och fixa och immunostain ett prov efter live imaging. En begränsning av att använda Fibrin blodproppar är dock att det är nästan omöjligt att mekaniskt isolera en hjärna från en blodpropp utan att skada den. Ett möjligt sätt att övervinna denna begränsning kan vara att utveckla metoder för att bryta ner Fibrin blodproppar med Plasmin eller att inducera blodpropp demontering genom att tillsats av en peptid som efterliknar rattarna tillåter Fibrin polymerisation28. Vi använder vanligtvis Fibrin blodproppar på prover som sträcker sig från enstaka celler till 200 μM långa vävnader, men vi kan också framgångsrikt immobilisera i blodproppar och bildhjärnor från vuxna humlebitar över 3 mm breda. Den övre gränsen för provstorleken som kan immobiliseras i blodproppar återstår att bestämma. På samma sätt, även om vi vanligtvis avbildar immobiliserade prover i 4 till 5 h, avbildade vi framgångsrikt neuroblaster i primärkulturen i upp till 3 dagar, vilket indikerar att proppen åtminstone inte stör långsiktig livskraft. Tvärtom kan blodproppar underlätta regelbunden ersättning av mediet, ett krav på långsiktig avbildning, utan behov av enheter som peristaltiska pumpar för detta ändamål. Även om vi inte har mätt permeabilitetsparametrarna för fibrinpropparager, verkar blodproppens fibrösa gelliknande natur vara genomtränglig av cellgenomsläppliga molekyler. Vi fann att Latrunculin A, Colcemid eller 1-NAPP1, HALO-tag ligands och andra standardfärgämnen som används i cellbiologi når cellerna i fibrinproppen utan problem och har hittills inte stött på molekyler som skulle behållas av proppen, vilket dock är en möjlighet som måste empiriskt testas.
Sammanfattningsvis ger användning av Fibrin-blodproppar ett tillförlitligt och relativt enkelt sätt att implementera ett sätt att immobilisera levande vävnader för levande avbildning. Utöver dess användbarhet för att begränsa lateral drifting, har förmågan att ändra kulturmediet under levande avbildning visat sig ovärderlig för vår kemiska genetik strategi för att studera den asymmetriska celldelningen av D. melanogaster neuroblaster21. Vi förväntar oss att denna teknik kommer att vara fördelaktig för studier i ett brett spektrum av olika vävnader, särskilt om de involverar kemisk genetik eller till exempel protein självmärkning29.
Vårt MultiHyperStackReg-makro förlitar sig på TurboReg ImageJ-plugin, som justerar på varandra följande ramar eller segment av en stack, och MultiStackReg ImageJ-plugin, vilket gör det möjligt att tillämpa omvandlingarna på andra staplar. MultiHyperStackReg tillåter helt enkelt att tillämpa dessa omvandlingar på hyperstacks (staplar med minst fyra dimensioner). Eftersom användningen av MultiHyperStackReg, som vi beskriver det, kräver många åtgärder och kan bli ganska tidskrävande, skrev vi också AutoHyperStackReg-makrot, som automatiskt utför alla steg som beskrivs i steg 6.2 och 6.3. Men i motsats till MultiHyperStackReg saknar AutoHyperStackReg för närvarande möjligheten att beräkna justeringen av en stack baserat på en underregion i denna stack, ett alternativ som vi hittade är ibland avgörande för en tillfredsställande justering. En annan begränsning av AutoHyperStackReg är att dess användning är begränsad till översättningar och inte de andra omvandlingar som föreslagits av TurboReg och MultiStackReg, medan MultiHyperStackReg kan tillämpas på en hyperstack vilken omvandlingstyp som helst om användaren behöver det. Framtida utgåvor implementerar dessa funktioner och kommer att finnas tillgängliga på GitHub30. Slutligen ger vårt roterande linescan-makro ett enkelt sätt att snabbt mäta kortikala signaler i tidsförfall, även om cortex ändrar sin position eller orientering över tid. Om dess spårningsläge eller dess icke-spårningsläge är bäst lämpat för analys beror på kvaliteten och konsekvensen hos den kortikala signalen. Spårningsläget är lättare att använda eftersom användaren inte behöver överväga var cortex kommer att vara för varje tidspunkt och kan rymma stora positions- och orienteringsförändringar över tid. Det är dock bara lämpligt om den kortikala signalen förblir tillräckligt stark för detektion under hela filmen: ett misslyckande med att upptäcka något annat än cortex (t.ex. ett ljust cytoplasmiskt fack nära cortex) kan äventyra upptäckten för varje följande tidspunkt (t.ex. rör sig det cytoplasmiska facket bort från cortex och de kortikala linjerna kan följa den under resten av tidsfördröjningen). Icke-spårningsläget har inte denna fallgrop eftersom detektion är begränsat till den linje som ursprungligen drogs av användaren (t.ex. ett ljust cytoplasmiskt fack kan orsaka att detektion misslyckas under några tidspunkter, men när cytoplasmicfacket rör sig bort från detektionszonen återupptas korrekt detektion av cortex), men beter sig inte bra om cortexpositionen eller orienteringen ändras mycket över tiden. Nästa funktion (som kommer att vara tillgänglig på GitHub30) som ska utvecklas för spårningsläget är alternativet att endast analysera angivna tidspunkter och definiera en referenstidpunkt (i stället för den första tidspunkten) innan och varefter identifieringen kommer att utföras, vilket gör det möjligt för användaren att åtminstone undvika problematiska tidspunkter.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet i Januschke-laboratoriet stöds av Wellcome trust grants 100031/Z/12/A och 1000032/Z/12/A. Mjukpappersavbildningsanläggningen stöds av bidraget WT101468 från Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
| Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
| FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
| Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |
References
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
- Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
- Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).
