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Developmental Biology

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61954
Automatic Translation
1, 1
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.

Abstract

Drosophila ist ein wichtiges Modellsystem, um eine Breite von biologischen Fragen zu studieren. Verschiedene Organe und Gewebe aus verschiedenen Entwicklungsstadien der Fliege wie imaginäre Scheiben, das Larvenhirn oder Eikammern von erwachsenen Weibchen oder der adulte Darm können extrahiert und in Kultur zur Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden, was wertvolle Einblicke in die Zell- und Entwicklungsbiologie bietet. Hier beschreiben wir detailliert unser aktuelles Protokoll zur Zerlegung von Drosophila Larvenhirnen und stellen dann unseren aktuellen Ansatz zur Immobilisierung und Orientierung von Larvenhirnen und anderen Geweben auf einem Glasdeckel mit Fibrin-Gerinnseln vor. Diese Immobilisierungsmethode erfordert nur die Zugabe von Fibrinogen und Thrombin zum Kulturmedium. Es eignet sich für hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung an invertierten Mikroskopen mehrerer Proben in derselben Kulturschale, minimiert das seitliche Driften, das häufig durch Bewegungen der Mikroskopstufe in der Multipoint-Besuchsmikroskopie verursacht wird, und ermöglicht das Hinzufügen und Entfernen von Reagenzien während der Bildgebung. Wir präsentieren auch maßgeschneiderte Makros, die wir routinemäßig verwenden, um sie beim Driften zu korrigieren und spezifische quantitative Informationen aus der Zeitrafferanalyse zu extrahieren und zu verarbeiten.

Introduction

Drosophila ist nach wie vor ein wichtiges Modellsystem, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu untersuchen und hat sich seit Jahrzehnten in der Weiterentwicklung von Wissen in vielen Disziplinen hervorgetan. Ein Merkmal, das es besonders auszeichnet, ist, dass es besonders gut für Live-Bildgebung geeignet ist. Die Fähigkeit, subzelluläre Prozesse oder das Verhalten von Zellen und Geweben in Echtzeit zu überwachen, trägt weiterhin zur Generierung von Schlüsselkonzepten bei, die für die Zell- und Entwicklungsbiologie relevant sind. Viele erfolgreiche Protokolle wurden von verschiedenen Gruppen entwickelt, um solche Drosophila-Proben lebendig und gesund zu halten, um das Verhalten der Probe und der fluoreszierenden Moleküle zu studieren. Organe und Gewebe aus der Fliege wie imaginäre Scheiben1,2, das Larvenhirn3,4,5,6, oder Eikammern von erwachsenen Weibchen7,8,9, oder der adulte Darm10 zum Beispiel kann extrahiert und in Kultur für die Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden. Eine zentrale Herausforderung für die Live-Bildgebung besteht darin, sicherzustellen, dass die Probe für eine optimale Auflösung und unbeweglich in der Nähe der Bildfläche gehalten wird, ohne die Probenintegrität zu beeinträchtigen, die empfindlich auf mechanische Stöße reagieren kann. Um neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten oder Neuronen im Drosophila Larvenhirn, zu untersuchen, kann beispielsweise die Aufbewahrung von Proben in der Nähe der bildgebenden Oberfläche erreicht werden, indem man sie mit Kulturmedien in versiegelten Bildkammern11,12,13bedeckt. Dieser Ansatz lässt den Medienaustausch jedoch nicht so einfach zu und schränkt so den versuchsfreudigen Handlungsspielraum ein. Alternativ können Proben vorbereitet und auf Abdeckungen platziert werden, die behandelt werden, um die Haftung von Zellen zu erhöhen und Multi-Point-Besuchsmikroskopie und erweiterte Live-Zell-Bildgebung in offenen Kulturgerichten zu ermöglichen, die potenziell einen Medienaustausch ermöglichen, aber keine einfachen Mittel bieten, um Probendrift oder Verlust während des Medienaustauschs zu verhindern14,15.

Die Fibrin-Gerinnselmethode, die ursprünglich entwickelt wurde, um Meiose in lebenden Kranich-Fliegen-Spermatozyten16 zu untersuchen, ist speziell geeignet, um diese Probleme zu überwinden. Fibrinogen wird in einem relevanten Kulturmedium gelöst, die Proben, die in einem Tropfen dieser Lösung auf einer geeigneten Glas-Oberflächen-Bildkammer platziert und ausgerichtet sind, bevor Thrombin hinzugefügt wird, was zur schnellen Bildung eines unlöslichen Fibrin-Gerinnsels führt, eines klebrigen faserigen Netzes, das an der Glasoberfläche und den Proben haftet und gleichzeitig den Zugang der Probe zum Kulturmedium gewährleistet. Das Medium kann dann ausgetauscht werden, ohne die Gerinnsel- oder Probenposition zu stören. Der Austausch von Kulturmedien während der Bildgebung ist beispielsweise wünschenswert, wenn Inhibitoren wie bei der ursprünglichen Methode oder zum Auswaschen oder Pulsjagdexperimenten zugesetzt werden sollen oder wenn fluoreszierende Farbstoffe während der Livezellbildgebung zugesetzt werden sollen, während Zellen und Gewebe an Ort und Stelle gehalten werden. Fibrin-Gerinnsel eignen sich zur Abbildung von Drosophila-Geweben sowie einzelnen Zellen13,17. Fibrin-Gerinnsel können weiter verwendet werden, um Proben zu orientieren, die aufgrund ihrer Form oder anderer Eigenschaften normalerweise nicht in der gewünschten Weise durch Modulation der Probenposition innerhalb des Fibrin-Gerinnsels und der Form des Gerinnsels selbst ausgerichtet würden.

Hier stellen wir ein Update zu unseren aktuellen Fibrin Gerinnsel-basierten Bildgebungsmethoden zur Verfügung und stellen Werkzeuge für die segmentierungsbasierte Bildanalyse zur Verfügung und konzentrieren uns auf den Einsatz dieser Methode zur Untersuchung von Neuroblastenteilungen im sich entwickelnden Fliegenhirn. Wir verwenden routinemäßig die Fibrin Gerinnsel-Methode, um mehrere Proben in verschiedenen Gerinnseln in der gleichen Kulturschale zu folgen. Dies ermöglicht i) Die Bildgebung subzellulärer Ereignisse wie Zentromomverhalten oder mRNA-Lokalisierung live18,19, ii) Überwachung des Verhaltens von Proben bei der pharmakologischen Behandlung verschiedener Genotypen unter den gleichen bildgebenden Einstellungen mit Multipunkt-Besuchsmikroskopie20, iii) Untersuchung der Auswirkungen der akuten Hemmung der Enzyme21 und iv) Minimierung von Driften zur Untersuchung von Veränderungen in der Ausrichtung der Zellteilung von Zellen in ihrer physiologischen Umgebung auf gezielte Laser-Abl2. Während unerwünschte Wirkungen von Thrombin und Fibrinogen und dem Fibrin-Gerinnsel empirisch für jede Probe getestet werden müssen, Diese Methode ist grundsätzlich geeignet, jede Art von Probe zu immobilisieren, die durch Live-Zell-Bildgebung analysiert werden soll und in Drosophila wurde erfolgreich verwendet, um mehrere Aspekte der Neuroblasten Biologie5,19,20, sondern auch die Dynamik der zytosensorischen Projektionen der weiblichen Keimbahn Stammzellen23 und Veränderungen der Polarität bei akuter aPKC Hemmung der Follikelzellen von Drosophila weiblichen Eikammern21zu studieren.

Zeitrafferfluoreszenz-Bildgebung führt zur Generierung komplexer zeitaufgelöster 3D-Datensätze, die Methoden zum Extrahieren dieser quantitativen Informationen erfordern. Hier beschreiben wir unsere Weiterentwicklung von ImageJ-basierten24 Makros, die verwendet werden können, um das Driften in Hyperstacks und maßgeschneiderten ImageJ-Makros zu korrigieren, die eine halbautomatische Quantifizierung der Mehrkanalfluoreszenz am Zellkortex ermöglichen, die zur Quantifizierung kortikaler Proteine in Neuroblasten von Drosophila-Larval-Gehirnen oder von individuellen Strahlneuronen in der primären Zellkultur entwickelt wurde.

Protocol

1. Herstellung von Reagenzien

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll werden, sofern nicht anders erläutert, bei Raumtemperatur ausgeführt.

  1. Um eine Lösung von 1x PBS-BSA (0,1% w/v) vorzubereiten, lösen Sie 1 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 1 ml PBS auf. Um eine Lagerlösung von Thrombin 1.000 Einheiten-1vorzubereiten, lösen Sie 1.000 Einheiten Thrombin in 1 ml PBS-BSA (0,1% w/v) auf. Machen Sie Aliquots von 10 l und lagern Sie bei -20 °C für bis zu 4 Monate.
  2. Um das Kulturmedium für Drosophila Gehirne vorzubereiten, lösen Sie 1 g Glukose in 1 L von Schneiders Medium unter sterilen Bedingungen auf. Filtern und lagern Sie bei 4 °C für bis zu 3 Monate.
  3. Um die Fibrinogen-Lösung vorzubereiten, lösen Sie 10 mg Fibrinogen in 1 ml Kulturmedium für 20 min bei Raumtemperatur oder 5 min bei 37 °C auf.
    HINWEIS: Wenn ein anderes Kulturmedium als das in Schritt 1.2 vorbereitete verwendet wird und sich bei diesem Schritt bereits Fibrin-Gerinnsel bilden, enthält das Kulturmedium wahrscheinlich aktives Thrombin, das vorher inaktiviert werden muss. Eine wahrscheinliche Quelle von Thrombin ist fetales Rinderserum, das durch Erhitzen des Serums auf 56 °C für 30 min inaktiviert werden kann.
  4. Um eine Beschichtungslösung von PBS-BSA (5% w/v) vorzubereiten, 50 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 1 ml 1x PBS aufzulösen.
  5. Für das in Schritt 4 verwendete Beispielreagenz bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM NAPP1 vor, indem Sie 1 mg NAPP1 in 315 L Dimethylsulfoxid auflösen.

2. Dissektion von Drosophila Larvengehirnen

HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unter einem Sezieren Binokular.

  1. Verwenden Sie eine Bürste, um L3-Larven in eine 9-Well Borosilikat-Glasschale mit PBS zu übertragen. Rühren Sie, um den größten Teil der Fliegenfutter von den Larven zu lösen und auf einen anderen Brunnen enthaltenden Kulturmedium zu übertragen.
  2. Verwenden Sie Zangen (z. B. Dumont #55), um eine Larve über ihren gesamten Durchmesser in der Mitte ihrer Körperlänge zu erfassen (siehe Abbildung 1A,B). Übertragen Sie die Larve während des Haltens auf einen anderen Brunnen der Borosilikatplatte, die 200 l frisches Kulturmedium enthält.
  3. Lassen Sie die Larve nicht los. Um die Larve über ihren gesamten Durchmesser zu halbieren(Abbildung 1B), mahlen Sie entweder den gegriffenen Bereich mit seitlicher Bewegung der Zangenspitzen (Abbildung 1A, obere Platte) oder schieben Sie eine Spitze eines anderen Zangenpaares zwischen die beiden Zangenspitzen, die die Larve halten (Abbildung 1A, untere Platte). Schneiden Sie die Larve nicht in die Hälfte, indem Sie an einer ihrer Extremitäten ziehen, da sie das Gehirn schädigen könnte, indem sie über die Nerven, die die Körperlänge kreuzen , an ihr zieht (rote Linien in Abbildung 1B).
  4. Verwenden Sie Zangen, um die Larve durch ihre Nagelhaut und ein weiteres Paar Zange zu halten, um die Nagelhaut auseinander zu schälen, ohne am Gehirn zu ziehen (Abbildung 1C). Wiederholen Sie dies, bis die Nerven des Gehirns sichtbar sind und die Organe, die das Gehirn mit den Mundteilen verbinden, wie in Abbildung 1Ddargestellt.
  5. Verwenden Sie Zangen, um die Nerven aus dem Gehirn zu halten. Verwenden Sie mit dem anderen Zangenpaar eine der in Abbildung 1A gezeigten Techniken, um die Verbindung zwischen dem Gehirn und den Mundpartien zu schneiden und das Gehirn vom Rest der Nagelhaut zu trennen (Abbildung 1D).
  6. Verwenden Sie Zangen, um das Gehirn durch die Axone zu halten, die aus der ventralen Nervenschnur kommen. Zupfen Sie die in Abbildung 1E grau dargestellten Organe, indem Sie sie sanft vom Gehirn wegziehen.
    HINWEIS: Ziehen Sie nicht an den imaginären Scheiben des Auges/der Antenne (dunkelgelb), um sie vom Gehirn zu lösen. Die Verbindung zwischen diesen Geweben ist zu robust, um durch Ziehen gebrochen zu werden, ohne das Gehirn zu beschädigen.
  7. Während Sie noch die Nerven greifen, um das Gehirn zu halten und zu orientieren, erfassen Sie die Verbindung zwischen den imaginären Scheiben des Auges/der Antenne (dunkelgelb) und dem Gehirn mit dem anderen Zangenpaar (Abbildung 1F). Verwenden Sie eine der in Abbildung 1A gezeigten Techniken, um diese Verbindung zu schneiden, ohne am Gehirn zu ziehen. Prüfen Sie, ob das Gehirn angemessen von anderen Geweben (Abbildung 1G) und nicht beschädigt ist (Abbildung 1H). Entsorgen Sie das Gehirn, wenn es Anzeichen von Schäden zeigt.
  8. Pipette die Beschichtungslösung mit einem P20 ein- und aus, um die Pipettenspitze zu beschichten. Pipette das Gehirn mit der beschichteten Spitze zusammen mit 3 l Medium (Abbildung 2A, links) und Pipette es in einem anderen Brunnen enthält 200 l sauberen Kulturmedium.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 2.2–2.8, bis genügend Gehirne seziert werden, und ersetzen Sie gelegentlich das Kulturmedium des Brunnens, in dem die Sezierungen durchgeführt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Zerlegung von D. melanogaster Larvenhirnen. (A) Technik zum Schneiden ohne Ziehen mit Zangen. Die Probe (hellgrün) kann geschnitten werden, indem sie zwischen den Spitzen der Zange (obere Platte) gemahlen wird oder indem eine Spitze eines Zangenpaares an den Spitzen eines Zangenpaares, das die Probe hält (unteres Panel), ausgeführt wird. (B–F) Schritte zur Isolierung des Larvenhirns, ohne es zu beschädigen (siehe Text). Rot: Gehirn. Dunkelgelb: Augen-/Antennenscheiben. Blauer Text: Aktionen, die mit den entsprechenden Zangen ausgeführt werden sollen. (G) Aussehen eines isolierten Gehirns ohne sichtbare Schäden. D ist die dorsale Seite und V ist die ventrale Seite auf der seitlichen Ansicht. (H) Häufige Schäden, die durch übermäßiges Ziehen des Gehirns während der Zerlegung verursacht werden. Oberseite: Ablösung der ventralen Nervenschnur. Untere Platte: Verformung eines Lappens. Poster ior ist links und vorderin ist in allen Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Immobilisierung auf Deckzettel mit Fibrin-Gerinnseln

HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unter einem Sezieren Binokular.

  1. Verwenden Sie eine P20-Pipette mit einer beschichteten Spitze wie in Schritt 2.8, um die sezierten Gehirne in einen anderen Brunnen der Borosilikatplatte zu übertragen, der 200 l Kulturmedium + Fibrinogen enthält (Abbildung 2A).
  2. Pipette in einem Gehirn zusammen mit 9 L Kulturmedium + Fibrinogen. Mit dem Ende der Spitze fast berühren die Abdeckung Glasboden einer 35 mm Zellkulturschale, Pipette aus dem Inhalt (das Kulturmedium und das Gehirn), so dass die Kultur Medium berühren die Abdeckung Slip sofort nach dem Verlassen der Pipettenspitze, so dass das Gehirn und das Medium nicht zu den Seiten der Spitze gleiten, potenziell das Gehirn beschädigen (Abbildung 2A).
  3. Verwenden Sie eine Spitze eines Zangenpaares oder ein geschlossenes Zangenpaar, um das Gehirn sanft innerhalb des Kulturmediums + Fibrinogentropfen zu bewegen und zu positionieren.
    HINWEIS: Das Berühren des Tropfens mit einem offenen Zangenpaar kann dazu führen, dass das Kulturmedium durch kapillare Spitzen zwischen den Zangenspitzen gezogen wird (Abbildung 2B).
  4. Wenn der ventrale Teil des Gehirns abgebildet werden muss, induzieren Fibrinogen Gerinnung wie folgt, um das Gehirn innerhalb des Gerinnsels richtig auszurichten (Abbildung 2C).
    1. Schieben Sie das Gehirn auf eine Seite des Tropfens. Mit einer P1-Pipette, die mit einer P1-Spitze ausgestattet ist, Pipette 1 L Thrombin-Lösung, berühren Sie den Rand des Tropfens auf der gegenüberliegenden Seite des Gehirns mit der Pipettespitze und Pipette aus dem Thrombin (Abbildung 2C, erste Zeichnung).
    2. Warten Sie 1–2 min, bis das Fibrinogen mit der Polymerisation beginnt, was zur Bildung eines trüben Niederschlags an einer Seite des Tropfens führt(Abbildung 2C, zweite Zeichnung). Schieben Und "tucken" Sie das Gehirn vorsichtig in das Fibrin-Gerinnsel, um sicherzustellen, dass das Bildteil (z. B. die ventrale Seite) so nah wie möglich am Coverslip ist, ohne das Gehirn zu verformen(Abbildung 2C, dritte Zeichnung).
    3. Pipette aus 1 L Thrombin-Lösung in der Nähe der Seite des Gehirns nicht in das Fibrin-Gerinnsel versteckt. (Abbildung 2C, vierte Zeichnung).
    4. Warten Sie 2–3 min, bis das zweite Fibrin-Gerinnsel gesetzt ist(Abbildung 2C,fünfte Zeichnung). Drücken Sie auf die Ränder des Gerinnsels, um es stärker am Deckschein haften zu lassen, wobei darauf zu achten ist, das Gehirn nicht zu verformen(Abbildung 2C,sechste und siebte Zeichnungen). Wenn das Gehirn zu weit vom Coverslip entfernt zu sein scheint, bringen Sie es näher, indem Sie das Fibrin-Gerinnsel in der Nähe des Gehirns drücken.
  5. Wenn der dorsale Teil des Gehirns abgebildet werden muss, induzieren Sie die Fibrin-Gerinnung wie folgt (Abbildung 2D).
    1. Positionieren Sie das Gehirn in der Mitte des Tropfens, dorsal Teil mit Blick auf den Coverslip. Mit einer P10 Pipette mit einer dünnen Spitze ausgestattet, Pipette 1 L Thrombin Lösung, berühren Sie die Kante des Tropfens auf der gegenüberliegenden Seite des Gehirns mit der Pipette Spitze, und Pipette aus dem Thrombin(Abbildung 2D, erste Zeichnung).
    2. Warten Sie 2–3 min, bis das Fibrinogen mit der Polymerisation beginnt, was zur Bildung eines trüben, faserigen Niederschlagsfalls führt(Abbildung 2D, zweite Zeichnung). Drücken Sie auf die Ränder des Gerinnsels, um es stärker am Deckblatt haften zu lassen, wobei darauf zu achten ist, das Gehirn nicht zu verformen(Abbildung 2D,dritte und vierte Zeichnungen).
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1–3.5, wenn mehrere Gerinnselproben auf dem Deckelimmobilisiert werden müssen.
  7. Mit dem Ende der Spitze etwa 0,5 cm über dem Gerinnsel(n) positioniert, sanft Pipette 390 l Kulturmedium ohne Fibrinogen tropfenweise auf dem Gerinnsel(n)(Abbildung 2B, rechte Petrischale). Fügen Sie das Kulturmedium nicht an den Seiten des Gerinnsels hinzu, da es es vom Deckschein lösen kann.
  8. Um den restlichen Thrombin auszuwaschen, verwenden Sie eine Pipette, um 300 l des Kulturmediums zu entfernen, und fügen Sie 300 l sauberes Kulturmedium hinzu, um sicherzustellen, dass die Gerinnsel vollständig eingetaucht bleiben. Wiederholen Sie dies zweimal, um überschüssiges Thrombin auszuwaschen.

Figure 2
Abbildung 2: Immobilisierung eines Drosophila Larvenhirns mit Fibrin-Gerinnseln. (A) Mit einer BSA-beschichteten Pipette-Spitze werden Gehirne vom Kulturmedium (gelb) in ein Kulturmedium + Fibrinogen-Lösung (orange) übertragen und dann zusammen mit 3,5 l Kulturmedium + Fibrinogen auf den Deckzettel (hellblau) einer Kulturschale pipettiert. Fibrinogengerintungen werden durch Zugabe von Thrombin induziert, um Gehirne in dorsaler oder ventraler Position zu immobilisieren (siehe D und E). Die gesicherten Gehirne in den Gerinnseln werden anschließend ohne Fibrinogen in Kulturmedium abgedeckt und überschüssiges Thrombin wird durch dreimales Hinzufügen und Entfernen von Kulturmedium entfernt. (B) Die Position des Gehirns innerhalb des Tropfens des Kulturmediums + Fibrinogen (orange) auf dem Coverslip sollte nur durch sanftes Drücken mit der Spitze eines geschlossenen Zangenpaares oder nur einer Zangenspitze eingestellt werden. Das Berühren des Tropfens mit offenen Zangen kann dazu führen, dass das Kulturmedium von der Kapillarität zwischen den Spitzen der Zange gezogen wird. (C) Schritte zur Positionierung des Larvenhirns zur Abbildung der ventralen Seite (siehe Text). (D) Schritte zur Positionierung des Larvenhirns zur Abbildung der Dorsalseite (siehe Text). In (D) und (E), grün: Thrombin. Dunkelorange: Fibrin-Gerinnsel. Blassblau: Coverslip. Blaue Pfeile: Ränder des Gerinnsels, die gegen den Deckelrutsch geschoben werden sollen, um das Gerinnsel zu stabilisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Zugabe von Reagenzien während der Live-Bildgebung

  1. Um Temperaturänderungen zu vermeiden, die zu Fokuswechseln führen, halten Sie die Lösung mit den Reagenzien, die dem Kulturgericht bei der gleichen Temperatur wie das Kulturgericht selbst hinzugefügt werden, um sie auf die gleiche Temperatur zu bringen, bevor Sie sie hinzufügen. Wenn eine Umweltkammer verwendet wird, lassen Sie die Lösung innerhalb der Kammer.
  2. Entfernen Sie den Deckel des Kulturgerichts, ohne das Kulturgericht selbst zu verdrängen. Um die Entfernung zu erleichtern, legen Sie den Deckel der 35 mm Schale vor der Bildgebung auf die Oberseite der Schale.
  3. Mit einer P1000-Pipette positionieren Sie die Pipettenspitze nahe an der Oberfläche des Kulturmediums innerhalb der Kulturschale und lassen Sie das ausreichende Volumen der Reagenzienlösung vorsichtig auf sie ab, um die gewünschte Reagenzienkonzentration zu erreichen (z. B. 400 l einer Lösung von 20 'M NAPP1 auf 400 'L Kulturmedium für eine Endkonzentration von 10 'M NAPP1) , ohne starke Flussmittel zu erzeugen, die die Gerinnsel lösen könnten.
  4. Um die Lösung innerhalb der Kulturschale zu homogenisieren, verwenden Sie eine P200 Pipette, um eine kleine Menge der Lösung fünfmal ein- und auszurohren (z. B. 150 l bei einem Volumen von 800 l innerhalb der Schale).
  5. Ersetzen Sie den Deckel auf der Oberseite des Kulturgerichts, ohne das Kulturgericht selbst zu verdrängen, und nehmen Sie die Bildgebung fort.

5. Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung

  1. Vor dem Auswaschen die Waschlösung bei der gleichen Temperatur wie die Kulturschale aufbewahren.
  2. Entfernen Sie den Deckel des Kulturgerichts, ohne das Kulturgericht selbst zu verdrängen.
  3. Mit einer P200- oder P1000-Pipette langsam ein Kulturmedium aus der Kulturschale entfernen, ohne die Oberseite des Gerinnsels freizusetzen (z. B. 600 l von 800 l Kulturmedium innerhalb der Schale entfernen).
  4. Um das Reagenz mit einer P1000 Pipette zu verdünnen, positionieren Sie die Pipettenspitze nahe an der Oberfläche des Kulturmediums innerhalb der Kulturschale und geben Sie die Waschlösung langsam los (z. B. fügen Sie 1 ml Waschlösung zu dem 200 l L Kulturmedium hinzu, das in der Schale für einen Verdünnungsfaktor von 6 übrig bleibt).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 und 5.4, bis das Reagenz je nach Bedarf verdünnt wird (z. B. führen weitere drei ähnliche Runden zu einem Verdünnungsfaktor von 1296, wodurch die Anfangskonzentration von 10 m NAPP1 auf 7,7 nM reduziert wird).
  6. Ersetzen Sie den Deckel auf der Oberseite des Kulturgerichts, ohne das Kulturgericht selbst zu verdrängen, und nehmen Sie die Bildgebung fort.

6. Korrektur des Xyz-Driftens auf dreidimensionalen und/oder mehrkanaligen Zeitraffern

  1. Vorbereitung
    1. ImageJ24herunterladen und installieren. Laden Sie die Plugins TurboReg25 und MultiStackReg26 herunter und legen Sie sie im Plugin-Ordner von ImageJ ab.
    2. Laden Sie die MultiHyperStackReg (Supplemental Coding File 1) und AutoHyperStackReg ImageJ Makros (Supplemental Coding File 2) herunter. Um ein Makro zu installieren, platzieren Sie entweder die .ijm-Datei im Plugin-Ordner von ImageJ oder fügen Sie den Inhalt der .ijm-Datei zur Datei ImageJ/macros/StartupMacros.txt hinzu.
    3. Öffnen Sie auf ImageJ einen Zeitrafferfilm mit mehreren Slices und/oder mehreren Kanälen (daher als "Hyperstack", Abbildung 3A,4Abezeichnet). Wenn der Zeitraffer nur ein Slice und einen Kanal umfasst, kann die Ausrichtung direkt mit MultiStackReg durchgeführt werden.
  2. Korrektur der Seitendrift mit MultiHyperStackReg
    1. Legen Sie fest, welcher Kanal und/oder segmentteil des Hyperstacks als Referenz für die Ausrichtung verwendet werden soll. Um einen Ein-Kanal-Referenzstapel mit einem Slice zu generieren (daher als "Referenzstapel" bezeichnet), klicken Sie auf Bild | Duplizieren..., aktivieren Sie das Kontrollkästchen Hyperstack duplizieren, geben Sie die entsprechende Kanalnummer in Kanäle (c) ein (z. B. ersetzen Sie 1–2 durch 1) und/oder die entsprechende Kanalnummer in Slices (z): (z. B. ersetzen Sie 1–15 durch 8), und stellen Sie sicher, dass Frames: (t) alle Frames (z. B. 1–50) enthält, bevor Sie auf OK klicken (Abbildung 3B).
    2. Alternativ zu Schritt 6.2.1, wenn eine Projektion mehrerer Slices für den Ein-Kanal-Referenzstapel mit einem Slice bevorzugt wird, klicken Sie auf Bild | Stacks | Z-Projekt..., wählen Sie die ersten und letzten Slices und Die Art der Projektion, stellen Sie sicher, dass Alle Zeitrahmen angekreuzt ist und klicken Sie auf OK. Wenn der Zeitraffer über mehrere Kanäle verfügt, löschen Sie entweder die irrelevanten Kanäle(Bild | Stacks | Slice) aus der resultierenden Projektion löschen oder den gewählten Referenzkanal duplizieren (Bild | Duplikat) (Abbildung 3B).
    3. Optional können Sie den Referenzstapel zuschneiden, um nur ein Teil als Referenz als Referenz zu verwenden, indem Sie das Rechteckwerkzeug in der Symbolleiste auswählen, ein Rechteck über den Interessenbereich verfolgen und auf Bild | Ernte.
    4. Um MultiStackReg zu starten, klicken Sie auf Plugins | Anmeldung | MultiStackReg. Wählen Sie im Popupmenü Stapel 1:den Namen des in den vorherigen Schritten generierten Ein-Kanal-Stacks aus, der mit einem Slice-Stack generiert wurde. Wählen Sie im Popup-Menü Transformation: Übersetzungaus; Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Transformationsdatei speichern, und ignorieren Sie alle anderen Felder.
      HINWEIS: Andere Transformationstypen (siehe25).
    5. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie einen Speicherort und einen Namen aus, um die Ausrichtungsdatei zu speichern, und klicken Sie auf Speichern. Warten Sie im Referenzstapelfenster, bis die Frames nicht mehr automatisch bewegt werden, was darauf hinweist, dass die Registrierung beendet ist (Abbildung 3B).
    6. Überprüfen Sie den Referenzstapel, um festzustellen, ob die Ausrichtung zufriedenstellend ist. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die Schritte 6.2.1–6.2.5 mit einem anderen Referenzsegment, Kanal und/oder Zuschneiden. Schließen Sie den Referenzstapel.
    7. Wählen Sie das Hyperstack-Fenster aus, und führen Sie das MultiHyperStackReg-Makro aus. Wählen Sie die transformationsdatei aus, die in Schritt 6.2.5 erstellt wurde, und klicken Sie auf Öffnen. Warten Sie, bis die Ausrichtung auf jeden Kanal und/oder Slice des Hyperstacks angewendet wird, und an diesem Punkt wird ein neues Fenster mit dem Suffix "_aligned" geöffnet (Abbildung 3C).
  3. Korrektur der Fokusdrift mit MultiHyperStackReg
    1. Klicken Sie auf Bild | Eigenschaften..., kopieren Sie den in Pixelbreite angezeigten Wert. Um den Einkanal-Hyperstack orthogonal mit einem Abstand von einem Pixel neu zu schneiden, klicken Sie auf Bild | Stacks | Reslice [/]..., , fügen Sie den Pixelbreitenwert in das Ausgabeabstand: numerisches Feld ein; Wählen Sie Oben im Start-At:-Popup-Menü, aktivieren Sie Interpolation vermeiden und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Falls der Speicher auf ImageJ freigegeben werden muss, kann der Hyperstack nach dem Reslice geschlossen werden.
    2. Wählen Sie das neue Fenster aus, das vom Reslice generiert wird (daher als "resliced hyperstack", Abbildung 4Bbezeichnet). Wenn der neu geschnittene Hyperstack über mehrere Kanäle verfügt, wählen Sie einen Referenzkanal aus, um die Ausrichtung durchzuführen, und löschen Sie die anderen Kanäle, indem Sie sie in der Kanalbildlaufleiste auswählen. klicken Sie auf Bild | Stacks | Slice löschen, wählen Sie Kanal im Popup-Menü Löschen aus und klicken Sie auf OK.
    3. Generieren Sie einen resliced hyperstack mit einem Sliced (daher als "resliced reference stack" bezeichnet), entweder durch Duplizieren eines einzelnen Segments des resliced hyperstack (siehe Schritt 6.2.1) oder durch Projektion mehrerer Slices des resliced hyperstack (siehe Schritt 6.2.2) (Abbildung 4C).
    4. Optional können Sie den neu geschnittenen Verweisstapel zuschneiden, um nur ein Teil als Bild als Referenz zu verwenden (siehe Schritt 6.2.3).
    5. Führen Sie die Bildregistrierung auf dem neu geschnittenen Referenzstapel mit MutiStackReg durch (siehe Schritte 6.2.4–6.2.6) (Abbildung 4C).
    6. Wählen Sie das neu geschnittene Hyperstack-Fenster aus, und führen Sie das MultiHyperStackReg-Makro aus. Wählen Sie die Transformationsdatei aus, die in Schritt 6.3.5 erstellt wurde, klicken Sie auf Öffnen und warten Sie, bis die Ausrichtung auf jeden Kanal und/oder Segment des Hyperstacks angewendet wird, an dem sich ein neues Fenster mit dem Suffix "_aligned" öffnet (daher als "resliced reference stack", Abbildung 4Dbezeichnet). Schließen Sie den ursprünglichen resliced Hyperstack.
    7. Um den neu geschnittenen ausgerichteten Hyperstack in die xy-Ansicht des ursprünglichen Hyperstacks zu konvertieren, klicken Sie auf Stapel | Reslice [/]..., wählen Sie oben im Start-Up-Menü: Popup-Menü, kreuzen Interpolation vermeiden und klicken Sie auf OK. Sobald ein neues Fenster mit dem endgültigen fokusausgerichteten Hyperstack geöffnet wird (Abbildung 4E), schließen Sie den neu geschnittenen ausgerichteten Hyperstack.
  4. Um die seitliche Drift- und Fokusdrift automatisch zu korrigieren, führen Sie das AutoHyperStackReg-Makro aus. Wählen Sie ggf. den Referenzkanal aus, und ob die Seiten- und/oder Fokusdrift korrigiert werden soll. Klicken Sie auf OK.

Figure 3
Abbildung 3: Pipeline zur Korrektur der Seitendrift mit MultiHyperstackReg. (A) Lateral- und Fokusdrifts können auf einem Hyperstack beobachtet werden, der mehrere Slices und Zeitpunkte enthält. (B) Ein einzelner Slice-, Single-Channel-Referenzstapel wird aus dem Hyperstack generiert, entweder durch Duplizierung oder Z-Projektion. Der Referenzstapel wird durch das MultiStackReg-Plugin ausgerichtet, wodurch eine Ausrichtungsdatei generiert wird. (C) Das MultiHyperstackReg-Makro wird verwendet, um die Ausrichtungsdatei auf den Hyperstack anzuwenden, was zu einem ausgerichteten Hyperstack führt, für den die seitliche Drift korrigiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Pipeline zur Korrektur der Fokusdrift mit MultiHyperstackReg. (A) Fokusdrifts können auf einem Hyperstack beobachtet werden, der mehrere Slices und Zeitpunkte enthält. (B) Der Hyperstack wird orthogonal von oben, entlang jeder Pixellinie entlang der Y-Achse, ohne Interpolation neu geschnitten. Dies führt zu einem resliced Hyperstack, der die gleichen Informationen wie der Hyperstack enthält, wobei seine y- und z-Koordinaten geschaltet werden. Die Fokusdrift (in z) des ursprünglichen Hyperstacks tritt als Drift in y auf dem resliced Hyperstack auf. (C) Ein einzelnes Slice, ein kanalisierter Referenzstapel wird aus dem resliced Hyperstack generiert, entweder durch Duplizierung oder Z-Projektion. Der resliced Reference Stack wird durch das MultiStackReg-Plugin ausgerichtet und generiert eine Ausrichtungsdatei. (D) Das MultiHyperstackReg-Makro wird verwendet, um die Ausrichtungsdatei auf den neu geschnittenen Hyperstack anzuwenden, was zu einem ausgerichteten resliced Hyperstack führt, für den die Fokusdrift (in y) korrigiert wird. (E) Ein zweites orthogonales Reslice stellt die ursprünglichen Koordinaten des Hyperstacks wieder her, der nun keine Fokusdrift mehr aufweist (in z). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Kortikale Signalmessung mit rotierenden Linecans

  1. Laden Sie das Rotating Linescans ImageJ-Makro (Supplemental Coding File 3) herunter.
  2. Öffnen Sie einen Zeitraffer in ImageJ. Positionieren Sie die Frame-Scrollbar zum ersten Frame, und positionieren Sie die Scrollleiste der Slices auf das Segment, auf dem das Signal gemessen wird, falls der Zeitraffer mehrere Slices enthält.
  3. Tracking-Modus
    1. Wählen Sie das gerade Werkzeug in der Symbolleiste aus. Verfolgen Sie eine Linie über die zu messende kortikale Zone(Abbildung 5A), stellen Sie sicher, dass die Linie ungefähr senkrecht zum Kortex ist und dass die Linie lang genug ist, um den Kortex bei jedem nächsten Zeitpunkt zu überqueren (Abbildung 5B, erstes und zweites Panel).
    2. Doppelklicken Sie auf das Liniensymbol in der Symbolleiste, um das Fenster Linienbreite zu öffnen. Erhöhen Sie die Breite der Linie so viel wie nötig, während Der Schnittpunkt zwischen der Linie und dem Kortex eine gerade Linie bleibt (Abbildung 5B, drittes Panel).
    3. Starten Sie das Makro Rotating Linescans. Legen Sie den Rotationsbereich (Abbildung 5E) auf einen niedrigen Wert (ca. 10°) fest, wenn sich die Ausrichtung der zu messenden kortikalen Zone von einem Zeitpunkt zum nächsten nicht wesentlich ändert. Legen Sie den Wert "Ummessen" auf 0 Pixel fest, um nur das Signal auf der Leitung zu messen, in der die maximale Signalintensität erkannt wird, oder auf höhere Werte, um auch das Signal um diese Linie zu messen.
      HINWEIS: Der Wert "Ummessen" wirkt sich nur auf die Signalmessung nach der Erkennung des Kortex aus und wirkt sich nicht auf die Erkennung selbst aus.
    4. Wählen Sie im Popup-Menü Cortex auf Kanal suchen den Kanal aus, auf dem die Erkennung durchgeführt wird. Um zu visualisieren, wo der Kortex zu jedem Zeitpunkt erkannt wurde, halten Sie das Kontrollkästchen Anzeigeposition... aktiviert (empfohlen). Halten Sie das Kontrollkästchen Recenter und Neuausrichtung... aktiviert. Klicken Sie auf OK.
    5. Sobald der Status Fertig, Ergebnisse in die Zwischenablage kopiert wird, wird im ImageJ-Fensterstatus ein Bildlauf durch den Zeitraffer angezeigt, um zu überprüfen, ob die erkannten Kortexpositionen (gelbes Überlagerungs- und die gemessene Fläche ( Cyan-Overlay) zufriedenstellend sind. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die Schritte 7.3.1–7.3.4 mit einer anderen Linienposition, -länge oder -breite und unterschiedlichen Einstellungen im Optionsfenster "Drehlinien" (Drehen dein Linienkanister).
    6. Fügen Sie die Messungen in eine Tabellenkalkulationssoftware ein.
      HINWEIS: Spalten entsprechen Kanälen in der Reihenfolge ihres Aussehens im Zeitraffer und Linien entsprechen Frames.
  4. Nicht-Tracking-Modus
    1. Wählen Sie das gerade Werkzeug in der Symbolleiste aus. Verfolgen Sie eine Linie (in Cyan, Abbildung 5A) über die zu messende kortikale Zone, um sicherzustellen, dass die Linie ungefähr senkrecht zum Kortex ist und dass die Linie lang genug ist, um den Kortex zu jedem Zeitpunkt zu überqueren (Abbildung 5C, erstes und zweites Panel).
    2. Doppelklicken Sie auf das Liniensymbol in der Symbolleiste, um das Fenster Linienbreite zu öffnen. Erhöhen Sie die Breite der Linie so viel wie nötig, während Der Schnittpunkt zwischen der Linie und dem Kortex eine gerade Linie bleibt (Abbildung 5C, drittes Panel).
    3. Starten Sie das Makro Rotating Linescans. Stellen Sie den Rotationsbereich (Abbildung 5E) entsprechend den Änderungen der Ausrichtung der kortikalen Zone fest, die während des gesamten Zeitraffers gemessen werden soll. Legen Sie den Wert "Ummessen" auf 0 Pixel fest, um nur das Signal auf der Leitung zu messen, in der die maximale Signalintensität erkannt wird, oder auf höhere Werte, um auch das Signal um diese Linie zu messen.
      HINWEIS: Der Wert "Ummessen" wirkt sich nur auf die Signalmessung nach der Erkennung des Kortex aus und wirkt sich nicht auf die Erkennung selbst aus.
    4. Wählen Sie im Popup-Menü Cortex auf Kanal suchen den Kanal aus, auf dem die Erkennung durchgeführt wird. Um zu visualisieren, wo der Kortex zu jedem Zeitpunkt erkannt wurde, halten Sie das Kontrollkästchen Anzeigepositionen... aktiviert (empfohlen). Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Recenter und Reorient... . Klicken Sie auf OK.
  5. Sobald die Ergebnisse, die in die Zwischenablage kopiert wurden, im ImageJ-Fensterstatus angezeigt werden, scrollen Sie durch den Zeitraffer, um zu überprüfen, ob die erkannten Kortexpositionen (gelbes Überlager) und die gemessene Fläche (Cyan-Overlay) zufriedenstellend sind. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die vorherigen Schritte mit einer anderen Linienposition, -länge oder -breite und anderen Einstellungen im Optionsfenster "Drehlinien".
  6. Fügen Sie die Messungen in eine Tabellenkalkulationssoftware ein.
    HINWEIS: Spalten entsprechen Kanälen in der Reihenfolge ihres Aussehens im Zeitraffer und Linien entsprechen Frames.

Figure 5
Abbildung 5: Messung des kortikalen Signals mit rotierenden Linienkann. (A) Eine Linie (Cyan) wird senkrecht zum Kortex (schwarz) zurückverfolgt, wo das Signal gemessen wird. Verschiedene Graustufen zeigen, dass sich die Zellenposition über drei Zeitpunkte (t1, t2, t3) ändert. (B) Links: korrekte Positionierung der Linie im Tracking-Modus. Mitte: falsche Positionierung der Linie im Tracking-Modus, da es beim nächsten Zeitpunkt keine Überlappung mit dem Kortex gibt. Rechts: zu breite Linie, die dazu führt, dass der Schnittpunkt (orange Linie) zwischen dem Kortex und der Linie nicht gerade ist. (C) Links: korrekte Positionierung der Linie im Nicht-Tracking-Modus. Mitte: falsche Positionierung der Linie im Nicht-Tracking-Modus, da es zu jedem Zeitpunkt keine Überlappung mit dem Kortex gibt. Rechts: zu breite Linie, die dazu führt, dass der Schnittpunkt (orange Linie) zwischen dem Kortex und der Linie nicht gerade ist. (D) Länge und Breite der Scanlinie. (E) Linescans werden innerhalb eines Ausrichtungsbereichs um die ursprüngliche Ausrichtung in (D) ausgeführt, die durch den Parameter "Rotationsbereich" definiert ist, in einem Intervall, das durch den Parameter "Rotationsschritt" definiert ist. (F) Nicht optimale Ausrichtung der Scanlinie relativ zum Kortex, was zu einem niedrigen Signal führt, das entlang der Linie gemessen wird. (G) Die optimale Ausrichtung der Linie ist definiert als diejenige, die zu dem höchsten Spitzen der Signalintensität führt, der entlang der Linie gemessen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Representative Results

Immobilisierung von Drosophila Gewebe mit Fibrin Gerinnseln und Kultur Medium Austausch während der Live-Bildgebung.
Nach der Zerlegung nach dem in Schritt 2 (Abbildung 1) vorgestellten Verfahren und immobilisierten Fibrin-Gerinnsel auf demselben Deckzettel nach dem in Schritt 3 (Abbildung 2) vorgestellten Verfahren wurden Larvenhirne, die GFP-markierte Bazooka (Baz::GFP) exdrücken, der Fliegenortholog des Polaritätsproteins Par-3 3 30 min in zeitrafferiger multilinker konfokaler Bildgebung abgebildet. Baz::GFP wird mit apkcas4kombiniert, einem Allel, das eine akute Hemmung der atypischen Proteinkinase C (aPKC) durch Zugabe des kleinen ATP-Analogs 1-NAPP120ermöglicht. 1-NAPP1 wurde daher nach dem in Schritt 4 vorgestellten Verfahren dem Kulturmedium hinzugefügt und die Live-Bildgebung für 2,5 h wieder aufgenommen. Kontrollgehirne, die eine wilde Version der Kinase aPKC trugen, reagierten nicht auf das ATP-Analog, während Gehirne, die zusätzlich eine analog-empfindliche Mutation von aPKC (apkcas4) trugen, eine Kontraktion des Neuroepithels und helle Cluster von Baz in Neuroblasten und deren Nachkommen zeigten ( Abbildung6, Video 1). Neuroblasten teilen sich während des Zeitraffers weiter, was darauf hindeutet, dass das Gewebe gesund bleibt, und das Gehirn zeigt trotz des Kulturmediumwechsels wenig Drift, was darauf hindeutet, dass sie gut immobilisiert sind. In ähnlicher Weise wurden nach der Seziertheit nach dem in27vorgestellten Verfahren Ovariole, die Baz::GFP ausdrückend in Fibrin-Gerinnseln auf demselben Deckzettel immobilisiert und für 8 min abgebildet wurden, woraufdurch die Anwendung von 1-NAPP1 die Kontraktion von apkcas4 mutierten Follikelzellen, aber nicht von Kontrollen induzierte (Abbildung 7, Video 2).

Korrektur der Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperstackReg.
Ein Hyperstack, der sowohl die Seiten- als auch die Fokusdrift(Video 3, linkes Panel) anzeigt, wurde zuerst für die seitliche Drift korrigiert (Schritt 6.2, Abbildung 3, MittleresPanel), dann Fokusdrift (Schritt 6.3, Abbildung 4, Video 3, rechtes Panel) mit dem MultiStackReg-Plugin und dem MultiHyperstackReg-Makro, was zu einer erheblichen Reduzierung der im ursprünglichen Hyperstack beobachteten Bewegungen führt.

Kortikale Signalmessung mit rotierenden Linecans
Ein Neuroblast, der Baz ausdrückt::GFP (grün) und das Transmembranprotein CD4, das mit einem Infrarotfluoreszenzprotein (CD4::mIFP, rot) markiert ist, wurde während einer Mitose abgebildet. Das CD4::mIFP-Signal wurde als Referenz verwendet, um den Kortex an verschiedenen Teilen des Neuroblasts mit Linescans zu erkennen (Schritt 7, Abbildung 5, Abbildung 8A–C) und das Baz::GFP-Signal wurde an den erkannten Positionen gemessen Abbildung 8D). Während ihrer Teilung polarisierten Neuroblasten vorübergehend, indem sie unterschiedliche und entgegengesetzte kortikale Domänen aufstellen: den apikalen Pol und den Basalpol. Baz definiert den apikalen Pol und konsequent das Baz::GFP-Signal am apikalen Pol des Neuroblasten und verringerte sich während der Teilung am Basalpol (Abbildung 8C,D). Die Position des Kortex wurde während des gesamten Zeitraffers zufriedenstellend nachverfolgt (Abbildung 8C, Video 4). Die Drosophila-Linien und Genotypen werden in der Zusatztabelle 1–2referenziert.

Figure 6
Abbildung 6: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung. (A) Live-Bildgebung von zwei Larvengehirnen, die Baz exexzessiver exallert::GFP auf demselben Deckzettel immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrollgehirne reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Gehirne, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Neuroepithels (Pfeilspitzen) und helle Ballhaufen von Baz in Neuroblasten und ihrer Nachkommen zeigen. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 23 m. Skalenbalken: 20 M. (B) Vergrößerung des Neuroepithels. Maßstabsleiste: 10 M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung. Live-Bildgebung von zwei Ovariolen, die Baz exzessiieren::GFP auf dem gleichen Deckschein immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrolleierkammern reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Eikammern, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Epithels (Pfeilspitzen) zeigen, was schließlich zum scheinbaren Abbau von Haftknotenführt führt. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 27 m. Maßstabsleiste: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Messung des kortikalen Signals mit rotierenden Linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast expressing Baz::GFP (grün) und CD4::mIFP (rot). Cyan-Linien: anfängliche Scanlinien, die senkrecht zu verschiedenen kortikalen Zonen verfolgt werden, um sie zu messen. Maßstabsleiste: 5 m. (B) Identifikation des Kortex (dunkelblaue Linie) mit kortikalen Linien und CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Cyan-Linie: Fläche, die durch den Parameter "Ummessen" definiert wird (hier 2 Pixel), wobei das Signal nach der Kortexerkennung gemessen wird. Skala bar: 2 m. (C) Cyan: kortikale Bereiche, die während einer Neuroblastenteilung durch die rotierende Linecans-Methode aus den anfänglichen Scanlinien identifiziert werden, die in (A) angezeigt werden, mit CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Maßstabsleiste: 5 m. Pfeil: apikaler Pol. Pfeilspitze: Basalpol. (D) Messung der Baz::GFP-Signalintensität im Zeitverlauf in den beiden entsprechenden Zonen, die durch rotierende Linien in (C )identifiziert werden. Während der Mitose, Baz::GFP wird vorübergehend an der apikalen Pol des Neuroblasten angereichert und wird vom gegenüberliegenden Basalpol erschöpft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 6,Maßstabsleiste: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 7,Maßstabsleiste: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: Korrektur von Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperStackReg. Live-Bildgebung eines Neuroblasten, der die Membransonde PH::GFP exzessither ausdrückt. Xy: einzelne Fokusebene. Xz: orthogonales Reslice. Links: vor Korrektur der Drift. Mitte: nach Korrektur der seitenseitigen Drift. Rechts: nach Korrektur die Seiten- und Fokusdrift, Skalenleiste: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 4: Erkennung des Kortex mit rotierenden Linien, dargestellt in Abbildung 8, Maßstabsleiste: 5 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Genotypen von abgebildeten Drosophila Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Ursprung der verwendeten Transgene. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Ursprung der verwendeten Transgene. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 2: Ursprung der verwendeten Transgene. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 3: Ursprung der verwendeten Transgene. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Live-Bildgebung der gesamten Mount D. melanogaster Larvengehirne bietet die Möglichkeit, asymmetrische neuronale Stammzellteilungen in Bedingungen in der Nähe eines physiologischen Kontextes zu beobachten. Der erste Teil unseres Protokolls stellt unseren Ansatz zur Zerlegung von Larvenhirnen vor. Wie bereits erwähnt13, ist ein kritischer Aspekt der Vorbereitung zu vermeiden, das Gehirn zu beschädigen. Die schwierigste Aspekt dieser ist es, das Gehirn von den benachbarten imaginären Scheiben zu trennen, ohne übermäßig auf das Gehirn zu ziehen. Unser Ansatz zum "Schneiden ohne Ziehen" besteht darin, entweder eine Schleifbewegung mit den Spitzen eines Zangenpaares durchzuführen oder eine Zangenspitzen entlang zweier anderer Zangenspitzen zu schieben, die die Verbindung zwischen Geweben halten (Abbildung 1A), während Lerit et al. sägeartige Bewegungen mit einem Trennstift beschreiben. Wir raten dem Experimentator, alle Ansätze auszuprobieren und die am besten geeigneten für sich zu übernehmen. Wir empfehlen auch, BSA- oder FCS-beschichtete Pipettenspitzen anstelle von Sezierwerkzeugen zu verwenden, um isolierte Gehirne zu übertragen. Die Beschichtung verhindert, dass Gewebe am Kunststoff kleben und ermöglicht den sicheren Transfer von Geweben, während sie immer vollständig eingetaucht werden, ohne sie einer möglichen vorübergehenden Verformung zu unterwerfen, da sie während des Transfers am Sezierwerkzeug kleben. Beschichtete Spitzen haben andere Vorteile, um die Übertragung mehrerer Gehirne auf einmal zu ermöglichen, was besonders nützlich ist, wenn es wichtig ist, die Aufenthaltszeit der Proben innerhalb eines bestimmten Mediums zu kontrollieren; sie eignen sich für den Transfer anderer Gewebe, auch zerbrechlicher Gewebe wie z. B. Fettkörper; Sie können eine breite Palette von verschiedenen Probengrößen aufnehmen, indem sie größere Spitzen verwenden oder die Extremität der Spitze schneiden.

Als nächstes beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Fibrinogen-Gerinnung, um Larvengehirne auf dem Deckblatt einer Kulturschale zu immobilisieren. Ein Gehirn ist innerhalb eines Tropfens von Kulturmedium + Fibrinogen ausgerichtet, nach dem die Gerinnung durch die Zugabe von Thrombin induziert wird. Die Fibrin-Bildung erfolgt schrittweise und bietet ein Zeitfenster, in dem die Ausrichtung der Probe gegebenenfalls verfeinert werden kann(Abbildung 2C). Wenn eine leichte Kompression der Probe erforderlich ist - wovon wir bei Larvenhirnen raten -, kann sie auch fein eingestellt werden, indem das Gerinnsel in den Schritten 3.4.4 und 3.5.2 mehr oder weniger nahe an der Probe gedrückt wird. Der Hauptvorteil dieser Fibrinogen-Gerinnung gegenüber dem in Lerit et al. beschriebenen Protokoll, in dem Gehirne zwischen einer gasdurchlässigen Membran und einem Abdeckrutsch montiert sind, ist die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu ersetzen. Ein möglicher Vorteil der Verwendung einer gasdurchlässigen Membran gegenüber unserem Protokoll könnte sein, dass sie eine optimale Sauerstoffversorgung der Proben bietet, die mit unserem Ansatz eingeschränkter sein könnte, da Gehirne durch das Gerinnsel und ein Medium von der Luft getrennt werden. Aus diesem Grund, obwohl wir nicht die Wirkung der Menge der Kulturmedium innerhalb der Kultur Gericht bewertet, schlagen wir vor, die Menge der Kultur Medium auf den Gerinnseln zu begrenzen, während die Gerinnsel vollständig eingetaucht.

Da die Manipulation der Gerinnsel experimentell schwierig und zeitaufwändig sein kann, empfehlen wir dem Experimentator, zunächst Gerinnsel ohne Proben zu manipulieren. Die Modulation des Volumens des Tropfens kulturmittel + Fibrinogen auf dem Deckel, die Konzentration von Fibrinogen oder das Volumen und die Konzentration von Thrombin könnte dazu beitragen, die Vorbereitung zu erleichtern und könnte wichtig sein, wenn das Protokoll an andere Arten von Geweben angepasst werden. Mit genügend Erfahrung bei der Manipulation der Gerinnsel können bei Bedarf mehrere Gehirne in einem Gerinnsel immobilisiert werden, obwohl dies die Feinabstimmung der Ausrichtung erschwert. Auf dem Deckblatt können mehrere Gerinnsel gebildet werden, so dass z.B. Proben verschiedener Genotypen abbilden können. Es ist auch möglich, verschiedene Gerinnsel auf dem gleichen Coverslip verschiedenen Kulturmedien auszusetzen, obwohl darauf geachtet werden muss, niemals die Tropfen des Kulturmediums zu mischen, das die verschiedenen Gerinnsel bedeckt. Sobald Larvengehirne immobilisiert sind und bereit für Live-Bildgebung, empfehlen wir, die Empfehlungen von Lerit et al.13 zu folgen, um übermäßige Photoschäden zu vermeiden. Wir fügen diesen Empfehlungen nur hinzu, um das Gehirn nicht nur bei 25 °C während der Live-Bildgebung mit einem Bühneninkubator zu halten, sondern auch, um dieses Stadium mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung vorzuheizen. Wenn wir dies nicht systematisch tun, führt dies zu einer starken Fokusdrift.

Es kann in einigen Kontexten vorteilhaft sein, korrelierte Mikroskopie durchzuführen und eine Probe nach Live-Bildgebung zu fixieren und zu immunstainieren. Eine Einschränkung der Verwendung von Fibrin-Gerinnseln ist jedoch, dass es fast unmöglich ist, ein Gehirn mechanisch von einem Gerinnsel zu isolieren, ohne es zu beschädigen. Ein möglicher Weg, diese Einschränkung zu überwinden, könnte darin bestehen, Methoden zu entwickeln, um Fibrin-Gerinnsel mit Plasmin zu abbauen oder die Gerinnseldemontage durch Zugabe eines Peptids zu induzieren, das die Knöpfe imitiert, was die Fibrin-Polymerisationermöglicht 28. Wir verwenden in der Regel Fibrin-Gerinnsel auf Proben von Einzelzellen bis zu 200 M langen Geweben, aber wir könnten auch erfolgreich in Gerinnseln und Bildgehirnen von erwachsenen Hummeln über 3 mm Breit immobilisieren. Die Obergrenze des Stichprobenumfangs, der in Gerinnsel immobilisiert werden kann, muss noch ermittelt werden. In ähnlicher Weise, obwohl wir in der Regel immobilisierte Proben für 4 bis 5 h abbilden, haben wir neuroblasten in der Primärkultur für bis zu 3 Tage erfolgreich ababgebildet, was darauf hindeutet, dass das Gerinnsel zumindest die längerfristige Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Im Gegenteil, Gerinnsel können den regelmäßigen Austausch des Mediums erleichtern, eine Voraussetzung für eine längerfristige Bildgebung, ohne dass geräte wie peristaltische Pumpen für diesen Zweck benötigt werden. Während wir die Permeabilitätsparameter von Fibringer nicht gemessen haben, scheint die faserige gelartige Natur der Gerinnsel durch zelldurchlässige Moleküle durchdrungen zu sein. Wir fanden heraus, dass Latrunculin A, Colcemid oder 1-NAPP1, HALO-Tag Liganden und andere Standardfarbstoffe, die in der Zellbiologie verwendet werden, die Zellen im Fibringer problemlos erreichen und bisher keine Moleküle gefunden haben, die durch das Gerinnsel zurückgehalten würden, was jedoch eine Möglichkeit ist, die empirisch getestet werden muss.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von Fibrin-Gerinnseln eine zuverlässige und relativ einfache Implementierung einer Möglichkeit bietet, lebende Gewebe für die Live-Bildgebung zu immobilisieren. Über seine Nützlichkeit bei der Begrenzung des seitlichen Driftens hinaus hat sich die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu verändern, als von unschätzbarem Wert für unseren ansatzbereiten Ansatz der chemischen Genetik erwiesen, die asymmetrische Zellteilung von D. melanogaster Neuroblasten zu untersuchen21. Wir gehen davon aus, dass diese Technik für Studien in einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe von Vorteil sein wird, insbesondere wenn sie chemische Genetik oder beispielsweise die Protein-Selbstkennzeichnung29beinhalten.

Unser MultiHyperStackReg-Makro basiert auf dem TurboReg ImageJ-Plugin, das aufeinander folgende Frames oder Slices eines Stacks ausrichtet, und dem MultiStackReg ImageJ-Plugin, das es ermöglicht, die Transformationen auf andere Stacks anzuwenden. MultiHyperStackReg ermöglicht es einfach, diese Transformationen auf Hyperstacks anzuwenden (Stapel mit mindestens vier Dimensionen). Da die Verwendung von MultiHyperStackReg, wie wir es beschreiben, viele Aktionen erfordert und ziemlich zeitaufwändig werden kann, haben wir auch das AutoHyperStackReg-Makro geschrieben, das automatisch alle in den Schritten 6.2 und 6.3 beschriebenen Schritte ausführt. Im Gegensatz zu MultiHyperStackReg fehlt AutoHyperStackReg derzeit jedoch die Möglichkeit, die Ausrichtung eines Stacks basierend auf einer Subregion dieses Stacks zu berechnen, eine Option, die wir gefunden haben, ist manchmal entscheidend für eine befriedigende Ausrichtung. Eine weitere Einschränkung von AutoHyperStackReg besteht darin, dass seine Verwendung auf Übersetzungen beschränkt ist und nicht auf die anderen Transformationen, die von TurboReg und MultiStackReg vorgeschlagen werden, während MultiHyperStackReg auf einen Hyperstack jeden Transformationstyp anwenden kann, wenn der Benutzer ihn benötigt. Zukünftige Versionen werden diese Funktionen implementieren und auf GitHub30verfügbar sein. Schließlich bietet unser rotierendes Linecan-Makro eine einfache Möglichkeit, kortikale Signale im Zeitraffer schnell zu messen, auch wenn der Kortex seine Position oder Ausrichtung im Laufe der Zeit ändert. Ob der Tracking-Modus oder der Nicht-Tracking-Modus für die Analyse am besten geeignet ist, hängt von der Qualität und Konsistenz des kortikalen Signals ab. Der Tracking-Modus ist einfacher zu verwenden, da der Benutzer nicht berücksichtigen muss, wo sich der Kortex für jeden Zeitpunkt befindet und große Positions- und Orientierungsänderungen im Laufe der Zeit aufnehmen kann. Es ist jedoch nur dann geeignet, wenn das kortikale Signal während des gesamten Films stark genug bleibt, um es zu detektieren: Ein Versäumnis, etwas anderes als den Kortex zu erkennen (z. B. ein helles zytoplasmatisches Fach in der Nähe des Kortex), kann die Detektion für jeden folgenden Zeitpunkt beeinträchtigen (z. B. bewegt sich das zytoplasmatische Fach vom Kortex weg und die kortikalen Linien können ihm für den Rest des Zeitraffers folgen). Der Nicht-Tracking-Modus hat diese Falle nicht, da die Erkennung auf die ursprünglich vom Benutzer gezeichnete Linie beschränkt ist (z. B. kann ein helles zytoplasmatisches Fach dazu führen, dass die Erkennung für einige Zeitpunkte fehlschlägt, aber da sich das zytoplasmatische Fach von der Detektionszone entfernt, wird die korrekte Erkennung des Kortex fortgesetzt), verhält sich aber nicht gut, wenn sich die Kortexposition oder -ausrichtung im Laufe der Zeit stark ändert. Das nächste Feature (das auf GitHub30verfügbar sein wird), das für den Tracking-Modus entwickelt werden soll, ist die Option, nur bestimmte Zeitpunkte zu analysieren und einen Referenzzeitpunkt (anstelle des ersten Zeitpunkts) zu definieren, vor dem und nach dem die Erkennung durchgeführt wird, wodurch der Benutzer zumindest problematische Zeitpunkte vermeiden kann.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Arbeit im Januschke-Labor wird von Wellcome Trust Grants 100031/Z/12/A und 1000032/Z/12/A unterstützt. Die Gewebebildgebungseinrichtung wird durch das Stipendium WT101468 von Wellcome unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin bovine serum, BSA Merck 5470
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture Sigma F7524
Fibrinogen from human plasma Sigma F3879
FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well World Precision Instruments FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1) Merck Millipore 529579
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium Sigma S0146
Thrombin from bovine plasma Merck T4648

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 166 Live Imaging Fibrin gerinnsel Drosophila Kulturmedium Austausch ImageJ Makro
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Januschke, J., Loyer, N. Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61954, doi:10.3791/61954 (2020).

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