Summary
该协议描述了使用纤维蛋白块的样品固定应用，限制漂移，并允许在现场成像过程中添加和冲洗试剂。样品被转移到一滴含有培养基的纤维素中，然后通过添加血栓诱导聚合。
Abstract
嗜血杆菌 是研究各种生物问题的重要模型系统。可以提取和保存来自苍蝇不同发育阶段的各种器官和组织，如假想盘、成年女性的幼脑或卵室或成年肠，用于使用延时显微镜成像，为细胞和发育生物学提供有价值的见解。在这里，我们详细描述了我们目前关于切除 喉 部的方案，然后介绍我们目前的方法，即使用纤维素血块在玻璃盖上固定和定位幼虫大脑和其他组织。这种固定方法只需要在文化媒介中加入纤维蛋白原和血栓。它适用于在同一培养皿中多个样品的倒显微镜上进行高分辨率时间延迟成像，最大限度地减少显微镜阶段多点访问显微镜运动中频繁造成的横向漂移，并允许在成像过程中添加和去除试剂。我们还提供定制宏，我们经常用来纠正漂移，并从延时分析中提取和处理特定的定量信息。
Introduction
Drosophila仍然是研究各种生物问题的重要模型系统，几十年来在许多学科中擅长提高知识。使其特别突出的一个特点是，它特别适合现场成像。实时监测细胞子过程或细胞和组织行为的能力继续有助于生成与细胞和发育生物学相关的关键概念。许多成功的协议已经由不同的群体开发，以保持这种果蝇样品活着和健康，以研究标本和荧光分子的行为生活。来自苍蝇的器官和组织，如假想盘1，2，幼脑3，4，5，6，或卵室的成年女性7，8，9，或成人肠10例如可以提取和保存在培养成像与延时显微镜。实时成像的一个关键挑战是确保标本保持在成像表面附近，以获得最佳分辨率和不动，同时不影响对机械撞击敏感的样品完整性。例如，为了研究神经干细胞，称为神经母细胞或神经元在喉部大脑中，通过在密封的成像室11、12、13中用培养介质覆盖它们，可以使样本靠近成像表面。然而，这种方法不容易允许媒体交流，从而限制了实验室的机动性。或者，样品可以准备和放置在盖片上处理，以增加细胞的粘附性，并允许多点访问显微镜和扩展活细胞成像在开放培养皿，有可能允许媒体交换，但不能提供简单的手段，以防止样品漂移或损失期间媒体交换14，15。
最初为研究活鹤飞精子细胞16中的肌瘤而开发的纤维蛋白凝块方法特别适合克服这些问题。纤维蛋白原溶解在相关培养介质中，样品在加入Thrombin之前放置并定向在足够的玻璃表面成像室上，导致迅速形成不溶性纤维素凝块，粘性纤维网，粘附在玻璃表面和样品上，同时确保样品进入培养基。然后，在不干扰血块或样品位置的情况下交换介质。例如，当像原始方法一样添加抑制剂，或用于洗掉或脉冲追逐实验时，或在活细胞成像过程中添加荧光染料，同时保持细胞和组织到位时，培养介质交换是可取的。纤维蛋白块适合成像的嗜血杆菌组织以及个别细胞13，17。纤维蛋白块可以进一步用于帮助定向样品，由于其形状或其他特性，通常不会通过调节纤维蛋白块内的样品位置和血块本身的形状来以所需的方式定向。
在这里，我们提供最新的我们目前的纤维蛋白块为基础的成像方法，并提供工具，基于分割的图像分析，并专注于使用这种方法来研究神经母细胞分裂在发展中的苍蝇大脑。我们通常使用纤维素凝块方法，以遵循多个样品在不同的血块在同一培养皿。这允许 i） 成像子细胞事件，如中心体行为或 mRNA 本地化活18，19，ii） 监测样本的行为在药理处理不同基因型下使用多点访问 显微镜20，iii）研究酶急性抑制的影响21和iv）尽量减少漂移，以研究细胞在生理环境中的细胞分裂方向的变化，在有针对性的激光消融22。虽然血栓和纤维蛋白原和纤维蛋白块的不需要的影响需要对每个样本进行经验测试， 这种方法原则上适用于活细胞成像分析的任何类型的样本，在Ddrosophila中已成功地用于研究神经母细胞生物学的多个方面5，19，20，而且女性生殖系干细胞23的细胞传感器投影的动力学和极性的变化后，急性APKC抑制卵泡细胞的德索菲拉女性卵室21。
延时荧光成像导致生成复杂的时间解决的 3D 数据集，这些数据集需要提取此定量信息的方法。在这里，我们描述了我们基于 ImageJ 的24 宏的进一步发展，这些宏可用于纠正超堆栈和定制的 ImageJ 宏的漂移，从而允许对细胞皮层的多通道荧光进行半自动量化，以量化 Drosophila 幼虫大脑神经母细胞中的皮质蛋白质或初级细胞培养中的单个神经母细胞。
Protocol
1. 准备试剂
注：除非另有解释，否则本协议中的所有步骤均在室温下执行。
- 要准备 1x PBS-BSA （0.1% w/v） 的解决方案，在 1 mL 的 PBS 中溶解 1 毫克牛血清白蛋白 （BSA）。要准备血栓 1，000 单位-mL-1的库存解决方案，在 1 mL PBS-BSA （0.1% w/v） 中溶解 1，000 单位血栓。制作 10μL 的别名，在 -20 °C 中存储长达 4 个月。
- 为了为 嗜血杆菌 大脑准备培养介质，在无菌条件下将施耐德介质的1升葡萄糖溶解。过滤和存储在4°C长达3个月。
- 要准备纤维蛋白原溶液，在室温下将 10 毫克纤维蛋白原溶解在 1 mL 培养介质中 20 分钟，或在 37 °C 下溶解 5 分钟。
注意：如果使用与步骤 1.2 准备的不同的文化介质，并且在此步骤中已经形成纤维蛋白块，则文化介质可能包含活性血栓，需要事先灭活。血栓的一个可能来源是胎儿牛血清，它可以通过加热血清到56°C30分钟灭活。 - 要准备PBS-BSA（5%w/v）的涂层溶液，将50毫克牛血清白蛋白（BSA）溶解在1mL的1x PBS中。
- 例如，在第 4 步中使用的试剂，通过在 315 μL 二甲基硫氧化物中溶解 1 毫克 NAPP1 来准备 10 mM NAPP1 的库存解决方案。
2. 对 喉 部幼虫大脑的解剖
注意：在解剖双筒望远镜下执行此步骤。
- 使用刷子将 L3 幼虫转移到含有 PBS 的 9 井玻色酸玻璃盘中。搅拌将大部分飞食从幼虫中分离，并转移到另一个含有文化媒介的井中。
- 使用钳子（如杜蒙#55）抓住幼虫的整个直径，在其身体长度的中间（见 图1A，B）。在抱着幼虫时，将其转移到含有200μL新鲜文化介质的博罗西酸板的另一口井中。
- 不要释放幼虫。要将幼虫在整个直径（图1B）上切成两半，要么用钳尖（图1A，顶部面板）的横向运动研磨抓地力区域，要么在持有幼虫的两个钳尖之间滑动另一对钳子的一尖（图1A，底部面板）。不要通过拉扯幼虫的四肢之一将幼虫切成两半，因为它可以通过穿过身体长度的神经（ 图1B中的红线）拉伤大脑。
- 用钳子用皮质层和另一对钳子把幼虫抱住，在不拉动大脑的情况下剥开皮质层（图1C）。重复，直到来自大脑的神经是可见的，连接大脑和嘴部部分的器官可以访问图1D。
- 使用钳子来控制来自大脑的神经。与其他一对钳子，使用图1A中显示的任何一种技术来切断大脑与嘴部之间的连接，将大脑与皮质层的其余部分分离（图1D）。
- 使用钳子通过从心室神经线传出的轴突来支撑大脑。将 图1E 中用灰色描绘的器官从大脑中轻轻拉开。
注意：不要拉眼睛/天线想象磁盘（深黄色）将其从大脑中分离。这些组织之间的连接太强，不能在不损害大脑的情况下拉扯而断裂。 - 同时仍然抓住神经来保持和定向大脑，抓住眼睛/天线想象盘（深黄色）和大脑与其他一对钳子（图1F）之间的连接。使用 图 1A 中显示的任何一种技术在不拉动大脑的情况下切断此连接。检查大脑是否适当清除其他组织（图1G），而不是受损（图1H）。如果大脑有损伤的迹象，就丢弃它。
- 派佩特涂层溶液与P20进出涂层移液器尖端。将大脑与涂层尖端以及 3μL 的介质（图 2A左图）一起移出，并将其移出另一口含有 200 μL 清洁培养介质的井中。
- 重复步骤 2.2–2.8，直到解剖足够的大脑，偶尔会替换进行解剖的井的文化介质。
图1：对 德拉诺加斯特 幼脑的解剖。（A） 无需使用钳子拉取切割的技术。样品（浅绿色）可以通过在钳子（顶部面板）的尖端之间磨碎，或沿着一对握着样品（底部面板）的钳子尖端运行一对钳尖来切割。（B–F）在不损坏幼虫大脑的情况下隔离幼虫大脑的步骤（见文本）。红色：大脑。深黄色：眼睛/天线盘。蓝色文本：用相应的钳子执行的操作。（G） 出现一个孤立的大脑，没有明显的损伤。D 是弯道侧，V 是横向视图上的腹侧。（H） 解剖期间过度拉动大脑造成的常见损害。顶部面板：心室神经线的分离。底部面板：叶变形。后侧为左侧，前侧位于所有面板中。 请单击此处查看此图的更大版本。
3. 用纤维素血块在盖滑上固定
注意：在解剖双筒望远镜下执行此步骤。
- 使用带有涂层尖端的 P20 移液器（如步骤 2.8）将解剖的大脑转移到含有 200μL 培养介质 + Fibrinogen （图 2A）的博罗西酸板的另一口井中。
- 一个大脑中的移液器以及9μL的文化介质+纤维蛋白原。随着尖端几乎触摸35毫米细胞培养盘的盖玻璃底部，移液器的内容（培养介质和大脑），使培养介质在退出移液器尖端后立即触摸盖片，使大脑和介质不会滑到尖端的两侧，潜在地损害大脑（图2A）。
- 使用一对钳子的一个尖端或一对封闭的钳子轻轻地推动和定位大脑在培养介质 + 纤维蛋白原下降。
注意：用一对开的钳子触摸掉落会导致培养介质被钳尖之间的毛细毛虫拉扯（图2B）。 - 如果必须对大脑的腹腔部分进行成像，则诱导纤维蛋白原凝固如下，以正确定位血块内的大脑（图2C）。
- 将大脑推到下降的一侧。配备P1尖端的P1移液器，移液器1μL的Thrombin溶液，用移液器尖触摸大脑对面掉落的边缘，并移出Thrombin（图2C，第一次绘制）。
- 等待1-2分钟，菲布里诺根开始聚合，导致在下降的一侧形成多云沉淀物（图2C，第二次绘制）。轻轻推和"塞"入菲布林血块的大脑，确保图像的部分（如腹侧）是尽可能接近盖片，而不会变形的大脑（图2C，第三绘制）。
- 派珀特出1μL的血栓溶液靠近大脑的一侧，而不是塞进纤维蛋白块。（图2C，第四图）。
- 等待2-3分钟，第二个纤维素凝块设置（图2C，第五绘制）。按压血块的边缘，使其更强烈地粘附在盖片上，注意不要使大脑变形（图2C，第六和第七图）。如果大脑似乎离盖片太远，请按压靠近大脑的纤维素血块，使其更接近。
- 如果必须对大脑的后部进行成像，则诱导纤维蛋白凝固如下（图2D）。
- 将大脑放置在下降的中心，面向盖片的后部部分。配备薄尖的 P10 移液器，移液器 1 μL 的血栓溶液，用移液器尖触碰大脑对面掉落的边缘，并移出色素（图 2D，第一次绘图）。
- 等待2-3分钟，菲布里诺根开始聚合，导致形成多云，纤维沉淀物（图2D，第二张图）。按压血块的边缘，使其更强烈地粘附在盖片上，注意不要使大脑变形（图2D，第三和第四图）。
- 如果必须在盖滑上固定几个血块样本，则重复步骤 3.1–3.5。
- 末端位于血块上方约 0.5 厘米处，轻轻移液器 390 μL 的培养介质，无纤维蛋白原滴落到血块顶部（图 2B，右培养皿）。不要在血块的两侧添加文化介质，因为它可能会将其从盖滑中分离。
- 要洗掉剩余的血栓，请使用移液器去除 300 μl 的文化介质，并添加 300 μl 的清洁培养介质，确保血块保持完全浸入。重复两次以洗掉多余的血栓。
图2：使用纤维素凝块固定 喉 部。（A） 使用 BSA 涂层的 Pipette 尖端，将大脑从培养介质（黄色）转移到培养介质 + 纤维蛋白原溶液（橙色），然后与 3.5μL 的文化介质 + 纤维素一起输送到文化盘的盖片（浅蓝色）上。纤维蛋白原凝固是由加入血栓来固定处于后部或腹腔位置的大脑引起的（见 D 和 E）。血块中的安全大脑随后被没有纤维素的文化介质覆盖，通过三次添加和去除培养介质来去除多余的血栓。（B） 大脑在文化介质下降中的位置 - 纤维蛋白原 （橙色） 在盖片上只应通过用一对封闭的钳子尖轻轻推它来调整，或只有一个钳尖。用打开的钳子触摸掉落会导致文化介质在钳子尖端之间被毛细毛拉。（C） 定位幼虫大脑以成像心室侧的步骤（见文本）。（D） 定位幼虫大脑以成像后侧的步骤（见文本）。在（D）和（E），绿色： 血栓。深橙色：纤维蛋白块。淡蓝色：盖唇。蓝色箭头：要将血块的边缘推到盖片上，以稳定血块。 请单击此处查看此图的更大版本。
4. 在现场成像过程中添加试剂
- 为避免温度变化导致焦点变化，请将试剂与培养皿本身的相同温度添加到培养皿中，使其在添加前达到相同的温度。如果使用环境室，请将解决方案留在会议厅内。
- 在不取代文化盘本身的情况下取下文化盘的盖子。为了便于拆卸，在成像前将 35 mm 碟子的盖子倒置在盘子顶部。
- 使用 P1000 移液器，将移液器尖端靠近培养皿内培养基表面，并轻轻地将足够的试剂溶液释放到它上，以达到所需的试剂浓度（例如，20μM NAPP1 溶液的 400 μL 到 400 μL 的文化介质，最终浓度为 10 μM NAPP1），不产生强大的通量，可以分离血块。
- 要使培养皿中的溶液均质化，请使用 P200 移液器将少量溶液缓慢地移入和移出五次（例如，150 μL，盘内体积为 800 μL）。
- 更换文化盘顶部的盖子，而不会取代文化盘本身，并恢复成像。
5. 实时成像期间试剂的洗净
- 洗净前，将洗涤液保持在与培养皿相同的温度下。
- 在不取代文化盘本身的情况下取下文化盘的盖子。
- 用 P200 或 P1000 移液器，从培养皿中慢慢取出一些培养介质，而不会暴露血块的顶部（例如，从菜内 800 μL 的文化介质中去除 600 μL）。
- 要稀释试剂，用 P1000 移液器，将移液器尖端靠近培养皿内培养介质的表面，然后慢慢释放洗涤液（例如，在盘中剩余的 200 μL 文化介质中加入 1 mL 的洗涤溶液，稀释系数为 6）。
- 重复步骤 5.3 和 5.4，直到试剂按要求稀释（例如，另外三个类似回合将导致稀释系数为 1296，将初始浓度 10μM NAPP1 降低到 7.7 nM）。
- 更换文化盘顶部的盖子，而不会取代文化盘本身，并恢复成像。
6. 纠正在三维和/或多通道延时漂流的 xyz
- 制备
- 下载并安装图像J24。下载涡轮注册25 和多堆栈注册 26 插件，并将它们放置在 ImageJ 的插件文件夹中。
- 下载多倍堆栈（补充编码文件1）和自动海珀堆栈图像J宏（补充编码文件2）。要安装宏，请将 .ijm 文件放在 ImageJ 的插件文件夹中，或将 .ijm 文件的内容添加到图像J/宏/启动Macros.txt文件中。
- 在 ImageJ 上，打开延时电影，包括多个切片和/或多个频道（从今称为"超堆栈"，图 3A，4A）。如果延时仅包括一片和一个通道，则可以使用多策略注册直接执行对齐。
- 使用多倍栈注册纠正横向漂移
- 决定应将超堆的哪个通道和/或切片用作对齐的参考。要生成单通道、单切片参考堆栈（从今以后称为"参考堆栈"），请单击"图像|重复。。。，勾选重复的超堆栈复选框， 在通道 （c）中键入相关频道号（例如，在切片 （z）中替换1+2）和/或相关频道号（例如，将1–15替换为8），并确保帧：（t）在单击确定（图 3B）之前包括所有帧（例如，1–50）。
- 或者，如果单通道、单片参考堆栈首选多个切片的投影，请单击"图像|堆栈|Z 项目。。。，选择第一个和最后一个切片和投影类型，确保所有时间帧被勾选并单击确定。如果延时有多个通道，请删除不相关的通道（图像|堆栈|从生成的投影中删除切片或复制选定的参考通道（图像|重复）（图3B）。
- 可选地，通过选择工具栏中的矩形工具、在感兴趣的区域上跟踪矩形并单击图像|，将参考堆栈裁剪为仅用作图像的一部分作为参考 作物。
- 要启动多堆栈注册，请单击 插件|注册|多堆栈注册。在弹出式菜单 Stack 1：中，选择以前步骤中生成的单通道、单片堆栈的名称。在弹出菜单 转换中：选择 翻译：勾选 "保存转换"文件 复选框，并忽略所有其他字段。
注：其他类型的转换（参见25）。 - 点击 确定。选择位置和名称以保存对齐文件，然后单击 "保存"。在参考堆栈窗口上，等待帧自动停止移动，表示注册已结束（图 3B）。
- 检查参考堆栈，查看对齐是否令人满意。如果没有，则重复步骤 6.2.1–6.2.5，具有不同的参考切片、通道和/或裁剪。关闭参考堆栈。
- 选择超堆栈窗口并运行多倍堆栈宏。选择步骤 6.2.5 中创建的转换文件，然后单击"打开"。等待对齐适用于超堆栈的每个通道和/或切片，此时将打开带有后缀"_aligned"的新窗口（图 3C）。
- 使用多倍堆栈重新校正焦点漂移
- 点击图像|属性。。。，复制像素宽度中显示的价值。要以一像素间距对单通道超堆进行正交，请单击图像|堆栈|将像素宽度值粘贴到输出间距中：数值字段：选择"开始"中的顶部：弹出菜单，勾选"避免插值"并单击"确定"。
注意：如果在 ImageJ 上必须释放内存，可以在废品后关闭超堆栈。 - 选择由废料生成的新窗口（从今以后称为"废料超堆"，图 4B）。如果残片超堆具有多个通道，请选择参考通道执行对齐，并通过在通道滚动条中选择其他通道来删除其他通道：点击图像|堆栈|删除切片，在删除当前弹出菜单中选择通道，然后单击"确定"。
- 生成单片废料超堆栈（从今以后称为"废料参考堆栈"），要么复制一片废料超堆栈（参见步骤 6.2.1），要么投影几片废料超堆栈（见步骤 6.2.2）（图 4C）。
- 可选地将残余参考堆栈裁剪为仅使用一部分作为图像作为参考（参见步骤 6.2.3）。
- 在残渣参考堆栈上与 MutiStackReg（参见步骤 6.2.4–6.2.6）（图4C）执行图像注册。
- 选择废弃的超堆栈窗口并运行多倍堆栈宏。选择步骤 6.3.5 中创建的转换文件，单击 "打开" 并等待将对齐应用到超堆栈的每个通道和/或切片，此时将打开带有后缀"_aligned"的新窗口（从今以后称为"废料参考堆栈"， 图 4D）。关闭原始残片超堆栈。
- 要将残片对齐的超堆栈转换为原始超堆栈的 xy 视图，请单击 堆栈|许可证[/]，选择 顶部 在 开始： 弹出菜单，勾选 避免插值 ，并点击 确定。一旦一个新的窗口与最终对焦对齐的超堆打开（图4E），关闭残片对齐的超堆栈。
- 点击图像|属性。。。，复制像素宽度中显示的价值。要以一像素间距对单通道超堆进行正交，请单击图像|堆栈|将像素宽度值粘贴到输出间距中：数值字段：选择"开始"中的顶部：弹出菜单，勾选"避免插值"并单击"确定"。
- 若要自动校正横向漂移和对焦漂移，运行自动堆栈宏。选择参考通道（如果适用）以及是否纠正横向和/或对焦漂移。点击 确定。
图3：用于校正多重堆栈注册横向漂移的管道。（A） 横向和对焦漂移可以在包含多个切片和时间点的超堆栈上观察到。（B） 单片、单通道参考堆栈由超堆栈生成，无论是重复还是 Z 投影。参考堆栈由多堆栈注册插件对齐，生成对齐文件。（C） 多重堆栈宏用于将对齐文件应用于超堆栈，从而产生一个对齐的超堆栈，从而纠正横向漂移。 请单击此处查看此图的更大版本。
图4：多倍堆栈注册对焦点漂移进行校正的管道。（A） 焦点漂移可以在包含多个切片和时间点的超堆栈上观察到。（B） 超堆栈是正交地从顶部，沿着Y轴沿线的每一行像素，没有插值。这导致一个废弃的超堆栈包含与超堆栈相同的信息，其 y 和 z 坐标已切换。原始超堆栈的焦点漂移（在 z 中）以 y 在残片超堆上漂移而发生。（C） 单片、单通道废品参考堆栈由废灭的超堆栈生成，无论是重复还是 Z 投影。废料参考堆栈由多堆栈插件对齐，生成对齐文件。（D） 多重堆栈宏用于将对齐文件应用于废旧超堆，从而产生对齐的废旧超堆，从而纠正焦点漂移（在 y 中）。（E） 第二个正交残片恢复超堆的原始坐标，现在不再显示焦点漂移（在 z 中）。 请单击此处查看此图的更大版本。
7. 带旋转线的皮质信号测量
- 下载旋转线扫描图像J宏（补充编码文件3）。
- 在图像J中打开延时。将帧滚动栏定位到第一帧，如果延时包含多个切片，请将切片卷轴栏定位到将测量信号的切片。
- 跟踪模式
- 选择工具栏中的直线工具。跟踪穿过皮带的线进行测量（图5A），确保线大致垂直于皮层，并且线长到足以在下一个时间点穿过皮层（图5B，第一和第二面板）。
- 双击工具栏中的行工具图标以打开线宽窗口。根据需要增加线的宽度，同时保持线和皮层之间的交界线（图5B，第三面板）。
- 启动旋转线扫描宏。如果要测量的皮质区的方向从一个时间点到下一个时间点变化不大，则将旋转范围 （图 5E）设置为低值 （约 10°）。将 "围绕值"的测量值 设置为 0 像素，仅测量检测最大信号强度的线路上的信号，或测量该线周围信号的更高值。
注：围绕值的测量仅在检测皮层后影响信号测量，不会影响检测本身。 - 在 通道上的查找皮层： 弹出菜单上，选择执行检测的通道。要可视化每个时间点检测到皮层的位置，请保留 显示位置... 保持 最新和重新定向。。。 点击 确定。
- 完成后，复制到剪贴板状态的结果显示在 ImageJ 窗口状态中，滚动浏览延时，以检查检测到的皮层位置（黄色叠加）和测量区域（青色覆盖）是否令人满意。如果没有，则重复步骤 7.3.1–7.3.4，在旋转线选项窗口中具有不同的线位置、长度或宽度以及不同的设置。
- 将测量结果粘贴到电子表格软件中。
注：列在延时中按外观顺序对应通道，线条与帧对应。
- 非跟踪模式
- 选择工具栏中的直线工具。跟踪皮质区域对面的线（以青色表示，图 5A表示）以进行测量，确保线大致垂直于皮层，并且线长到足以在每个时间点穿过皮层（图 5C、第一和第二面板）。
- 双击工具栏中的行工具图标以打开线宽窗口。根据需要增加线的宽度，同时保持线与皮层之间的交界线（图5C，第三面板）。
- 启动旋转线扫描宏。根据皮质区的方向变化设置旋转范围（图 5E），以便在整个延时期间进行测量。将 "围绕值"的测量值 设置为 0 像素，仅测量检测最大信号强度的线路上的信号，或测量该线周围信号的更高值。
注：围绕值的测量仅在检测皮层后影响信号测量，不会影响检测本身。 - 在 通道上的查找皮层： 弹出菜单上，选择执行检测的通道。要可视化每个时间点检测到皮层的位置，请保留 显示位置... 取消勾选 最近和重新定向。。。 点击 确定。
- 完成后，将复制到 Clipboard 的结果显示在 ImageJ 窗口状态中，滚动浏览延时，以检查检测到的皮层位置（黄色叠加）和测量区域（青色覆盖）是否令人满意。如果没有，在旋转线选项窗口中重复以前具有不同线位置、长度或宽度的步骤以及不同的设置。
- 将测量结果粘贴到电子表格软件中。
注：列在延时中按外观顺序对应通道，线条与帧对应。
图5：用旋转线测量皮质信号。（A） 线（青色）垂直追溯到皮层（黑色），在那里将测量信号。不同色调的灰色显示细胞位置在三个时间点（t1、t2、t3）发生变化。（B） 左：跟踪模式下线路的正确定位。中间：在跟踪模式下线的定位不正确，因为下一个时间点与皮层没有重叠。右图：过宽的线导致皮层和线之间的交叉（橙色线）不直。（C） 左：在非跟踪模式下正确定位线路。中间：在非跟踪模式下将线条定位不正确，因为每个时间点与皮层没有重叠。右图：过宽的线导致皮层和线之间的交叉（橙色线）不直。（D） 扫描线的长度和宽度。（E） 线扫描器在"旋转步"参数定义的原定向（D）周围方向范围内执行，间隔由"旋转步骤"参数定义。（F） 扫描线相对于皮层的非最佳方向，导致沿线测量的信号较低。（G） 该线的最佳方向被定义为导致沿线路测量的最高信号强度峰值。 请单击此处查看此图的更大版本。
Representative Results
在现场成像期间，用纤维蛋白凝块和培养介质交换的果蝇组织固定。
在第2步（图1）中提出的程序被解剖后，并在第3步（图2）中提出的程序后，在同一盖片上的纤维蛋白血块中固定，幼虫大脑表示GFP标记的Bazooka（Baz：：GFP），极性蛋白Par-3的飞行正交，在延时多位置对照成像中拍摄了30分钟。Baz：：GFP 与apkcas4结合，这是一种等位基因，通过添加小型 ATP 模拟 1-NAPP120，可急性抑制非典型蛋白激酶 C （aPKC）。因此，在第 4 步中提出的程序之后，将 1-NAPP1 添加到培养介质中，并恢复 2.5 小时的实时成像。携带激酶 aPKC 的野生类型版本的控制大脑对 ATP 模拟没有反应，而携带 APKC（apkcas4）的模拟敏感突变的大脑在神经母细胞及其后代中显示巴兹神经肽和明亮集群的收缩（图 6，视频 1）。神经母细胞在整个延时期间不断分裂，表明组织保持健康，大脑尽管培养介质变化，但几乎没有漂移，表明它们已经很好地固定。同样，在27日被解剖后，表示巴兹的卵石：GFP在同一盖片上的菲布林血块中固定，并成像8分钟，之后1-NAPP1的应用导致apkc作为4突变卵泡细胞的收缩，而不是控制（图7，视频2）。
使用多倍堆栈注册纠正横向和对焦漂移。
显示横向和对焦漂移（视频 3，左面板）的超堆栈首先被更正为横向漂移（步骤 6.2，图 3，视频 3，中间面板），然后使用 MultiStackReg 插件和多堆栈注册宏对焦点漂移（步骤 6.3，图 4，视频 3，右面板）进行更正，从而大幅减少在原始超堆中观察到的运动。
使用旋转线扫描的皮质信号测量
表达巴兹的神经母细胞：：GFP（绿色）和带有红外荧光蛋白（CD4：：mIFP，红色）标记的跨膜蛋白CD4在一次迷雾中被成像。CD4：：mIFP 信号用于用线卡（第 7 步、图 5、图 8A– C）检测神经母细胞不同部位的皮层，并在检测到的位置测量 Baz：：GFP 信号（图 8D）。在分裂过程中，神经母细胞通过建立不同和相反的皮质域（肛门极和基底极）暂时两极分化。Baz 定义了 apical 极点，并且一致地，Baz：：GFP 信号在神经母细胞的 apical 极中增加，并在分裂期间在基底极减少（图 8C，D）。皮层的位置在整个延时期间被令人满意地跟踪（图8C，视频4）。德罗索菲拉线和基因型在补充表1-2中引用。
图6：在实时成像过程中，在固定幼虫大脑上应用ATP模拟。（A） 两个幼虫大脑的实时成像表达巴兹：：GFP在同一盖片上固定。培养介质在 0 分钟内更改为 ATP 模拟 1-NAPP1 的 10 μM 浓度。控制大脑对ATP模拟没有明显反应，而携带APKC（aPKCAS4）模拟敏感突变的大脑显示神经细胞（箭头）收缩，神经母细胞及其后代中巴兹的明亮群落收缩。最大强度投影33片，深度为23微米。 比例杆：20μM.（B） 神经肽的放大。比例栏： 10 μM. 请单击此处查看此图的更大版本。
图7：在现场成像过程中，在固定的蛋室上应用ATP模拟。表达巴兹的两个卵子的实时成像： Gfp 在同一封面上固定。培养介质在 0 分钟内更改为 ATP 模拟 1-NAPP1 的 10 μM 浓度。控制卵室不会明显对ATP模拟反应，而携带APKC（aPKCAS4）模拟敏感突变的卵室显示上皮（箭头）收缩，最终导致粘附结点的明显分解。最大强度投影 33 片， 深度为 27μM 。比例栏： 20μM。 请单击此处查看此图的更大版本。
图8：使用旋转线扫描皮质信号的测量。（A） 活 D. 梅拉诺加斯特 神经母细胞表达巴兹： ： Gfp （绿色） 和 CD4：： mIFP （红色）.青色线：初始扫描线垂直跟踪到各种皮质区域进行测量。比例杆： 5 μM. （B） 使用皮质线和 CD4：mIFP （红色） 作为参考通道识别皮层 （深蓝色线） 。青色线：由"测量周围"参数定义的区域（此处为 2 像素），在皮层检测后测量信号。比例杆：2 μm. （C） 青色：在神经母细胞分裂过程中通过旋转线扫描方法从 （A） 中显示的初始扫描线识别皮质区域，使用 CD4：：mIFP（红色）作为参考通道。比例杆： 5 μm. 箭头： 阿皮卡杆。箭头：基底杆。（D） 测量 Baz：：GFP 信号强度随着时间的推移，在两个相应的区域，由旋转线卡显示在 （C） 中。在间歇期，Baz：：GFP在神经母细胞的顶点极短暂地富集，从对面的基底极耗尽。 请单击此处查看此图的更大版本。
视频 1： 在现场成像期间在固定幼虫大脑上应用媒体交换， 以添加抑制剂， 呈现在图 6中， 比例杆： 20μm.请点击这里下载此视频。
视频 2： 在现场成像期间在固定蛋室上应用媒体交换， 以添加抑制剂， 呈现在图 7中， 比例栏： 20 μm.请点击这里下载此视频。
视频 3： 使用多倍栈注册纠正横向和对焦漂移。 表达膜探头 PH：：GFP 的神经母细胞的实时成像。Xy：单焦平面。Xz：正交遗物。左图：在修正漂移之前。中间：横向漂移修正后。右图：修正横向和对焦漂移后，比例栏：10μm。 请单击此处下载此视频。
视频 4： 使用旋转线扫描皮层的检测， 以图 8呈现， 比例栏： 5 μm.请点击这里下载此视频。
补充表 1： 成像的 德罗索菲拉 组织的基因型。 请单击此处下载此表。
补充表 2： 使用的转基因基因的起源。 请单击此处下载此表。
补充编码文件 1：使用的转基因基因的起源。请单击此处下载此文件。
补充编码文件 2：使用的转基因基因的起源。请单击此处下载此文件。
补充编码文件 3：使用的转基因基因的起源。请单击此处下载此文件。
Discussion
整个坐骑 D.黑色素加斯特 幼虫大脑的实时成像提供了在接近生理背景的条件下观察不对称神经干细胞分裂的机会。我们协议的第一部分介绍了我们解剖幼虫大脑的方法。正如已经说过的13，准备的一个关键方面是避免损害大脑。其中最具挑战性的方面是将大脑与邻近的想象磁盘分开，而不要过度拉扯大脑。我们的方法"切割不拉"是执行磨削运动与一对钳子的尖端，或滑动钳尖沿另外两个钳子提示持有组织之间的连接（图1A），而莱利特等人描述锯状运动与解剖针。我们建议实验者尝试所有方法，并采用最适合自己的方法。我们还建议使用BSA或FCS涂层的移液器提示，而不是解剖工具来转移孤立的大脑。涂层可防止组织粘附在塑料上，并允许组织安全转移，同时始终保持组织完全浸入，而不会使组织在转移过程中粘附在解剖工具上时出现可能的瞬态变形。涂层提示具有其他优势，允许同时转移多个大脑，这在控制特定介质中样本的驻留时间至关重要时特别有用：它们适合转移其他组织，即使是脆弱的组织，例如，脂肪体：它们可以通过使用较大的提示或切割尖端的四肢来容纳各种不同的样本大小。
接下来，此协议描述了使用纤维蛋白原凝固来固定文化盘盖上的幼虫大脑。大脑定向在一滴培养基 + 纤维蛋白原中， 之后血凝是由血栓的加入引起的。纤维素的形成是渐进的，提供了一个时间窗口，在此期间，样品的方向可以微调，如有必要（图2C）。如果需要稍微压缩样本（我们建议在幼虫大脑中不要压缩样本），也可以在步骤 3.4.4 和 3.5.2 期间按压血块或多或少地靠近样本进行微调。这种纤维蛋白原凝固的主要优点是能够在实时成像过程中取代培养介质。在我们的协议中使用气体透气膜的一个可能优势可能是，它提供了样品的最佳氧化，随着大脑被血块和某种介质从空气中分离出来，这种氧化可能更有限。因此，虽然我们没有评估文化中文化媒介的数量的影响，但我们建议限制血块顶部的文化介质的数量，同时保持血块完全浸入。
由于血块的操纵在实验上可能困难且耗时，我们建议实验者首先练习在没有样品的情况下操纵血块。调节覆盖唇上的培养介质 + 纤维蛋白原的下降量、纤维蛋白原的浓度或血栓的体积和浓度可以帮助使准备更加容易，并且在将协议调整到其他类型的组织时可能很重要。如果有足够的经验操纵血块，如果有必要，几个大脑可以固定在一个血块中，尽管它使方向的微调复杂化。在盖片上可以形成几个血块，例如，允许对不同基因型的样本进行成像。也可以将同一封面上的不同血块暴露给不同的文化媒体，尽管必须注意永远不要将覆盖不同血块的文化媒介的滴滴混合在一起。一旦幼虫大脑固定并准备好进行实时成像，我们建议遵循 Lerit 等人13 的建议，以避免过度的光损伤。我们只添加这些建议，不仅保持大脑在25°C的现场成像与舞台孵化器，而且还预热这个阶段至少30分钟之前，成像开始。在我们手中，如果不能系统地做到这一点，就会导致强烈的焦点漂移。
在某些情况下，能够在实时成像后进行相关显微镜检查、修复和免疫污渍示例是有利的。然而，使用纤维蛋白块的一个限制是，在不损坏大脑的情况下，机械地将大脑从血块中分离出几乎是不可能的。克服这一限制的一个可能的方法可能是开发方法，用普拉斯明降解纤维蛋白血块或通过添加肽模仿旋钮允许纤维蛋白聚合28诱导血块拆解。我们通常使用纤维蛋白凝块的样本范围从单一细胞到200 μM长组织，但我们也可以成功地固定在血块和图像大脑从成年大黄蜂超过3毫米宽。可以在血块中固定的样本量上限仍有待确定。同样，虽然我们通常图像固定样品4至5小时，我们成功地成像神经母细胞在初级培养长达3天，表明血块至少不干扰长期生存能力。相反，血块可以促进定期更换介质，这是长期成像的要求，而无需为此目的使用围网泵等设备。虽然我们尚未测量纤维蛋白块的渗透参数，但血块的纤维凝胶状性质似乎可以通过细胞渗透分子渗透。我们发现，在细胞生物学中使用的拉特伦库林A、科尔塞米德或1-NAPP1、HALO标签配体和其他标准染料到达纤维蛋白块中的细胞时没有任何问题，迄今尚未遇到凝块保留的分子，然而，这种可能性需要经验测试。
总之，使用纤维蛋白块提供了一个可靠和相对容易实现固定活组织活成像的方法。除了在限制横向漂移方面有用外，在活成像过程中改变培养介质的能力对于我们研究D.黑色素加斯特神经母细胞21的不对称细胞分裂的化学遗传学方法也被证明是无价的。我们预计，这项技术将有利于研究广泛的不同组织，特别是如果他们涉及化学遗传学，例如，蛋白质自我标记29。
我们的多倍堆栈宏依赖于涡轮Reg图像J插件，它对齐连续帧或堆栈的切片，以及多堆栈图像J插件，允许将转换应用于其他堆栈。MultiHyperStackReg 只需允许将这些转换应用于超堆栈（至少具有四个维度的堆栈）。由于使用多倍栈注册，正如我们描述的那样，需要大量的操作，并且可以非常耗时，我们还编写了自动HyperStackReg宏，它自动执行步骤 6.2 和 6.3 中描述的所有步骤。然而，与多倍堆栈相反，AutoHyperStackReg 目前缺乏根据该堆栈的子区域计算堆栈对齐的可能性，我们发现，这一选项有时对于令人满意的对齐至关重要。AutoHyperStackReg 的另一个限制是，其使用仅限于翻译，而不是 TurboReg 和 MultiStackReg 提出的其他转换，而 MultiHyperStackReg 可以适用于任何转换类型的超堆栈，如果用户需要它。未来的版本将实现这些功能，并将在GitHub30上提供。最后，我们的旋转线可以宏提供一个简单的方法来快速测量皮质信号的时间流逝，即使皮层改变其位置或方向随着时间的推移。其跟踪模式或非跟踪模式是否最适合分析取决于皮质信号的质量和一致性。跟踪模式更易于使用，因为用户不需要考虑每个时间点的皮层位置，并且可以适应位置和方向随着时间变化的巨大变化。然而，只有皮质信号保持足够强大，以便在整个电影中检测：未能检测皮层以外的任何东西（例如，靠近皮层的明亮的细胞质隔间）可能会危及每个后续时间点的检测（例如，细胞质隔间远离皮层，皮质线可以跟随它度过剩余时间）。非跟踪模式没有此陷阱，因为检测仅限于用户最初绘制的线（例如，明亮的细胞质隔间可能导致检测失败几个时间点，但随着细胞质隔间远离检测区域，皮层的正确检测会恢复），但如果皮层位置或方向随着时间的推移变化很大，则表现不佳。为跟踪模式开发的下一个功能（将在 GitHub30上可用）将仅用于分析指定时间点和定义参考时间点（而不是执行检测之前和之后的第一个时间点），这将允许用户至少避免有问题的时间点。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Januschke 实验室的工作由威康信托赠款 100031/Z/12/A 和 1000032/Z/12/A 支持。组织成像设施由威康的 WT101468 赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
| Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
| FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
| Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |
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